ABTS

17.4 Phenols

Oksydacja klasycznego substratu Lac ABTS przez lakazę Tetracystis aeria jest szeroko rozpowszechniona w algach chlorofilnych. Na przykład, gatunki Moewusinia, w tym Chlamydomonas moewusii i T. aeria, wydzielają przypuszczalnie „prawdziwe” lakkazy. Substraty fenolowe są utleniane przez te enzymy optymalnie w pH neutralnym do zasadowego. Lakaza Tetracystis wydajnie przekształca inne związki, takie jak bisfenol A, 17α-etynyloestradiol, nonylofenol i triklosan w obecności ABTS jako mediatora redoks, podczas gdy antracen, weratryloalkohol i adlerol pozostają niezmienione. Możliwe, naturalne funkcje enzymów, takie jak synteza złożonych polimerów lub procesy detoksykacyjne, mogą wspomagać przetrwanie glonów w niekorzystnym środowisku. W zanieczyszczonych wodach powierzchniowych, zielone algi produkujące Lac mogą przyczynić się do środowiskowego rozkładu zanieczyszczeń fenolowych .

Putatywny Lac (CotA) z Bacillus pumilus MK001 sklonowany i wyrażony w E. coli okazał się termostabilny, wykazując okres półtrwania 60 minut w temperaturze 80°C i wykazuje potencjalne powinowactwo do kwasu ferulowego, kwasu kofeinowego i waniliny.

Fenole są znanymi inhibitorami dla celulazy i mikroorganizmów fermentacyjnych w procesach biorafinacji. Dodatek szelaku usuwa związki fenolowe, a następnie zmniejsza fazę lag mikroorganizmów fermentacyjnych. Zastosowanie Laca zmniejsza jednak uwalnianie glukozy podczas hydrolizy enzymatycznej. Proporcja ligniny i skład fenoli są kluczowymi czynnikami w hamowaniu celulazy, gdy hydroliza enzymatyczna jest połączona z detoksykacją Lac .

Jednym z interesujących zastosowań w biotechnologii środowiskowej jest immobilizacja Lac w celu wyeliminowania zanieczyszczeń fenolowych poprzez utlenianie. Nanocząstki zmatowionej krzemionki mają interesujący potencjał jako materiał nośny do immobilizacji Laca poprzez immobilizację wspomaganą sorpcją w perspektywie zastosowań takich jak eliminacja mikrozanieczyszczeń w fazach wodnych. Immobilizacja laku z rodzaju Leviathan, Coriolopsis polygonal, Cerrena unicolor, P. ostreatus i T. versicolor na nanocząstkach zmatowionej krzemionki, oddzielnie lub w kombinacji, powoduje wzrost aktywności w zakresie pH pomiędzy 3 a 7. Poszczególne laki różnią się optymalnym pH i powinowactwem do substratów. Wykorzystanie tych różnic pozwoliło na stworzenie nanobiokatalizatora dostosowanego do indywidualnych potrzeb, zdolnego do utleniania szerszego zakresu substratów niż enzymy rozpuszczone lub oddzielnie immobilizowane. Nanobiokatalizator ten ma potencjał do biochemicznego utleniania w eliminacji wielu docelowych zanieczyszczeń. Potwierdzono, że nanobiokatalizatory niekowokacyjne otrzymane przez immobilizację Laca na nanocząstkach krzemionki posiadają szerokie spektrum substratowe w zakresie degradacji rekowalcjalnych zanieczyszczeń, takich jak fenolowe EDC (bisfenol A).Podkreśla to potencjał kompozytów nanocząstek zmatowionej krzemionki/laksu dla zaawansowanego biologicznego oczyszczania ścieków.

Laki są zdolne do katalizowania jednoelektronowego utleniania związków fenolowych do rodnikowych produktów pośrednich, które mogą następnie łączyć się ze sobą poprzez wiązania kowalencyjne. Uważa się, że reakcje te odgrywają ważną rolę w procesie humifikacji i transformacji zanieczyszczeń zawierających fenolowe związki funkcjonalne w środowisku. Opracowano model reakcji poprzez integrację równań równowagi wiązania metal-HA i równań kinetycznych, przewidując szybkość transformacji triklosanu w obecności HA i jonów metali dwuwartościowych, w tym Ca2+, Mg2+, Cd2+, Co2+, Mn2+, Ba2+ i Zn2+ .

Hydroksylowane polibromowane etery difenylowe (OH-PBDE) są często znajdowane w biosferze morskiej jako pojawiające się zanieczyszczenia organiczne. Wytwarzanie OH-PBDE jest prawdopodobnie wynikiem sprzężenia rodników bromofenoksy, generowanych w katalizowanym przez Lac procesie utleniania 2,4-DBP lub 2,4,6-TBP. Przemiana bromofenoli przez Lac jest zależna od pH, a także od aktywności enzymatycznej. Biorąc pod uwagę obfitość 2,4-DBP i 2,4,6-TBP oraz filogenetyczne rozmieszczenie Lac w środowisku, katalizowana przez Lac przemiana bromofenoli może być potencjalnie ważną drogą dla naturalnej biosyntezy OH-PBDEs.

Phanerochaete chrysosporium należy do grupy grzybów degradujących ligninę, które wydzielają różne enzymy oksydoredukcyjne, w tym peroksydazę ligninową (LiP) i peroksydazę manganową (MnP). Jednakże wytwarzanie Lac u tego grzyba nie zostało w pełni wykazane i pozostaje kontrowersyjne. Koekspresja genu LacIIIb z T. versicolor i genu vpl2 z Pleurotus eryngii, a także endogennych genów mnp1 i lipH8 poprawiła koekspresję peroksydaz i lakaz nawet pięciokrotnie w porównaniu z gatunkami typu dzikiego. Szczepy transformowane mają szerokie spektrum w biotransformacji fenoli/niefenoli i wysoki procent w dekoloryzacji barwników syntetycznych w porównaniu ze szczepem rodzicielskim i są łatwym i wydajnym sposobem koekspresji laków i peroksydaz w odpowiednich gatunkach bazidiomycete.

Bisfenol A (BPA) jest substancją chemiczną zaburzającą gospodarkę hormonalną, która jest wszechobecna w środowisku ze względu na jej szerokie zastosowanie przemysłowe. Szlak pozakomórkowy najszerzej uprawianego grzyba na świecie (P. ostreatus) skutecznie rozkłada BPA. Ekspozycja na BPA nie ma szkodliwego wpływu na tego jadalnego grzyba.

Usuwanie BPA przez Lac w ciągłym enzymatycznym reaktorze membranowym oceniane w syntetycznych i rzeczywistych biologicznie oczyszczonych ściekach w konfiguracji reaktora opartej na reaktorze ze zbiornikiem mieszadłowym połączonym z membraną ceramiczną, wykazało prawie całkowite usunięcie BPA. Polimeryzacja i degradacja są prawdopodobnymi mechanizmami przekształcania BPA przez Lac .

Organizmy z gromady Basidiomycota mają ogromny potencjał bioremediacyjny dzięki swoim oksydazom fenolowym w degradacji fenoli. Lac i tyrozynaza występują głównie w T. versicolor i Agaricus bisporus, odpowiednio. Pojawili się nowi obiecujący producenci enzymów typu dzikiego, a także skonstruowano szereg szczepów rekombinowanych, opartych głównie na drożdżach lub szczepach Aspergillus jako gospodarzach. Konstrukty te pozwalają na zastosowanie ich do degradacji fenoli, polifenoli, krezoli, alkilofenoli, naftoli, bisfenoli oraz halogenowanych (bis)fenoli. Biologiczne i fizykochemiczne metody mogą być połączone, aby procesy te nadawały się do użytku przemysłowego. Peroksydazy roślinne mają silny potencjał przydatności do dekontaminacji ścieków zanieczyszczonych fenolami. Wykorzystanie na dużą skalę tych enzymów do oczyszczania ścieków z fenolu wymaga taniego, obfitego i łatwo dostępnego materiału zawierającego peroksydazy. Pulpa ziemniaczana, produkt odpadowy przemysłu skrobiowego, zawiera duże ilości aktywnych peroksydaz, a enzymy pulpy ziemniaczanej utrzymują swoją aktywność w pH 4-8 i są stabilne w szerokim zakresie temperatur. Wydajność usuwania fenolu z pulpy ziemniaczanej wynosi ponad 95% .

Immobilizowany Lac na nanoporowatych kulkach krzemionkowych degraduje ponad 90% 2,4-dinitrofenolu w krótkim czasie (12 godzin). Proces immobilizacji poprawia aktywność i trwałość Laca w degradacji zanieczyszczeń. Temperatury powyżej 50°C obniżają aktywność enzymu do około 60%. Natomiast pH i stężenie mediatora nie miały wpływu na aktywność enzymu. Kinetyka degradacji jest zgodna z równaniem Michaelisa-Mentena.

Wodne wysięki życicy trwałej (Lolium perenne) mogą degradować BPA zarówno w nieobecności, jak i w obecności naturalnej materii organicznej (NOM). W eksudatach z dodatkiem NOM proces degradacji jest dłuższy niż bez NOM. Aktywność peroksydazy i Laca w wysiękach sugerowała znaczący udział tych enzymów w degradacji BPA .

Związki organofluorowe stały się ważnym budulcem dla szerokiej gamy zaawansowanych materiałów, polimerów, agrochemikaliów i farmaceutyków. Opracowano koncepcję wprowadzania grupy trifluorometylowej do niezabezpieczonych fenoli przy użyciu biokatalizatora (Lac), tBuOOH oraz odczynnika Langlois’a lub siarczanu cynku Barana. Metoda ta opiera się na rekombinacji dwóch rodników: kationu rodnikowego fenolu generowanego bezpośrednio przez Lac oraz rodnika CF3. Katalizowana przez Lac trifluorometylacja przebiega w łagodnych warunkach i degraduje trifluorometylowo podstawione fenole, które były niedostępne klasycznymi metodami.

Lac-produkujący słodkowodny ascomycete Phoma sp. szczep UHH 5-1-03 ma potencjał do praktycznego usuwania mikrozanieczyszczeń. Bisfenol A (BPA), karbamazepina (CBZ), 17α-etynyloestradiol (EE2), diklofenak (DF), sulfametoksazol (SMX), techniczny nonylofenol (t-NP) i triklosan (TCS) są substratami w kolejności: EE2≫BPA>TCS>t-NP>DF>SMX>CBZ. Otrzymane metabolity wskazują na reakcje hydroksylacji, cyklizacji i dekarboksylacji, a także sprzęgania oksydacyjnego typowego dla reakcji Lac. Obserwacje te silnie sugerują, że zewnątrzkomórkowy Lac z Phoma sp. w znacznym stopniu przyczynia się do biotransformacji grzybów .

Ostatnio coraz więcej uwagi poświęca się nanobiokatalizie. Lac odwracalnie immobilizowany na mikrosferach magnetycznych Cu(ΙΙ)- i Mn(ΙΙ)-chelated był skuteczny w usuwaniu BPA z wody. W porównaniu do wolnego laku, stabilność termiczna i magazynowa unieruchomionego laku uległa znacznej poprawie. Ponad 85% BPA zostało usunięte w optymalnych warunkach .

Jednakże używanie enzymów w roztworze do uzdatniania wody ma ograniczenia w postaci braku możliwości ponownego wykorzystania, krótkiego czasu życia enzymu i wysokich kosztów jednorazowego użycia. Chen i in. opracowali nowy typ biokatalizatora poprzez immobilizację grzybów Lac na powierzchni komórek drożdży przy użyciu technik biologii syntetycznej. Biokatalizator ten określany jest jako surface display Lac (SDL) i może być ponownie użyty z wysoką stabilnością, ponieważ zachował 74% początkowej aktywności po ośmiu powtórzonych reakcjach wsadowych. Efektywność SDL i dowód koncepcji w przetwarzaniu zanieczyszczeń emerging concern zostały zademonstrowane w przypadku bisfenolu A i sulfametoksazolu.