A lateral flow strip based on gold nanoparticles to detect 6-monoacetylmorphine in oral fluid

Wprowadzenie

Nadużywanie opioidów wzrosło dramatycznie w ostatnich latach i jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności. Według Światowego Raportu o Narkotykach 2017 opublikowanego przez Biuro Narodów Zjednoczonych ds. Narkotyków i Przestępczości, stosowanie opiatów i opioidów na receptę może nie być tak powszechne jak marihuana, ale opioidy pozostają głównymi narkotykami o potencjalnych szkodach i konsekwencjach zdrowotnych . Dlatego łatwe i szybkie wykrywanie opioidów jest pilną potrzebą.

Nielegalne nadużywanie heroiny jest jedną z najczęstszych form uzależnienia od opioidów. Heroina (diacetylomorfina, diamorfina lub Diagesil®) jest półsyntetyczną pochodną morfiny i silnym opioidowym środkiem przeciwbólowym. Metabolizm heroiny przedstawiono na rycinie 1. Heroina szybko hydrolizuje do 6-monoacetylomorfiny (6-MAM) i ostatecznie do morfiny. Ponieważ heroina hydrolizuje szybko po podaniu, jej metabolity są zwykle wykorzystywane do potwierdzenia użycia. Ponadto, 6-MAM jest jedynym specyficznym wskaźnikiem niedawnego nadużywania heroiny w porównaniu z morfiną, co wzbudziło duże zainteresowanie społeczności badawczej.

Opisano wiele metod wykrywania 6-MAM, które można podzielić na następujące kategorie: (1) analiza chromatograficzna, w tym chromatografia gazowa i wysokosprawna chromatografia cieczowa ; (2) analiza spektroskopowa, taka jak spektroskopia Ramena, spektroskopia w podczerwieni, chemiluminescencja , itp.; (3) elektroforeza kapilarna ; oraz (4) metody immunologiczne (antygen-przeciwciało) . Złożone techniki oprzyrządowania wywierają ogromną presję na podstawowe badania przesiewowe w kierunku narkotyków ze względu na konieczność posiadania wyrafinowanego sprzętu i profesjonalnych operatorów. Laboratorium jest czasami zamknięte lub znajduje się daleko. Nawet komisariaty policji nie są w stanie pomieścić tak skomplikowanego i drogiego sprzętu. Funkcjonariusz policji musi jednak natychmiast ocenić, czy podejrzany materiał zawiera heroinę, czy nie, i musi szybko zareagować. Dlatego pilnie potrzebny jest rozwój specyficznych, niezawodnych i prostych metod wykrywania nielegalnych narkotyków w próbkach biologicznych .

Spośród metod szybkiego wykrywania, koloidalne złote nanocząstki (AuNP)-oparte na bocznych paskach przepływowych (LFSs) zostały szeroko przyjęte do szybkiego przesiewania ze względu na zależną od rozmiaru i odległości właściwość optyczną AuNPs, z pierwszym sprawozdaniem Mirkina i współpracowników . Zasada półilościowych testów przepływu bocznego polega na tym, że czerwony kolor AuNPs może być postrzegany gołym okiem z kombinacji antygen-przeciwciało w ciągu kilku minut . Dostępne są różne komercyjne zestawy testowe do wykrywania nadużywania heroiny, w tym te pochodzące z firm NovaBios i Wondfo. Jednak większość zestawów do badań przesiewowych heroiny mierzy tylko morfinę, ale nie 6-MAM, ponieważ trudno jest rozróżnić 6-MAM od morfiny. Morfina może być metabolizowana z innych narkotyków lub mogła być przepisana na receptę. 6-MAM jest jednoznacznie identyfikowalny z heroiną.

Próbki obejmują krew, osocze, mocz, włosy, płyny ustne, jak również w oddechu, pocie, mleku matki, zębach, itp. Najczęstsze próbki używane do testowania nielegalnej heroiny to krew, mocz i płyny ustne. Spośród nich, test krwi jest najbardziej dokładny i wiarygodny, ale jest również inwazyjny. Badanie moczu jest najwygodniejsze i szeroko stosowane w badaniach przesiewowych w kierunku nadużywania narkotyków. Płyny ustne są coraz częściej wykorzystywane do badań w punktach opieki zdrowotnej – można je łatwo zebrać w miejscach publicznych. Jednakże płyny ustne są bardzo lepkie i mają niskie stężenie celu; dlatego większość testów wykorzystuje mocz do badania 6-MAM. Wszystkie opracowywane testy z płynów ustnych będą miały ten sam problem z pobraniem próbki i poprawą czułości. Poprzednie badanie wykazało, że 6-MAM jest często wykrywany w płynie ustnym. Standard wykrywania LFS w płynie ustnym 6-MAM wynosi 4 ng ml-1 . Tutaj opracowaliśmy test przepływu bocznego dla heroiny w próbkach płynu ustnego.

Zbadaliśmy AuNPs jako etykiety przeciwciał w teście przepływu bocznego do szybkiego i czułego wykrywania 6-MAM poprzez sygnał kolorymetryczny. Najpierw zsyntetyzowaliśmy 6-MAM, a następnie skoniugowaliśmy go z albuminą surowicy bydlęcej (BSA), aby umożliwić jego opłaszczenie na linii T. Ponadto, w celu przezwyciężenia trudności związanych z próbkami płynów ustnych, wybrano rodzaje membran nitrocelulozowych (NC), formułę roztworu podkładki do próbek oraz gąbki adsorbującej w celu znalezienia najlepszych warunków dla płynów ustnych LFS. Ostatecznie, 6-MAM LFS został zwalidowany i wykazano, że ma wyjątkową czułość i specyficzność.

Doświadczalne

2.1. Materiały

Przeciwciała przeciwko 6-MAM zostały dostarczone przez Bioventure (Szanghaj). BSA i poliwinylopirolidon (PVP) zostały zakupione od firmy Sigma (Barcelona, Hiszpania). Triton X-100, Tetronic 1307 (S9), Ohodasurf On-870 (S17) i STANDAPOL ES-1 (S7) zostały zakupione od BASF (Niemcy). Woda destylowana (rezystywność 18,2 MΩ cm-1) została wyprodukowana przez system wody ultraczystej RephiLe PURIST UV (Chiny). System dyspersyjny Reel pochodził z firmy Doyesgo (Chiny). Spektrometr mas Vion IMS Q-Tof pochodził z firmy Waters (USA). Wszystkie standardowe materiały, takie jak 6-MAM i morfina, pochodziły z National Institutes for Food and Drug Control (Chiny). Mikroskop pochodził z Motic AE2000 (Xiamen, Chiny). Wszystkie inne odczynniki chemiczne i immunologiczne nie wyszczególnione tutaj były standardowymi produktami handlowymi o klasie analitycznej/odczynnikowej.

2.2. Komponenty pasków do badania przepływu bocznego

LFS składają się z plastikowego podkładu, paska adsorbentu gąbczastego (podkładka gąbczasta), podkładki do próbek, podkładki sprzężonej, membran NC i podkładki absorbującej. Pasek adsorbentu gąbkowego jest specjalnie zaprojektowany do pobierania płynów z jamy ustnej i szybko przenosi płyn z jamy ustnej do poduszki na próbkę. Podkładka zawiera system buforowy i niektóre środki powierzchniowo czynne. Koniugaty przeciwciało-AuNP zostały rozpylone na poduszce do koniugatów, aby zareagować z próbką i zostać uwolnione z poduszki i wejść na membranę NC pokrytą 6-MAM-BSA w linii T i kozimi przeciwciałami anty-rabbitowymi w linii C. Podkładka absorbująca to bibuła filtracyjna umieszczona na końcu paska; utrzymuje ona przepływ kapilarny. LFS musi być umieszczony w jamie ustnej lub włożony do pojemnika na próbkę płynu ustnego. Schematyczny widok LFS przedstawiony jest na rycinie 2. Schematyczny widok LFS do wykrywania 6-MAM jest przedstawiony na rysunku 3.

2.3. Synteza koniugatu 6-monoacetylomorfiny z albuminą surowicy wołowej

Przygotowanie 6-MAM przeprowadzono w sposób opisany wcześniej w pracach badawczych . W skrócie, morfina została najpierw wytworzona przez hydrolizę alkaliczną heroiny. Następnie do cząsteczki 6-MAM dodano grupę estrową N-hydroksysukcynoimidu (NHS) w celu sprzężenia jej z białkami nośnikowymi (rysunek 4). Aktywowany 6-MAM został oznaczony za pomocą spektrometru masowego Waters® Vion IMS Q-Tof. Następnie przeprowadzono syntezę zgodnie z opisem (rysunek 5) z pewnymi modyfikacjami. Najpierw 80 mg BSA w 6 ml 50 mM buforu fosforanowego potasu (pH = 7,5) schłodzono do temperatury 0°C. Następnie 20 mg aktywowanego 6-MAM schłodzono do temperatury 0°C. Następnie dodano kroplowo w temperaturze 0°C 20 mg aktywowanego 6-MAM w 1 ml bezwodnego dimetyloformamidu (DMF). Mieszaninę ogrzano do temperatury pokojowej i mieszano przez noc. Otrzymany koniugat 6-MAM-BSA dializowano wobec 50 mM buforu fosforanowego potasu (pH = 7,5) z sześciokrotną zmianą buforu (co najmniej 6 h każda w 4°C).

2.4. Przygotowanie koniugatów nanocząstek złota z przeciwciałami

Przygotowanie 20 nm AuNPs przeprowadzono metodą redukcji cytrynianowej . W tym przypadku do 100 ml wrzącej wody dodano 2 ml 1% roztworu HAuCl4 energicznie mieszając, a następnie natychmiast dodano 2 ml 1% roztworu cytrynianu sodu. Kiedy roztwór zmienił kolor na czerwony, gotowano go przez kolejne 15 minut. Roztwór schłodzono do temperatury pokojowej i przechowywano w temperaturze 4°C do dalszego użycia.

Po dostosowaniu wartości pH roztworu AuNPs do 9,0 za pomocą 0,1 M K2CO3, do 10 ml roztworu AuNPs dodano 30 µg przeciwciał 6-MAM i inkubowano przez 30 min. Następnie dodawano 20 µl 100,0 g l-1 BSA przez 15 min w celu zablokowania miejsc reaktywnych. Roztwór odwirowywano przy 3740g przez 15 min, a supernatant ponownie odwirowywano przy 12 100g przez kolejne 30 min. Wszystkie złote osady mieszano i mierzono w celu określenia maksymalnej absorbancji za pomocą spektroskopii UV-visible. Następnie przechowywano w temperaturze 4°C do dalszego użycia.

Tę samą metodę zastosowano do koniugacji AuNPs z króliczymi przeciwciałami IgG. Podczas wykonywania podkładki koniugatowej koniugaty przeciwciał rozcieńczano do absorbancji piątej za pomocą buforu (0,05 M Tris-HCl zawierający 10,0 g l-1 BSA, 0,4% Triton X-100, 5% trehaloza, 10% sacharoza, pH 8,2). Na koniec, 500 µl zmieszanych koniugatów AuNPs-przeciwciało rozpylano na włókno szklane o powierzchni 20 mm2 , a następnie suszono w temperaturze 37°C przez noc.

2.5. Przygotowanie powlekanej membrany nitrocelulozowej

W celu wykonania paska testowego o przepływie bocznym, antygeny 6-MAM-BSA (0,6 mg ml-1) dozowano na membrany NC jako linie testowe (linia T). Linie kontrolne (linia C) były pokryte przeciwciałami poliklonalnymi kozimi anty-rabbitowymi (0,15 mg ml-1). Powleczone membrany NC suszono w temperaturze 37°C przez noc. Oceniono dziewięć komercyjnych membran NC z czterech firm: Millipore (HF90, HF135 i HF180), GE-Whatman (FF120HP i AE100), Sartorius (CN95 i CN150) oraz Pall (Vivid90 i Vivid170).

2.6. Czułość i swoistość

Pasek jest testem konkurencyjnym, a oba stanowiska posiadały paski z 6-MAM. Kiedy próbka zawiera 6-MAM, wiąże się z przeciwciałem znakowanym nanogoldem na skoniugowanej podkładce. Nadmiar przeciwciał przesuwa się wzdłuż kierunku chromatograficznego w wyniku działania kapilarnego i następnie wiąże się z antygenem 6-MAM na linii T. Intensywność sygnału linii T jest bezpośrednio związana ze stężeniem 6-MAM w próbce. Ciemniejszy kolor wskazuje na niższe stężenie 6-MAM.

Negatywny płyn ustny został pobrany od sześciu osób i nasycony 6-MAM (400, 100, 40, 10, 4, 1, 0.4, 0.1 ng ml-1) w celu wykrycia czułości. Do weryfikacji specyficzności LFS wykorzystano dziesięć powszechnie nadużywanych narkotyków. Były to: morfina (MOP, 100 µg ml-1), kodeina (COD, 100 µg ml-1), tetrahydrokannabinol (THC, 10 µg ml-1), metylenodioksymetamfetamina (MDMA, 100 µg ml-1), ketamina (KET, 100 µg ml-1), metyloamfetamina (MET, 100 µg ml-1), kokaina (COC, 100 µg ml-1), metadon (MTD, 100 µg ml-1), efedryna (EPH, 100 µg ml-1) i pseudoefedryna (PEPH, 100 µg ml-1).

Wyniki i dyskusja

3.1. Synteza koniugatu 6-monoacetylomorfiny z albuminą surowicy bydlęcej

MembranyNC są zwykle najpierw pokrywane białkiem nośnikowym przed koniugacją przeciwciała. Łączniki są używane do utrzymania strukturalnej specyficzności. W tym przypadku, grupa estrowa NHS została najpierw dodana do cząsteczki 6-MAM jako linker dla białka nośnikowego. Zostało to zwalidowane za pomocą spektrometru mas Waters® Vion IMS Q-Tof. Znaleźliśmy szeroki pik w chromatogramach ultra-performance liquid chromatography (UPLC) aktywowanego 6-MAM w 8.8 min z m/z 706.27645 (rysunek 6) w porównaniu do przewidywanego m/z 706.2758. Wskazuje to, że linker został pomyślnie przyłączony do 6-MAM. Znaczenie precyzyjnej syntezy jest oczywiste, ponieważ tylko struktura jest prawidłowo ustalona, a to może prowadzić do sparowania z przeciwciałami 6-MAM.

Nie stosowaliśmy gradientowej dializy dimetylosulfotlenkiem, ponieważ produkt jest rozpuszczalny, a poprzedni protokół koniugacji jest zbyt skomplikowany. BSA miał kilka pików w chromatogramie UPLC (dane nie pokazane) z powodu różnych analogów. Doprowadziło to do powstania szeregu współczynników koniugacji. Dlatego na chromatogramie UPLC znajdowały się różne piki odpowiadające różnym stosunkom koniugacji. Wyniki koniugacji mogły być skuteczniej potwierdzone poprzez kojarzenie antygen-przeciwciało niż stosunek koniugacji.

3.2. Rodzaje wyboru membran nitrocelulozowych

Membrany NC wiążą białka elektrostatycznie poprzez oddziaływania silnego dipola estru azotanowego z silnym dipolem wiązań peptydowych białka. Właściwości takie jak szybkość przepływu kapilary, intensywność sygnału i tło zostały ocenione, ponieważ mogą one wpływać na końcową wydajność LFS. Ponadto, prędkość przepływu jest przedmiotem szczególnej uwagi, ponieważ może ona wpływać na zdolność adsorpcji białek, a nawet na czułość. Szybkość przepływu membrany zależy od zagregowanych właściwości struktur porowatych, takich jak wielkość porów, rozkład wielkości porów i porowatość. Większy rozmiar porów prowadzi do słabszej adsorpcji białek.

Porównaliśmy dziewięć membran NC (tabela 1). Każdy test był powtarzany trzy razy, a średni wynik był zapisywany. Wyniki LFS były mierzone w ciągu 3 min, a najlepsza prędkość przepływu próbki była poniżej 20 s cm-1. Wymagana była również intensywność sygnału w linii T na normalnym poziomie. Głębsze zabarwienie tła utrudniało dokładność. Membrana Millipore HF135 była najlepszym wyborem dla 6-MAM po wszechstronnym rozważeniu szybkości przepływu próbki, intensywności sygnału na linii T i koloru tła.

3.3. Podkładka z próbkami

Roztwór do traktowania podkładki z próbkami jest bardzo ważny dla testu, ponieważ służył jako system buforowy reakcji, gdy próbki płynu ustnego nawadniają podkładkę. Roztwór zazwyczaj zawiera system buforowy o odpowiedniej sile jonowej i wartości pH; niektóre materiały blokujące i środki powierzchniowo czynne mogą przyspieszyć szybkość przepływu płynu ustnego na membranie. Podkładka pod próbkę radzi sobie ze złożonością efektów matrycy płynu ustnego i czyni go kompatybilnym z membraną NC. Ponadto, system buforowy zapewnia uwalnianie analitów i stabilizuje szybkość przepływu, ponieważ płyn ustny jest zbyt lepki.

Rozważono cztery różne formuły. Formuły roztworów są podane w tabeli 2. Wyniki wskazały, że układ buforowy 4 z surfaktantem STANDAPOL ES-1 (S7) dał najlepszą wydajność przy szybkości przepływu próbki 17 s cm-1, z normalną intensywnością sygnału i białym tłem. Surfaktant S7 jest silnym anionowym środkiem powierzchniowo czynnym, który oferuje silniejszą zdolność do mycia niż S17 i S9.

3.4. Zbieranie płynów ustnych

Płyny ustne są trudniejsze do zebrania niż mocz ze względu na ich dużą lepkość. Istnieje wiele rodzajów przyrządów do zbierania płynów z jamy ustnej: waciki, gąbki, plastikowe rurki i kubki. Niektóre metody stymulują płyny ustne poprzez ocet, płyny do płukania ust, pastylki itp. Jednakże, taka stymulacja może zmienić stężenie analitów w płynie ustnym i jest bardziej skomplikowana i czasochłonna. Ostatecznie zebraliśmy płyn ustny bezpośrednio z jamy ustnej za pomocą adsorbentu gąbkowego (ESSENTRA, UK), który jest mieszanką włókien polimerowych o odpowiedniej wielkości porów.

Dwa rodzaje adsorbentów gąbkowych (K1 i K2) zostały zaprojektowane na zamówienie, a struktury obu wkładek gąbkowych pokazano na rycinie 7. K2 był znacznie luźniejszy i regularny w stosunku do K1. Oba były oceniane poprzez testowanie wydajności przenoszenia płynów, włączając w to upuszczanie wody na gąbkę, wkładanie końcowego LFS do ujemnego buforu fosforanu potasu (pH = 7.0) i wkładanie końcowego LFS do ust. Gąbka K2 miała dwukrotnie szybszy przepływ próbki (średnio 20 s cm-1) niż gąbka K1 dla wody, buforu PBS lub prawdziwych płynów ustnych. Jest to bardzo ważna kwestia przy badaniu płynów ustnych. Podsumowując, K2 została wybrana ze względu na wyróżniającą się wydajność w postępowaniu z próbkami płynów ustnych.

3.5. Czułość i specyficzność

Małe cząsteczki są zwykle wykrywane za pomocą testu kompetycyjnego w LFS. Tutaj, w linii T nie ma żadnego sygnału (czerwona linia). Odpowiada to stężeniu 6-MAM w próbce, które jest powyżej wartości odcięcia. Czułość badania płynu ustnego powinna być znacznie wyższa niż badania moczu ze względu na niskie stężenie metabolitów narkotyków w płynie ustnym. Tutaj, z powodzeniem wykonaliśmy jakościowy LFS dla 6-MAM z czułością 4 ng ml-1, która spełnia wymagania dla ogólnych granic wykrywalności płynu ustnego. Wyniki przedstawione są na rycinie 8. Dodatkowo, rysunek 9 przedstawia specyficzność w stosunku do powszechnie nadużywanych narkotyków. 6-MAM LFS był specyficzny dla 6-MAM bez reakcji krzyżowych, szczególnie z morfiną i kodeiną.

Wniosek

Szczególnym metabolitem heroiny jest 6-MAM. Zgłaszamy tutaj LFA dla 6-MAM poprzez specjalny koniugat sparowany ze specyficznym przeciwciałem. Stworzyliśmy koniugat, który łączył 6-MAM z białkiem nośnikowym poprzez grupę estrową NHS w pozycji C3 (ryc. 10). W tym przypadku przeciwciało zidentyfikowało grupę acetylową 6-MAM. Jest to warunek konieczny dla specyficzności dla 6-MAM. Wreszcie, wykonaliśmy bardzo czuły test LFS bez reakcji krzyżowych z 10 powszechnie nadużywanymi lekami, w tym morfiną i kodeiną. Zidentyfikowaliśmy odpowiednie membrany NC, podkładkę do próbek, rozmiar porów i adsorbent gąbkowy, aby wykonać test wykorzystujący płyny ustne w punkcie opieki.

Przy powyższych zaletach, 6-MAM LFS dla próbki płynu ustnego może być stosowany zarówno do badań jak i zastosowań przemysłowych. Mogłoby to pomóc policji w zaoszczędzeniu siły roboczej i czasu/kosztów podczas wstępnych badań przesiewowych. Płyny ustne są wygodne i mniej inwazyjne i są odpowiednie do badań przesiewowych w ruchu drogowym. Podsumowując, płyn doustny LFS dla nadużywania heroiny ukierunkowany na 6-MAM jest obiecującym produktem do zwalczania jazdy pod wpływem narkotyków.

Etyka

Użycie próbek heroiny do badań było nadzorowane przez Trzeci Instytut Badawczy Chińskiego Ministerstwa Bezpieczeństwa Publicznego. Wszyscy autorzy oświadczają, że przestrzegają norm etycznych.

Dostępność danych

Dane są zdeponowane w Repozytorium Cyfrowym Dryad: https://doi.org/10.5061/dryad.8r36rp3 .

Wkład autorów

L.Z. wymyślił to badanie, a X.H i J.Z. pomogli w wykonaniu eksperymentów na rycinach 4 i 5. F.C. i Y.Z. przeprowadzili badania na rycinie 6. J.L. przeanalizował dane i napisał pracę. Wszyscy autorzy wyrazili ostateczną zgodę na publikację.

Interesy konkurencyjne

Zgłaszamy, że nie mamy żadnych konkurencyjnych interesów.

Finansowanie

Nie otrzymaliśmy żadnych funduszy na ten artykuł.

Zrzeczenie się odpowiedzialności

Wszelkie opinie, ustalenia i wnioski lub zalecenia wyrażone tutaj są opiniami autorów.

Przypisy

Ten artykuł został zredagowany przez Royal Society of Chemistry, włączając w to zlecenie, proces peer review i aspekty redakcyjne aż do punktu akceptacji.

.