A More Accurate Approach to Amyloid Detection and Subtyping: Combining in situ Congo Red Staining and Immunohistochemistry

Abstract

Amyloidoza jest wynikiem różnych, różnie podchodzących chorób. Niezwykle ważne jest określenie podtypu złogów amyloidu, aby ustalić i ostatecznie leczyć prawidłowo chorobę podstawową. Poza klasycznym barwieniem czerwienią Kongo, do klasyfikacji potrzebne są dalsze procedury, takie jak barwienie immunohistochemiczne. Tutaj przedstawiamy dokładniejsze podejście wykorzystujące podwójne barwienie czerwienią Kongo/immunohistochemiczne, łatwe do zastosowania w rutynowej diagnostyce. Modyfikacja techniki barwienia czerwienią Kongo i procedur immunohistochemicznych była konieczna w celu połączenia obu procedur barwienia na jednym preparacie. Ocenę przeprowadzono przy użyciu konwencjonalnej mikroskopii świetlnej i fluorescencyjnej. Dzięki skróceniu czasu barwienia czerwienią Kongo do 10 s i modyfikacji dotyczącej blokady endogennej peroksydazy, można było uzyskać dokładne wyniki oceny podwójnego barwienia czerwienią Kongo/immunohistochemii przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego. Sekcje o grubości 2 μm zamiast 4 μm były lepsze do oceny, ponieważ zwiększyły one specyficzność barwienia. Połączenie czerwieni Kongo i immunohistochemii jako podwójne barwienie in situ na jednym preparacie jest możliwym do zastosowania podejściem w diagnostyce amyloidozy. Pozwala ono na skupienie się na obszarach fluorescencyjnych czerwieni Kongo podczas oceny immunohistochemicznej, co pozwala na uniknięcie wyodrębnienia wyników fałszywie dodatnich. Dodatkowo zwiększa stosunek sygnału do szumu w sekcjach barwionych immunohistochemicznie w mikroskopii konwencjonalnej.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Wprowadzenie

Amyloidoza jest morfologicznym opisem odkładania się nieprawidłowo sfałdowanych białek, które można znaleźć w wielu różnych typach tkanek . Białka tworzące amyloid pochodzą z wielu źródeł, począwszy od nowotworów, takich jak nowotwory komórek plazmatycznych lub raka rdzeniastego tarczycy, do przewlekłych infekcji, lub są postrzegane jako wynik starzenia się. W rzadkich przypadkach amyloidoza jest spowodowana genetycznie dziedziczonymi zaburzeniami składania białek. Znaczenie kliniczne amyloidozy sięga od przypadkowych znalezisk podczas autopsji do chorób zagrażających życiu. Podczas badania próbek tkanek ważne jest, aby patolodzy pamiętali o prawdopodobieństwie występowania złogów amyloidu, ponieważ może to być pierwsza wskazówka dotycząca nieznanej jeszcze poważnej choroby podstawowej. Co ważne, chociaż istnieją obiecujące wyniki dotyczące terapii ukierunkowanych na same złogi amyloidu, metody leczenia w amyloidozie nadal mają na celu głównie zaburzenie podstawowe, a to z kolei w większości przypadków może i musi być określone na podstawie podtypu amyloidu.

Klasycznym barwieniem histochemicznym amyloidu jest czerwień Kongo, wprowadzona przez Bennholda w 1922 roku; typowa „jabłkowozielona” dwójłomność wykorzystująca polaryzację została po raz pierwszy opisana w 1927 roku. W celu zwiększenia czułości i specyficzności barwienia czerwienią Kongo zastosowano kilka metod, w tym ocenę sekcji barwionych czerwienią Kongo za pomocą światła fluorescencyjnego ze względu na znane właściwości fluorescencyjne czerwieni Kongo. Niedawno do wykrywania amyloidu zaproponowano metody wykorzystujące cyfrowo wzmocnioną technikę polaryzacji hematoksyliny i eozyny, szczególnie pomocne w identyfikacji amyloidu w przypadkach, w których dostępna tkanka jest skąpa.

Złotym standardem dla podtypowania amyloidu jest immunohistochemia, w tym kilka dobrze ugruntowanych protokołów; istnieją jednak pewne niedociągnięcia, szczególnie biorąc pod uwagę gorszą swoistość przeciwciał przeciwko amyloidogennemu łańcuchowi lekkiemu lambda. Nowym podejściem do podtypowania szczególnie rzadkich wariantów amyloidozy jest spektrometria mas; niestety, ze względu na koszty i dostępność, ta obiecująca metoda nie jest jak dotąd szeroko stosowana, a dodatkowym mankamentem jest jej oczywiste ograniczenie w przypadkach skąpej dostępności tkanek lub ograniczonej ilości zdeponowanego amyloidu. Innym niedawnym osiągnięciem jest wykorzystanie mikroskopii immunoelektronowej aspiratów tłuszczu brzusznego do podtypowania złogów amyloidu; jest to jednak wyrafinowana metoda.

Kilka wcześniejszych badań skupiło się na połączeniu fluorescencji i immunohistochemii. Tutaj przedstawiamy dodatkowe dowody na praktyczność takiego podejścia i zgłaszamy protokół łatwo przekładalny na rutynę, który umożliwił nam dokładne zajęcie się subtypizacją amyloidu na tkankach utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie. Podwójne barwienie czerwienią Kongo/immunohistochemia pozwala skupić się na obszarach pozytywnych dla czerwieni Kongo przy ocenie immunohistochemicznej i zwiększa stosunek sygnału do szumu sekcji barwionych immunohistochemicznie przy konwencjonalnej ocenie mikroskopem świetlnym, poprawiając zarówno specyficzność jak i czułość procedury, jak również zmniejszając ilość tkanki potrzebnej do diagnostyki.

Materiały i metody

Wybór przypadków

Do opracowania nowej techniki wykorzystano wycinki z potwierdzonym rozpoznaniem amyloidozy z naszego archiwum. Są one wymienione w tabeli 1 wraz z etapami, do których użyto odpowiedniej tkanki.

Podejście do barwienia czerwienią Kongo

Barwienie czerwienią Kongo było początkowo wykonywane zgodnie z protokołem ustalonym w naszym instytucie: utrwalona w formalinie i zatopiona w parafinie tkanka jest cięta na sekcje o grubości 6 μm, deparafinowana i barwiona czerwienią Kongo przez 30 min – 2.5 g czerwieni Kongo (Merck Millipore, Darmstadt, Niemcy) i 1 g wodorotlenku potasu (Merck Millipore) rozpuszcza się w 500 ml 80% etanolu; następnie skrawki przepłukuje się wodą z kranu, po czym przez 4 min. barwi się je hematoksyliną (Merck Millipore). W następnym kroku sekcje są różnicowane w 0,5% roztworze HCl/etanol i ponownie płukane wodą z kranu przez 10 min, zanim zostaną odwodnione i zamontowane.

Do naszego badania protokół został zmodyfikowany w odniesieniu do czasu barwienia czerwienią Kongo, aby zobaczyć, jaki wpływ krótsze czasy barwienia mogą mieć na późniejsze barwienie immunohistochemiczne. Badano również sekcje o grubości 2 i 4 μm.

Barwienie immunohistochemiczne i blokada endogennej peroksydazy

Warunki barwienia immunohistochemicznego dla różnych podtypów amyloidu są wymienione w tabeli 2. Zgodnie z sugestią producenta, do wykrywania amyloidogennych łańcuchów lekkich kappa i lambda użyto dwóch różnych klonów, odpowiednio. Immunohistochemię wykonywano po procedurze barwienia czerwienią Kongo. Krótko mówiąc, zdeparafinowane i zablokowane endogenną peroksydazą szkiełka (patrz później) inkubowano w normalnej surowicy końskiej (do barwienia amyloidu AA) lub normalnej surowicy koziej (do wszystkich innych barwień)/roztworze soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) (900 μl surowicy/60 ml TBS) przez 30 min w temperaturze pokojowej (obie surowice z Vector Lab., Burlingame, Calif, USA), a następnie inkubować przez noc z przeciwciałem pierwotnym w 4°C, spłukać i inkubować z biotynylowaną anty-mysią IgG (do barwienia amyloidu AA) lub biotynylowaną anty-rabinową IgG (do wszystkich innych procedur barwienia) roztworem (300 μl IgG/900 μl normalnej surowicy końskiej lub koziej/60 ml TBS; obie IgG z Vector Lab.) przez 30 min w temperaturze pokojowej; na koniec zostały wypłukane i inkubowane z zestawem peroksydazy awidyna-biotyna (Vectastain firmy Vector Lab.) przez 30 min i wizualizowane przy użyciu gotowego do użycia 3-amino-9-etylokarbazolu (AEC; firmy Dako, Glostrup, Dania) jako chromogenu (10-20 min pod natychmiastową kontrolą optyczną) i hematoksyliny Meyera (firmy Medite, Dietikon, Szwajcaria). Preferowano AEC, ponieważ poprzednie eksperymenty wykazały lepszy stosunek sygnału do szumu dla wizualizacji AEC w porównaniu do wizualizacji diaminobenzydyny. Ponieważ AEC jest rozpuszczalny w wodzie i alkoholu, szkiełka zostały pokryte Medi-Mount (z Medite, Burgdorf, Niemcy) na 30 min przed przykryciem.

Ponieważ zwykłe leczenie blokady endogennej peroksydazy tkanek (3% roztwór H2O2 w 70% etanolu) po zakończeniu barwienia czerwienią Kongo prowadziło do utraty kongofilii, przetestowano dalsze metody blokowania endogennej peroksydazy, takie jak: przeniesienie tego kroku przed barwieniem czerwienią Kongo i zastąpienie 70% etanolu wodą destylowaną.

Ocena

Podwójnie wybarwione sekcje czerwieni Kongo/immunohistochemii były przede wszystkim oceniane przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu świetlnego w celu oszacowania, czy odpowiedni immunohistochemiczny produkt chromogenu był wizualizowany zgodnie z oczekiwaniami, gorzej lub lepiej w porównaniu z rutynowym barwieniem diagnostycznym (bez wstępnego barwienia czerwienią Kongo). Następnie, mikroskop fluorescencyjny z filtrem rodaminy (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Getynga, Niemcy) został użyty do oceny fluorescencji barwnika czerwieni Kongo. Obszary, które wykazywały specyficzną intensywną fluorescencję były dalej oceniane za pomocą mikroskopii świetlnej, aby sprawdzić, czy złogi amyloidu mogą być również wykryte przez immunohistochemię w tych obszarach.

Wyniki

Krok 1: Modyfikacje Protokołu Barwienia Czerwienią Kongo

Przetestowano różne czasy barwienia dla czerwieni Kongo. Było to konieczne, ponieważ zdolność przeciwciał do wiązania antygenów została zmniejszona przez procedurę barwienia czerwienią Kongo, a czerwień Kongo o pełnej intensywności utrudniała równoczesną ocenę, ponieważ czerwony chromogen (AEC) o kolorze podobnym do czerwieni Kongo był używany do immunohistochemii. Stosując pierwotny czas barwienia wynoszący 30 min, można było wykryć dwójłomność w przypadku złogów amyloidu przy użyciu filtra polaryzacyjnego w konwencjonalnej mikroskopii świetlnej. Gdy barwienie czerwienią Kongo trwało tylko 5, 10 lub 20 s, zawsze można było wykryć pozytywne sygnały przy użyciu filtra rodaminowego mikroskopu fluorescencyjnego, podczas gdy konwencjonalna mikroskopia tylko sporadycznie wykazywała kongofilię i dwójłomność przy użyciu filtra spolaryzowanego (ryc. 1). Do dalszej analizy, czas barwienia czerwienią Kongo został zredukowany do 10 s w celu uniknięcia przebarwienia; 10 s zostało wybrane ze względów praktycznych (łatwiejsze do stałego przestrzegania w porównaniu do 5 s) w mokrym laboratorium.

Krok 2: Modyfikacje protokołów immunohistochemicznych dla połączenia czerwieni Kongo i barwienia immunohistochemicznego na jednym szkiełku mikroskopowym

W pierwszym etapie wykonano barwienie immunohistochemiczne na oddzielnych przekrojach w celu potwierdzenia antygenowości tkanek użytych w tym badaniu, które wykazało zadowalające wyniki barwienia przy użyciu ustalonych rutynowych protokołów, jak wyszczególniono w tabeli 2.

Przy łączeniu barwienia czerwienią Kongo (czas barwienia czerwienią Kongo 10 s) z barwieniem immunohistochemicznym na tych samych przekrojach zauważono, że kongofilia zniknęła po zakończeniu procedur immunohistochemicznych z zastosowaniem wspólnego leczenia blokady endogennej peroksydazy tkanek (3% roztwór H2O2 w 70% etanolu), ponieważ czerwony barwnik Kongo został wypłukany. Dlatego też w trzecim etapie zmodyfikowano sposób postępowania w celu zablokowania endogennej peroksydazy. Blokowanie endogennej peroksydazy przy użyciu konwencjonalnej metody, ale z zastosowaniem jej przed procedurą barwienia czerwienią Kongo, jak również zastąpienie 70% etanolu wodą destylowaną, podczas wykonywania blokowania endogennej peroksydazy po barwieniu czerwienią Kongo, prowadziło do zadowalających wyników, zarówno dla oceny barwienia czerwienią Kongo, jak i dla barwienia immunohistochemicznego. W celu jak najściślejszego zachowania typowego przebiegu pracy w laboratorium mokrym zastosowano metodę zastępowania etanolu wodą destylowaną. Próba pominięcia blokady endogennej peroksydazy umiarkowanie obniżyła stosunek sygnału do szumu dla wizualizacji AEC (zakładając, że niezablokowane enzymy endogenne wykorzystywały AEC i z jednej strony nieznacznie przebarwiały tło, a z drugiej pozbawiały kompleks ABC-peroksydaza chromogenu dla właściwej wizualizacji) i dlatego nie była dalej wykorzystywana. Jakość barwienia immunohistochemicznego po wstępnym barwieniu czerwienią Kongo była taka sama jak w przypadku barwienia immunohistochemicznego bez uprzedniego barwienia czerwienią Kongo; w związku z tym stwierdziliśmy, że wykonywanie immunohistochemii na przekrojach wstępnie barwionych czerwienią Kongo przez 10 s nie prowadzi do utraty antygenowości ani do niespecyficznych wyników barwienia.

Krok 3: Modyfikacje grubości przekrojów

Na koniec zbadaliśmy rolę różnych grubości przekrojów (2 i 4 μm). Ogólnie rzecz biorąc, specyficzność i możliwość oceny barwienia immunohistochemicznego (stosunek sygnału do szumu) była lepsza na cieńszych przekrojach; poza tym, było mniej artefaktów związanych z odrywaniem się tkanki od szkiełek podczas procedur barwienia. We wszystkich przypadkach uzyskano takie same wyniki, jak podczas wstępnej diagnostycznej podtypizacji złogów amyloidu.

Przykłady wdrożenia opisanego podejścia do rutynowych procedur diagnostycznych

Rysunki 2 i 3 ilustrują dwa rutynowe przypadki, w których można było uzyskać podtypowanie amyloidu przy użyciu nowego algorytmu zaproponowanego w tym badaniu; stosując wyłącznie technikę konwencjonalną, nie uzyskano żadnych możliwych do interpretacji wyników.

Dyskusja

Tutaj, przedstawiamy i walidujemy połączoną procedurę podwójnego barwienia czerwienią Kongo/immunohistochemią, która pozwala skupić się na obszarach pozytywnych dla czerwieni Kongo podczas oceny immunohistochemicznej, poprawiając w ten sposób specyficzność podtypowania amyloidu in situ. Pomaga to również w oszczędzaniu tkanki, co jest problemem, ponieważ materiał biopsyjny staje się coraz bardziej ograniczony z powodu zmienionych podejść diagnostycznych wykorzystujących cienkie rdzenie igłowe i biopsje forcipes.

W przeciwieństwie do innych proponowanych nowych technik oceny koncentrujących się na wyrafinowanej cyfrowej ocenie obrazu, nasze podejście może być łatwo włączone do rutynowej diagnostyki. Wymagania wstępne obejmują jedynie modyfikację ustalonego barwienia czerwienią Kongo, dostępną immunohistochemię amyloidu, jak również mikroskop fluorescencyjny z filtrem rodaminy. Idealnie byłoby używać mikroskopów, które są wyposażone zarówno w mikroskopię fluorescencyjną, jak i konwencjonalną mikroskopię świetlną, ponieważ upraszcza to proces weryfikacji na tych samych (fluorescencyjnych) obszarach zainteresowania odkładania się amyloidu podczas oceny immunohistochemicznej poprzez prostą zmianę źródła światła i filtra. Jednakże, dwa różne mikroskopy mogą być używane również, ale w trudnych przypadkach, robienie zdjęcia odpowiednich obszarów we fluorescencji i mikroskopii świetlnej może być zasugerowane dla łatwiejszej oceny.

W zgodzie z poprzednimi badaniami, mogliśmy pokazać, że czerwień Kongo nie zakłóca lub przeszkadza immunohistochemii . Ponadto, w porównaniu do grubości sekcji 4-6 μm używanych w większości dotychczasowych badań, mogliśmy wykazać, że użycie cieńszych sekcji 2 μm, które są korzystne dla immunohistochemii (lepszy stosunek sygnału do szumu, mniej artefaktów oderwania), może również prowadzić do zadowalających wyników dotyczących barwienia czerwienią Kongo, jeśli jest odczytywane przez mikroskop fluorescencyjny.

Było kilka ostatnich prac propagujących użycie fluorescencji do oceny złóż amyloidu i demonstrujących jej wyższość nad mikroskopią światła spolaryzowanego przez bycie zarówno bardziej specyficzne jak i bardziej czułe. W tym badaniu, udoskonaliliśmy i zoptymalizowaliśmy to podejście na kilka sposobów poprzez pracę nad dostosowanym protokołem dotyczącym czasu barwienia, procedur barwienia, jak również grubości sekcji. Zmiany te ostatecznie umożliwiły wykonanie podwójnego barwienia in situ zarówno dla czułego i specyficznego wykrywania złogów amyloidu, jak również dla podtypowania tych złogów, co jest kluczowe dla odróżnienia choroby podstawowej prowadzącej do powstawania złogów amyloidu. Nasza metoda podwójnego barwienia pozwala nie tylko na czułe wykrywanie amyloidu za pomocą fluorescencji i jednocześnie na specyficzną kategoryzację tych złogów, ale także na zaoszczędzenie materiału, co pozwala na uniknięcie sekwencji seryjnych, na których czasami drobne złogi amyloidu mogły być już wycięte. Od czasu wprowadzenia tego podwójnego barwienia, zastosowaliśmy to podejście w kilku przypadkach, w których nie można było postawić ostatecznej diagnozy innymi metodami. Rysunki 2 i 3 ilustrują dwa z tych przypadków.

Jednakże, może być jeszcze miejsce na dodatkową doskonałość. Ponieważ systemy detekcji oparte na immunoalkalinie i fosfatazie, które nie wymagają blokady endogennej peroksydazy, nie są obecnie używane w naszej pracy immunohistochemicznej, zastąpienie systemów detekcji opartych na immunoperoksydazie przez te pierwsze może jeszcze bardziej poprawić wyniki i odchudzić przepływ pracy laboratoryjnej.

Podsumowując, przedstawiamy zoptymalizowane i udoskonalone podejście do podwójnego barwienia czerwienią Kongo/immunohistochemii. Podejście to jest korzystne pod względem specyficzności, kosztów i ilości potrzebnej tkanki. Jego wymagania są minimalne i powinny umożliwić powszechne stosowanie.

Podziękowania

Thomas Menter jest wspierany przez Nuovo-Soldati Cancer Research Foundation, Vaduz, Liechtenstein.

Oświadczenie etyczne

Badanie obejmuje wyłącznie archiwalny materiał ludzki z Instytutu Patologii w Bazylei i zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Północno-Zachodniej i Centralnej Szwajcarii (EKNZ 2014-252). W badaniu nie brały udziału zwierzęta.

Oświadczenie o ujawnieniu informacji

Autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów.