Agregacja amfoliny na heparynie i innych kwaśnych polisacharydach w ogniskowaniu izoelektrycznym

Mechanizm kompleksowania Amfoliny o zakresie pI 3,5–5 z heparyną w ogniskowaniu izoelektrycznym został zbadany techniką wiązania barwnika przy różnych wartościach pH w roztworze. Nie ma znaczącej interakcji pomiędzy heparyną i amfoliną w pH 6,7. Słabe lub selektywne wiązanie występuje przy pH 5,1, a bardzo silne przy pH 3,5. W tym ostatnim układzie składniki amfoliny wydają się zachowywać jak polikacje ze względu na uporządkowaną sekwencję dodatnich ładunków, każdy oddalony od siebie o dwie grupy metylenowe, co sprzyja silnemu wiązaniu z polianionami. Ponadto, wydaje się, że istnieją zmienne stechiometrie dla silnego wiązania pomiędzy heparyną i amfoliną, w zależności od ich względnych ilości. Postuluje się, że przy niskim stosunku heparyny do amfoliny (nadmiar amfoliny) agregacja przebiega prostopadle do łańcucha heparyny, przy czym końcowy ładunek amoniowy każdej cząsteczki amfoliny neutralizuje jeden ładunek ujemny wzdłuż cząsteczki heparyny; przy wyższych stosunkach (nadmiar heparyny) związany odcinek amfoliny układa się równolegle do cząsteczki heparyny, tak że średnio jeden składnik amfoliny neutralizuje ok. trzech ładunków ujemnych. Pasmowanie heparyny w ogniskowaniu izoelektrycznym w zakresie pH 3,0–4,5 można wyjaśnić agregacją różnych składników na heparynie w ilościach zależnych od ładunku netto na gatunku Amfoliny w danym pH oraz od zmieniających się stechiometrii jako funkcji zmiany stosunku heparyny do Amfoliny wzdłuż gradientu pH. Wiązanie amfoliny z poligalakturonianem wykazano również przy nadmiarze amfoliny w zakresie pH zależnym od stopnia protonowania grup karboksylowych tego kwaśnego polisacharydu, jak również od dodatniego ładunku netto amfoliny. Agregacja obserwowana przy pH 4,2–4,5 doprowadziła do przewidywania i późniejszego wykazania, że poligalakturonian również wykazywałby wiązanie przy ogniskowaniu izoelektrycznym. Potwierdza to hipotezę, że agregacja amfoliny na polianionach o wystarczającej gęstości ładunku jest zjawiskiem ogólnym, które może prowadzić do niepożądanego wiązania niektórych polimerów w odpowiednich zakresach pH w ogniskowaniu izoelektrycznym. Na podstawie ich zachowania w ogniskowaniu izoelektrycznym przy pH 3,0–4,5, siła agregacji badanych polianionów wydaje się być heparyna A = heparyna B większa niż poliglutaminian większa niż zredukowana karboksylowa heparyna B większa niż kwas poligalakturonowy.