Adventitious Root
Methods for Rooting Microshoots
Jeśli mikrorosty nie tworzą korzeni podczas etapu rozmnażania, muszą być poddane specjalnym zabiegom w celu zainicjowania i wzrostu systemu korzeniowego. Mikroodrosty mogą być ukorzeniane in vitro, a następnie aklimatyzowane do środowiska otoczenia, lub mogą być ukorzeniane ex vitro, łącząc w ten sposób ukorzenianie i aklimatyzację.
Łatwość i wskaźnik powodzenia ukorzeniania decydują o tym, która metoda jest stosowana dla danej odmiany. Bardziej opłacalną metodą jest ukorzenianie mikro odrostów ex vitro. Ukorzenianie ex vitro oszczędza dodatkowy transfer in vitro na pożywkę ukorzeniającą i przyspiesza aklimatyzację, czyniąc mikrorozmnażanie bardziej efektywnym. Ukorzenianie in vitro jest stosowane, gdy brakuje urządzeń do ukorzeniania i aklimatyzacji ex vitro, gdy wskaźniki sukcesu są niskie przy ukorzenianiu ex vitro, oraz według uznania kierownika laboratorium.
Ukorzenianie in vitro. Składniki pożywki i warunki inkubacji są łatwe do zmiany, gdy warunki in vitro są stosowane do promowania inicjacji korzeni i wczesnego rozwoju. Formuła soli odżywczych może pozostać taka sama, może być zmieniona lub zmniejszona, często do połowy mocy makrosoli, a wilgotność względna zmniejszona przez zastosowanie wentylowanych pokryw (Rysunek 5). Warunki inkubacji kultury światła i temperatury mogą być zmienione dla ukorzeniania. Wiele mikrorośli jest inkubowanych w ciemności przez pewien okres w celu inicjacji korzeni, a następnie przenoszonych do warunków oświetlonych.
Ryc. 5. Chirurgiczna taśma z mikroporami zapewnia wentylację tego naczynia z ukorzenionymi pędami; pomaga to zmniejszyć wilgotność względną i przygotowuje nowe rośliny do środowiska szklarniowego.
Podłoże odżywcze do ukorzeniania, na którym umieszcza się świeżo ścięte mikrorośliny, zawiera zazwyczaj auksynę. Zazwyczaj mikromolarne stężenia IBA i/lub NAA są dodawane do pożywki przed autoklawowaniem. Stężenie auksyny zależy od gatunku i odmiany. Informacje te są zazwyczaj dostępne online przy użyciu wyszukiwarki naukowej, takiej jak Google Scholar http://scholar.google.com/. Zazwyczaj należy podać nazwę rośliny, słowa „vitro” i „korzeń” (lub korzeń przybyszowy) w wyszukiwarkę, aby uzyskać konkretne informacje. Jeśli literatura nie ma dla danej rośliny, użyj bliskich krewnych w poszukiwaniu, aby określić, jak oni odpowiedzieli.
Ponieważ uznaje się, że te same stężenia auksyny, które stymulują inicjację korzeni przybyszowych mogą hamować rozwój korzeni, niektórzy używają podejścia dwóch mediów. Kiedy mikrorośla Cotinus coggygria były hodowane na pożywce zawierającej 10 µM IBA przez 5 dni przed przeniesieniem na pożywkę bez auksyny, 100% ukorzeniło się, podczas gdy tylko 40% ukorzeniło się przy ciągłej hodowli na pożywce z 10 µM IBA (Metivier i in., 2007). Padilla i Burgos (2010) hodowali mikrozrosty oliwek na pożywce zawierającej do 4 µM IBA przez 2 tygodnie, a następnie przenieśli je na pożywkę bazową bez auksyny, co spowodowało ukorzenienie 65-93%, w zależności od odmiany.
W niektórych przypadkach roztwory IBA były stosowane na mikrozrosty jako dip bazowy przez minutę lub dłużej. Tsvetkov i wsp. (2007) uzyskali najlepsze ukorzenienie mikrozrostów Sorbus domestica, gdy były one zanurzone w roztworze 14,8 µM IBA przez 80 s przed umieszczeniem na podłożu podstawowym.
Ciemność podczas lub przed ukorzenianiem może zwiększyć sukces ukorzeniania i synchroniczność ukorzeniania między mikrozrostami. Etiolacja, rozwój pędów bez dostępu światła, zwiększy kompetencje komórek do ukorzeniania przypadkowego (Murray i in., 1994). Gdy mikropędy orzecha włoskiego były etiolowane, ukorzenianie było lepsze z szybszym pojawianiem się korzeni niż z zielonych pędów (Leslie i in., 2010); jednak pędy etiolowane były kruche i wymagały bardziej ostrożnego traktowania.
Kulturowanie zielonych mikropędów na pożywce ukorzeniającej w ciemności przez stosunkowo krótki okres może znacznie poprawić ukorzenianie. Okres ciemności przez 4-7 dni na pożywce Murashige i Skoog, zawierającej 1 µM floroglucynolu i 1,4 µM IBA, po którym następowała inkubacja w warunkach oświetlonych, powodował lepsze ukorzenianie się mikrozrostów jabłoni 'Delicious’ niż w przypadku hodowli tylko w świetle lub w ciemności przez dłuższy okres (Zimmerman, 1984). Podczas hodowli mikrozrostów podkładki jabłoni 'MM106′ na pożywce z 4 µM IBA w ciemności przez 0-10 dni, na podstawie badań histologicznych stwierdzono, że indukcja korzeni zachodziła w ciągu pierwszych 3 dni lub krócej w ciemności, a stożkowate primordia korzeni były widoczne do 7 dnia (Naija i in., 2008). Czas traktowania w ciemności jest krytyczny i może wymagać określenia dla każdej uprawy lub genotypu; niemniej jednak, może on znacznie zwiększyć sukces ukorzeniania.
Niektóre gatunki ukorzeniają się najlepiej, jeśli wierzchołki mikrorośli są oświetlone, a część podstawowa w pożywce jest w ciemności, podobnie jak w przypadku ukorzeniania sadzonek w szklarni w warunkach mgły. Zaciemnienie pożywki można osiągnąć przez pomalowanie zewnętrznej strony naczyń hodowlanych na czarno do poziomu nieco powyżej poziomu pożywki i przykrycie pożywki sterylnym granulatem poliwęglanowym lub inną substancją wykluczającą światło lub zaciemnienie samej pożywki przez dodanie węgla aktywnego. Czasami do ukorzeniania in vitro stosuje się pożywkę szklarniową, taką jak wermikulit, która również wyklucza światło, po uprzednim zwilżeniu jej pożywką.
Wykazano, że przyciemnienie tylko podstawy mikrorośli zwiększyło ukorzenianie migdałów, brzoskwiń i oliwek (Rugini, 1988) oraz jabłek (Mencuccini i Rugini, 1993) w porównaniu z kontrolami inkubowanymi w ciemności lub pod lampami. Jednakże w oddzielnych badaniach Mencuccini i Rugini (1993) stwierdzili, że zaciemnienie podłoża miało niewielki wpływ na ukorzenianie mikrorośli migdałowca, moreli, kasztanowca, jojoby i oliwki, a hamowało je w przypadku orzecha włoskiego. Dlatego, jeśli sukces ukorzeniania jest poniżej pożądanego, przyciemnienie podstawy może być pomocne.
Ukorzenianie ex vitro. Jeśli procent ukorzeniania jest podobny, ukorzenianie ex vitro może być bardziej wydajne i opłacalne niż ukorzenianie in vitro (Leva, 2011). Koszty są wyższe przy ukorzenianiu in vitro ze względu na składniki, czas przygotowania, autoklawowanie pożywek, pracę przy przenoszeniu kultur i przestrzeni inkubacyjnej. Przeniesienie do szklarni jest podobne pomiędzy ukorzenianiem in vitro i ex vitro, a czas przesadzania może być podobny lub wolniejszy, gdy na mikroroślinach znajdują się korzenie (Rysunki 4 i 6). Ukorzenianie ex vitro jest bardziej efektywne. Stwierdzono, że jakość korzeni mikroroślin orzecha włoskiego jest lepsza, gdy korzenie tworzą się ex vitro w warunkach mgły niż in vitro w podłożu żelowym (Leslie i in., 2010).
Ryc. 6. (a) i (b) Ukorzenione in vitro mikropropagowane sadzonki czereśni gotowe do przesadzenia do szklarniowego podłoża z torfu sfagnum przed umieszczeniem w warunkach wysokiej wilgotności względnej w celu aklimatyzacji. (c) Sadzonki czereśni w trakcie sadzenia jako pierwszy etap aklimatyzacji w szklarni. (d) Sadzonki orzecha włoskiego sadzone w mieszkaniu przed umieszczeniem w warunkach wysokiej wilgotności względnej w szklarni.
Ukorzenianie ex vitro może być ulepszeniem ukorzeniania in vitro. Chociaż mikrozrosty Gardenii jasminoides ukorzeniały się w ciągu 10 dni, w porównaniu z 14 dniami dla mikrozrostów ex vitro, wszystkie mikrozrosty ukorzenione ex vitro przeżyły aklimatyzację w porównaniu z 80% przeżywalnością mikrozrostów ukorzenionych in vitro (Hatzilazarou i in., 2006). Słabsze przeżycie mikrozrostów ukorzenionych in vitro w porównaniu do mikrozrostów ukorzenionych ex vitro odnotowano także dla orzecha włoskiego (Leslie i in., 2010).
Może być konieczne traktowanie mikrozrostów auksyną przed posadzeniem w podłożu do ukorzeniania w przypadku ukorzeniania ex vitro. Mikrostopy pistacji traktowane 2% IBA w talku ukorzeniły się ex vitro w 79% w porównaniu do 48% ukorzenienia dla kontroli (Benmahioul i in., 2012).
Poprawę ukorzenienia ex vitro można także uzyskać stosując auksynę w postaci płynnego dipu nałożonego na podstawową część mikrostopów. Piętnastominutowy impuls w 250 µM IBA spowodował ukorzenienie 90% mikrorostów drzewa gatunku Melia azedarach w porównaniu z brakiem ukorzenienia mikrorostów kontrolnych (Husain i Anis, 2009). Zanurzenie na 2 godziny w wodnym roztworze 588 µM IBA spowodowało ukorzenienie 90% mikroodrostów Malus zumi w porównaniu z 20% ukorzenieniem kontroli (Xu i in., 2008).
Prawdopodobnie z powodu powrotu do młodości, wydłużenie czasu namnażania in vitro może zwiększyć ukorzenienie mikroodrostów. Leva i Petruccelli (2012) testowali ukorzenianie aż do siedmiu podhodowli i stwierdzili, że ukorzenianie było najlepsze po siódmej podhodowli.
Urządzenia, gatunek, metoda wysyłki, zapotrzebowanie klientów i preferencje kierownictwa dyktują sposób ukorzeniania mikro odrostów. Gatunki, które ukorzeniają się bardzo łatwo lub ukorzeniają się podczas fazy proliferacji pędu mogą być szybko zaaklimatyzowane do środowiska ex vitro. Szczególną uwagę poświęca się gatunkom trudnym, jeśli chodzi o oświetlenie, traktowanie auksynami, ukorzenianie in vitro lub ex vitro i inne czynniki. Klony trudne do ukorzenienia wymagają od klientów wyższych cen, ponieważ ukorzenianie jest przeszkodą w efektywnej produkcji. Ukorzenianie można usprawnić, jeśli potraktuje się je jako wieloetapowy proces nabywania kompetencji, inicjacji korzeni i późniejszego wzrostu korzeni. Należy rozważyć wszystkie te etapy i zająć się nimi, zwłaszcza w przypadku trudniejszych do ukorzenienia klonów.