ADAR

C Enzyme-Substrate Recognition

Niewiele wiadomo o tym, jak ADAR oddziałują ze swoimi specyficznymi substratami i jak domeny wiążące RNA i domena katalityczna współpracują ze sobą podczas reakcji redagowania. W przeciwieństwie do mechanizmów redagowania C-to-U RNA, które wykorzystują motyw sekwencji pierwotnej w pobliżu miejsca redagowania jako krytyczny czynnik determinujący rozpoznanie substratu (Niswender, 1998), enzymy ADAR nie posiadają żadnej widocznej wewnętrznej specyficzności sekwencji. W rzeczywistości, gdy mają do dyspozycji całkowicie dwuniciowe cząsteczki RNA, zarówno ADAR1 jak i ADAR2 deaminują prawie bez ograniczeń do 50-60% wszystkich adenozyny w sekwencji (Nishikura, 2010). Jednakże obecność pętli, niedopasowań i wybrzuszeń w strukturze substratu RNA zwiększa selektywność miejsca i, jak zaobserwowano w przypadku niektórych fizjologicznych celów ADAR, skomplikowane zagięcie RNA takiego substratu wydaje się ograniczać dostęp do wiązania na RNA i produktywnej katalizy często do pojedynczej adenozyny (Nishikura, 2010). Dlatego większość specyficzności docelowej edycji A-to-I może znajdować się w trójwymiarowym fałdzie substratu. Jednak ostatnie badania strukturalne oparte na NMR domen wiążących RNA białka ADAR w kompleksie z minimalnymi substratami RNA wskazują, że poszczególne domeny wiążące dsRNA mogą być również zaangażowane w kontakty specyficzne dla sekwencji, które mogą przyczyniać się do selektywności dla pewnych celów RNA w stosunku do innych (Stefl i in., 2006, 2011).

Inną właściwością ADAR, która może mieć implikacje dla rozpoznawania substratów i interakcji jest świadomość, że dla produktywnej i wysokiej aktywności deaminacji, białka ADAR tworzą dimer na substracie (Jaikaran i in., 2002; Cho i in., 2003; Gallo i in., 2003; Poulsen i in., 2006). Potencjalnie, pomiędzy białkami ADAR mogą tworzyć się homo- i heterodimery (Chilibeck i in., 2006) i dlatego stanowią one kolejną warstwę regulacji wpływającą na specyficzne rozpoznawanie substratów oraz aktywność redagowania RNA. Ponieważ jak dotąd nie jest znany cel edycji dla ADAR3, a białko to nie wykazuje żadnej aktywności enzymatycznej w standardowych testach deaminazowych (Melcher i in., 1996a; Chen i in., 2000), sugeruje się, że jego rola ma charakter regulacyjny poprzez heterodimeryzację z innymi ADAR.

Powiązane z tworzeniem dimerów ADAR dla ogólnej aktywności edycyjnej jest spostrzeżenie, że pewne zdarzenia związane z edycją RNA zachodzące w obrębie tego samego substratu wykazują dodatnie lub ujemne sprzężenie. Na przykład, adenozyny bezpośrednio sąsiadujące ze sobą lub te, które znajdują się po tej samej stronie struktury dupleksu RNA (odległość około 11 nt w obrębie A-formy RNA) często wykazują sprzężenie w edycji przez ADAR, prawdopodobnie z powodu ich bliskości do miejsca katalitycznego enzymu w przestrzeni (Koeris i in., 2005; Enstero i in., 2009).

Mimo tych spostrzeżeń, obecnie nadal nie jest możliwe przewidzenie miejsca edycji RNA na podstawie pierwotnej sekwencji RNA. Wynika to głównie ze złożonej natury struktur trzeciorzędowych RNA i ich dynamicznego zachowania. Nawet jeśli weźmiemy pod uwagę, że domeny wiążące dsRNA mogą być w stanie rozróżniać pewne motywy sekwencji pierwotnej od innych, to niewielkie zmiany w otaczającej sekwencji pierwotnej lub strukturze drugorzędowej i trzeciorzędowej mogą modulować lub nawet unieważniać specyficzne dla sekwencji kontakty. W rezultacie, próby opracowania algorytmów wyszukiwania łączących kilka cech molekularnych (w tym prawdopodobieństwo parowania zasad, środowisko sekwencji, konserwacja sekwencji), o których wiadomo, że wpływają na prawdopodobieństwo lub aktywność edycji, w celu przewidzenia potencjalnych miejsc edycji, doprowadziły do powstania długich list pozycji kandydackich w mRNA, ale niewiele nowych, selektywnych i wysokopoziomowych miejsc modyfikacji zostało zatwierdzonych jako bona fide cele in vivo (Clutterbuck i in., 2005; Levanon i in., 2005; Gommans i in., 2008; Sie i Maas, 2009). Dychotomia pomiędzy wykryciem tysięcy prawdopodobnych miejsc edycji opartych na cechach molekularnych w pre-mRNA a niedostatkiem miejsc wysokopoziomowego przekodowania sugeruje, że albo algorytmy przewidywania mają wysoki wskaźnik fałszywych pozytywów i większość z tych pozycji nie jest edytowana przez ADAR, albo problemem jest eksperymentalne wykrywanie edycji RNA i dla wielu rzeczywistych miejsc edycji badane są niewłaściwe tkanki (edycja specyficzna dla typu komórkowego) lub są one badane w niewłaściwym momencie (edycja regulowana). Alternatywnie, poziomy edycji in vivo większości miejsc są tak małe, że obecne metody detekcji nie są wystarczająco czułe, aby udowodnić lub obalić edycję.