Alpha-2 Adrenergic Receptor Agonists Block Stress-Induced Reinstatement of Cocaine Seeking

Experiment 1: Effects of Clonidine, Lofexidine and Guanabenz on Footshock-Induced NE Release

Subjects

Przedmiotami były samce szczurów Long-Evans (Charles River, Quebec) ważące 300-350 g na początku doświadczenia. Przez cały czas trwania eksperymentu zwierzęta przebywały w pomieszczeniu kolonii o kontrolowanej wilgotności i temperaturze w odwróconym schemacie światło-ciemność (światła włączone w godzinach 1730-0530) i miały swobodny dostęp do standardowej karmy dla szczurów laboratoryjnych i wody. Procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi CCAC i zostały zatwierdzone przez Animal Care Committee, Concordia University.

Chirurgia

Przed operacją szczury zostały znieczulone pentobarbitalem sodu (65 mg/kg, i.p.) i wstrzyknięto im siarczan atropiny (0,6 mg/ml; 0,2 ml/szczura, SC) i antybiotyk (Penlong, Rogar/STB Inc.; 0,1 ml/szczura, i.m.). Kaniule prowadzące (20 gauge; Plastics One) zostały wszczepione w celu późniejszego wprowadzenia sond dializacyjnych; jedną umieszczono w PFC, a drugą w AMG w przeciwległych półkulach. Zwierzęta używane do badania efektów działania guanabenzu otrzymały pojedynczą kaniulę prowadzącą skierowaną do PFC. Półkula, do której wszczepiono odpowiednie kaniule prowadzące, była zrównoważona dla wszystkich metod leczenia. Zastosowano następujące współrzędne stereotaksji (względem bregmy i powierzchni czaszki): AMG, AP -3,0 mm, ML ± 4,5 mm, DV -6,7 mm; PFC, AP + 3,2 mm, ML ± 0,5 mm, DV -1,5 mm (Paxinos i Watson 1997). Po wprowadzeniu trzon sondy dializacyjnej wystawał na 1 mm od kaniul prowadzących. Implantowane kaniule prowadzące mocowano do czaszki za pomocą śrub ze stali nierdzewnej i cementu dentystycznego. Kaniule prowadzące zamykano za pomocą wkręcanych obduratorów. Wszystkie zwierzęta zostały odesłane do pomieszczenia kolonii na okres rekonwalescencji nie krótszy niż 1 tydzień przed badaniem.

Mikrodializa

Mikrodializę przeprowadzono w czterech sześciokątnych komorach badawczych (42 × 39 × 33,5 cm) zbudowanych z pleksiglasu z drewnianymi sufitami i podłogami z prętów ze stali nierdzewnej. Wokół każdej komory zaciągnięto ciemne zasłony, a oświetlenie zapewnione było w cyklu odwróconym przez napowietrzne żarówki (15 W). Sonda dializacyjna składała się z 1,8 mm (AMG) lub 3,5 mm (PFC) długości półprzepuszczalnej błony dializacyjnej (Spectra/Por; 240 μm o.d., 13000 M.W. cutoff), zamkniętej na jednym końcu i przymocowanej na drugim do 19 mm długości rurki ze stali nierdzewnej o grubości 26 gauge. Rurka PE-20 o długości od 40 do 50 cm połączyła drugi koniec wałka ze stali nierdzewnej z obrotnicą infuzyjną umieszczoną nad komorą do badań, która z kolei była połączona rurką PE-20 z pompą infuzyjną o zmiennej prędkości. Wewnętrznie przez sondę przebiegała rurka z topionej krzemionki o małej średnicy, której jeden koniec znajdował się w odległości 0,5 mm od końcówki sondy, a drugi wychodził z rurki PE 35 cm poniżej krętlika infuzyjnego. Zewnętrzna długość rurki PE-20 była chroniona przed uszkodzeniem przez stalowe osłonki sprężynowe. Sondy zostały zaprojektowane tak, aby cała długość półprzepuszczalnej membrany rozciągała się poniżej końcówki kaniuli prowadzącej.

Oddzielne grupy zwierząt zostały wykorzystane do zbadania wpływu każdego z badanych leków. W obrębie każdego oddziału, każde zwierzę zostało losowo przypisane do warunku leczenia. Zwierzęta, które otrzymały iniekcje pojazdu były prowadzone w każdym składzie, ale zostały połączone w jedną grupę do analizy statystycznej. Ostateczne wielkości grup (PFC/ AMG) były następujące: pojazd (n = 15/17), klonidyna 20 μg/kg (n = 7/6), klonidyna 40 μg/kg (n = 9/5), lofexidyna 75 μg/kg (n=6/6), lofexidyna 150 μg/kg (n = 5/6), guanabenz 640 μg/kg (n = 4, PFC). Z wyjątkiem zwierząt otrzymujących guanabenz, wszyscy badani byli dializowani dwukrotnie, raz w PFC i raz w AMG z przerwą 3-4 tygodni pomiędzy badaniami.

Sondy zakładano dzień przed rozpoczęciem badania mikrodializy. Aby zapobiec okluzji, sztuczny CSF (145 mM Na+, 2,7 mM K+, 1,22 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+, 150 mM Cl-, 0,2 mM askorbinianu, 2 mM Na2HPO4, pH 7,4 ± 0,1) perfundowano przez noc z szybkością 0,06 μl/min. Pobieranie próbek dializatu i monitorowanie aktywności rozpoczęto następnego dnia rano. Szybkość przepływu dializatu zwiększono do 0,6 μl/min, a podstawowe próbki dializatu (∼ 12 μl/próbkę) pobierano co 20 min. Próbki były zbierane do momentu osiągnięcia stabilnej linii podstawowej, zdefiniowanej jako minimum trzy kolejne próbki, w których poziomy NE w dializacie różniły się o ±10%. Po ustaleniu stabilnego poziomu podstawowego NE, wszystkie zwierzęta otrzymały iniekcję i.p. (1 ml/kg) odpowiedniego leku lub nośnika, która została podana 40 min przed 10-minutowym okresem wstrząsów stóp. Wstrząsy były dostarczane w zmiennym harmonogramie czasowym w średnim odstępie 40 sekund (zakres 10-70 sekund); każdy wstrząs (0,6 mA) trwał 0,5 sekundy. Próbki były zbierane przez kolejne 120 minut (6 próbek). Próbki były natychmiast analizowane przy użyciu jednego z dwóch podobnych systemów wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-EC). Próbki (10 μl) zostały załadowane na kolumny z fazą odwróconą (15 × 0,46 cm; HAISIL C18, 5 μm; Sci. Products & Equipment, Concord, Ontario) przez ręczne porty iniekcyjne (Reodyne 7125; pętla 20 μl); prądy redukcji i utleniania dla NE, kwasu dihydroksyfenylooctowego (DOPAC), kwasu 5-hydoksyindolooctowego (5-HIAA) i kwasu homowanilinowego (HVA) mierzono za pomocą dwukanałowych detektorów kulometrycznych ESA (Coulochem 5100, z celą kondycjonującą model 5021 i celą analityczną model 5011, Sci. Products & Equipment). Prądy dla NE były mierzone niezależnie od prądów dla DOPAC i HVA przy użyciu oddzielnych kanałów detektorów Coulochem. Fazy ruchome (octan sodu 36 mM, SOS 3,1 mM, EDTA 100 μM, 5% acetonitryl, dostosowane do pH 3,7 za pomocą lodowatego kwasu octowego) krążyły w każdym układzie zamkniętym z szybkością przepływu 1,4 ml/min za pomocą pomp Waters 510 HPLC. Piki uzyskane dla NE, DOPAC i HVA były integrowane i kwantyfikowane przez EZChrom Chromatography Data System (Sci. Products & Equipment). Próbki dializatu od poszczególnych szczurów zawsze były analizowane w tym samym systemie HPLC-EC, a przypisanie zwierząt do każdego systemu było zrównoważone we wszystkich grupach leczenia. Żywność została usunięta z komór przed pobraniem próbek, ale dostępna była rurka do picia wody. Po zakończeniu badania, potwierdzenie prawidłowego umieszczenia sondy określano na podstawie badania 30 μm przekrojów wyciętych przez miejsca umieszczenia sondy zabarwionych fioletem krezolu.

Eksperyment 2: Effects of Clonidine on Footshock- and Cocaine-Induced Reinstatement

Przedmioty

Przedmiotami było 25 samców szczurów rasy Long-Evans (Charles River, Quebec) ważących 350-425 g na początku doświadczenia. Zwierzęta utrzymywano zgodnie z opisem w doświadczeniu 1.

Chirurgia

Zwierzęta przygotowano do operacji zgodnie z opisem w doświadczeniu 1. Do prawej żyły szyjnej wszczepiono cewnik dożylny (Dow Corning). Do żyły wprowadzono rurkę silastikową o długości 3 cm (średnica wewnętrzna 0,30 mm, średnica zewnętrzna 0,64 mm) i połączono ją rurką termokurczliwą z rurką silastikową o długości 9 cm (średnica wewnętrzna 0,51 mm, średnica zewnętrzna 0,94 mm), którą wprowadzono podskórnie do górnej części czaszki. Cewnik przymocowano do żyły szwami jedwabnymi i wyprowadzono do łącznika (zmodyfikowana kaniula 22 gauge; Plastics One, Roanoke, VA), który przymocowano do czaszki za pomocą śrub jubilerskich i cementu dentystycznego; na otwór kaniuli nałożono plastikowy kapturek. Zwierzęta miały 1-2 tygodnie na dojście do siebie po operacji.

Aparatura

Komory do samoadministrowania używane w eksperymentach były wyposażone w chowaną dźwignię (Med Associates, St Albans, VT) i nie chowaną dźwignię „atrapę”. Obie dźwignie znajdowały się na wysokości 9 cm nad podłogą. Pompa infuzyjna (Razel Scientific Instruments, Stamford, CT) była aktywowana przez odpowiedzi na wysuwaną lub „aktywną” dźwignię. Odpowiedzi na atrapie dźwigni były rejestrowane, ale nie powodowały aktywacji pompy. Roztwór leku był dostarczany przez okres 10 s w objętości 65 μl. Przez cały czas trwania infuzji, tuż nad aktywną dźwignią świeciło się białe światło stymulujące, a dodatkowe odpowiedzi w tym czasie były rejestrowane, ale nie skutkowały reaktywacją pompy. Każda komora do samopodawania była wyposażona w urządzenie do dostarczania stałego prądu, przerywanego, nieuchronnego, elektrycznego wstrząsu stóp poprzez scrambler do podłogi siatki (Grason-Stadler Generator #E1064GS lub Med Associates). Wstrząsy stóp były dostarczane przez 15 min zgodnie ze zmiennym harmonogramem czasowym w średnim odstępie 40 sekund (zakres 10-70 sekund). Czas trwania każdego wstrząsu (0,6 mA) wynosił 0,5 sekundy. Taka intensywność wstrząsów stóp została stwierdzona przy użyciu naszej aparatury jako minimalna wymagana do wywołania wiarygodnej reinstatement.

Leki

Cocaine HCl otrzymano z BDH Chemicals (Toronto, Kanada) i rozpuszczono w soli fizjologicznej. Klonidyna HCl została zakupiona od Sigma (St Louis, MO) i została rozpuszczona w soli fizjologicznej i wstrzyknięta i.p. (0, 20, i 40 μg/kg).

Procedura

Faza 1: Trening. Szczury szkolono w zakresie samoadministrowania kokainą HCl (0,5 mg/kg/infuzję, i.v.) zgodnie z harmonogramem wzmocnienia o stałym stosunku 1 podczas jednej codziennej 3-h sesji samoadministrowania. Każdego dnia połowa zwierząt była wprowadzana do komór operacyjnych w celu odbycia sesji samopodawania rano, około trzy godziny po wyłączeniu światła, a połowa zwierząt była wprowadzana do komór po południu, około siedem godzin po wyłączeniu światła. Grupa zwierząt przydzielonych do sesji porannych i popołudniowych zmieniała się codziennie, tak że do końca szkolenia wszystkie zwierzęta otrzymały taką samą liczbę sesji samodopuszczania w obu porach. Ważne było, aby wszystkie zwierzęta miały podobne doświadczenie w samokontroli wcześnie i późno w ciągu dnia, ponieważ podczas Fazy 2 wszystkie zwierzęta otrzymywały sesje ekstynkcji w godzinach porannych, po których następowała sesja testowa, która zazwyczaj miała miejsce w godzinach popołudniowych. Na początku każdej sesji, na 10 sekund przed wprowadzeniem do klatki wysuwanej dźwigni, zapalano czerwone światło domowe. Światło tuż nad aktywną dźwignią świeciło się przez początkowe 30 sekund po prezentacji dźwigni. Światło domowe pozostawało zapalone przez cały czas trwania sesji. Jak wskazano wcześniej, odpowiedzi na aktywną dźwignię powodowały aktywację pompy infuzyjnej i zapalenie światła nad dźwignią na 10 sekund podawania leku. Dodatkowe naciśnięcia dźwigni podczas okresu podawania leku były rejestrowane, ale nie powodowały reaktywacji pompy. Warunki treningowe utrzymywano przez 10 do 12 dni. Po zakończeniu szkolenia, zwierzęta pozostawiano w pokoju kolonijnym na okres od 7 do 13 dni. Następnie przeprowadzono ekstynkcję i testy. W tym doświadczeniu oraz w doświadczeniu 3B, grupom zwierząt przypisano różne dawki badanych leków. Wszystkie zwierzęta w każdej grupie zostały następnie poddane trzem warunkom testowym; sól fizjologiczna, kokaina i wstrząs nożny.

Faza 2: Wygaszanie i testowanie. Podczas ekstynkcji i testowania, które miały miejsce w ciągu czterech kolejnych dni, zwierzęta przebywały 24 godziny na dobę w komorach samoadministracyjnych. Jedzenie i woda były swobodnie dostępne dla zwierząt, z wyjątkiem codziennych sesji ekstynkcji i testowania. Zwierzęta wprowadzano do komór wieczorem w dniu poprzedzającym pierwszy dzień wygaszania i testowania. Ponieważ podczas fazy treningowej każdego dnia prowadzono dwie oddzielne grupy szczurów, jedna grupa zwierząt była testowana w ciągu pierwszych czterech dni fazy 2, a druga grupa zwierząt była testowana w ciągu kolejnych czterech dni. Podczas ekstynkcji i testowania utrzymywano wszystkie warunki, które były obecne podczas treningu, z wyjątkiem tego, że naciśnięcia dźwigni nie powodowały wlewów kokainy.

W tym i wszystkich kolejnych eksperymentach z przywróceniem, zwierzęta otrzymywały kilka codziennych 1-h sesji ekstynkcji oddzielonych od siebie okresami interwałowymi, w których dźwignia była wycofana. W dniu 1, zwierzęta otrzymały cztery sesje wygaszania; w dniach 2-4, zwierzęta otrzymały dwie do trzech sesji wygaszania, wystarczające do ustalenia podstawowego poziomu reagowania 15 lub mniej odpowiedzi w ciągu jednej godziny, a następnie 180 min sesji testowej. Czas trwania okresów przejściowych był stały dla każdego doświadczenia i odpowiadał opóźnieniu wymaganemu do absorpcji leku między wstrzyknięciami poprzedzającymi a rozpoczęciem badania. W obecnym eksperymencie, czas trwania okresów interwencyjnych wynosił 40 min.

Podczas badania, oddzielne grupy zwierząt były wstępnie traktowane albo 0, 20, lub 40 μg/kg, i.p., klonidyny przed każdym z trzech testów na przywrócenie (sól fizjologiczna, kokaina, i wstrząs nożny), podawanych w kolejnych dniach i w kolejności równoważonej. Klonidyna była wstrzykiwana 40 min przed włożeniem dźwigni. W przypadku testów primingu z solą fizjologiczną i kokainą, zwierzętom wstrzykiwano bezwarunkowo, i.p., sól fizjologiczną lub kokainę (20 mg/kg) na 5 min przed wprowadzeniem dźwigni. W testach wstrząsów nożnych zwierzęta poddawane były 15-minutowemu krótkiemu przerywanemu stresowi wstrząsowemu bezpośrednio przed włożeniem dźwigni. Sesje testowe trwały 3 godziny. Dawka kokainy i parametry wstrząsu nożnego zostały dobrane na podstawie wcześniejszych prac z tego laboratorium (Erb i wsp. 1996; Erb i wsp. 1998; Shaham i wsp. 1998). Dawki klonidyny zostały wybrane na podstawie eksperymentów reinstytucji, które przeprowadziliśmy ze szczurami trenowanymi heroiną (Shaham i wsp. 2000).

Doświadczenie 3A: Effects of Lofexidine on High Rates of Responding for Sucrose

Because the pharmacological profile for lofexidine has not been as well characterized as that for clonidine, an experiment was conducted to establish whether, and at what doses, lofexidine induces performance deficits. Dawki w testach przywracania zostały wybrane na podstawie wyników uzyskanych w tym eksperymencie.

Przedmioty

Przedmiotami było 8 samców szczurów rasy Long-Evans (Charles River, Quebec) ważących 400-550 g na początku eksperymentu. Szczury były wcześniej używane w eksperymencie mającym na celu badanie indukowanego wstrząsami stóp przywrócenia poszukiwania sacharozy (Buczek et al. 1999). Zwierzęta utrzymywano w warunkach podobnych do opisanych w eksperymencie 1.

Aparatura

Każda komora samodestrukcyjna była wyposażona w dwie nieruchome dźwignie, symetrycznie wyśrodkowane na jednej ścianie bocznej, 5 cm nad podłogą. Odpowiedzi na jednej dźwigni, dźwigni „aktywnej”, aktywowały pompę (Razel Sci. Stamford, CT). Odpowiedzi na drugą dźwignię, „atrapę”, były rejestrowane, ale bez konsekwencji. Aktywacja pompy powodowała 20-sekundowe dostarczanie 0,18 ml roztworu sacharozy do pojemnika na krople cieczy umieszczonego pomiędzy dwiema dźwigniami. Przez cały okres dostarczania sacharozy, białe światło stymulujące tuż nad aktywną dźwignią było oświetlone i dodatkowe odpowiedzi w tym czasie były rejestrowane, ale nie powodowały reaktywacji pompy.

Leki

Lofeksydyna HCl została hojnie dostarczona przez Keith Davies, Britannia Pharmaceuticals Ltd., Wielka Brytania. Lek rozpuszczono w soli fizjologicznej i wstrzykiwano i.p. (0, 80, 120, 160 lub 200 μg/kg).

Procedura

Zwierzętom, które wcześniej nauczyły się samoadministrować sacharozę w innym badaniu (Buczek et al. 1999), podano następnie pięć sesji w ciągu pięciu kolejnych dni, w których samoadministrowano 30% roztwór sacharozy według schematu FR-1. W kolejnych sesjach dziennych, zwierzętom wstrzykiwano albo nośnik (0 μg/kg) albo lofexidynę (80, 120, 160 lub 200 μg/kg, i.p.) 60 min przed rozpoczęciem sesji samopodawania. Wszystkie zwierzęta otrzymywały wszystkie dawki lofeksydyny w kolejności równoważnej; najwyższa dawka lofeksydyny była testowana dwukrotnie. Po każdej sesji, w której zwierzętom podawano lofexidynę, następowała sesja wstępnego traktowania solą fizjologiczną, aby zminimalizować możliwość wystąpienia efektów ubocznych leku.

Eksperyment 3B: Wpływ lofektydyny na reinstytucję wywołaną uderzeniem stopą i kokainą

Przedmioty

Przedmiotami było 49 samców szczurów rasy Long-Evans (34 od Charles River, Quebec; 15 od Harlan Sprague Dawley, USA) ważących 350-400 g na początku eksperymentu. Zwierzęta były utrzymywane w sposób opisany w doświadczeniu 1. Nie było oczywistych różnic w reagowaniu między zwierzętami pochodzącymi od dwóch dostawców w żadnej fazie eksperymentu.

Procedura

Faza 1: Trening. Zwierzęta były szkolone do samopodawania kokainy w warunkach opisanych w eksperymencie 2.

Faza 2: Wygaśnięcie i testowanie. W tym doświadczeniu okresy przejściowe, jak opisano powyżej, trwały 60 minut. Podczas badania, oddzielne grupy zwierząt były wstępnie traktowane 0, 50, 100, 150 lub 200 μg/kg, i.p., lofexidine przed każdym z trzech testów na przywrócenie (sól fizjologiczna, kokaina, i stres footshock), podane w kolejnych dniach i w kolejności równoważnej (patrz Doświadczenie 2). Lofektydyna była wstrzykiwana 60 min przed wprowadzeniem dźwigni. Sesje testowe trwały 3 godziny. Dawki lofexidyny zostały wybrane na podstawie wyników uzyskanych w eksperymencie 3A.

Eksperyment 4: Wpływ guanabenzu na reinstytucję wywołaną szokiem nożnym i kokainą

Przedmioty

Przedmiotami było 18 samców szczurów rasy Long-Evans (Charles River, Quebec) ważących 350-400 g na początku eksperymentu. Zwierzęta utrzymywano w sposób opisany w eksperymencie 1.

Lek

Guanabenz zakupiono w firmie Sigma (St Louis, MO) i rozpuszczono w soli fizjologicznej i wstrzyknięto i.p. (0, i 640 μg/kg).

Procedura

Faza 1: Trening. Zwierzęta szkolono w zakresie samoadministrowania kokainą w warunkach opisanych w doświadczeniu 2.

Faza 2: Wygaśnięcie i testowanie. W tym doświadczeniu okresy przejściowe, jak opisano powyżej, trwały 60 minut. W czasie badania, zwierzętom podawano wstępnie 0 lub 640 μg/kg guanabenzu, i.p., przed każdym z dwóch testów przywracania (bez wstrząsu stóp, wstrząs stóp lub sól fizjologiczna, kokaina), podawanych w kolejnych dniach (patrz Doświadczenie 2). Guanabenz wstrzykiwano 60 min przed włożeniem dźwigni. Sesje testowe trwały 3 godziny. Dawka guanabenzu została dobrana na podstawie jej substytucyjności w stosunku do 40 μg/kg klonidyny w procedurze dyskryminacji narkotykowej (Bennett i Lal 1982).

ANALIZY STATYSTYCZNE

Dane z mikrodializy analizowano za pomocą mieszanej analizy czynnikowej ANOVA dla stężenia zewnątrzkomórkowego NE w 20-minutowych próbkach dializatu; czynnikiem międzyprzedmiotowym była dawka klonidyny (0, 20, 40 μg/kg), lofeksydyny (0, 75, lub 150 μg/kg), lub guanabenzu (0 lub 640 μg/kg), a powtarzaną miarą był czas. Istotne interakcje między czasem a dawką poddano jednokierunkowej ANOVA dla czynnika dawki w określonych punktach czasowych. Gdy było to właściwe, przeprowadzono testy post hoc (LSD Fishera, p < .05) w celu porównania pojazdu (0 μg/kg) do warunków związanych z lekiem.

Dwie zależne miary w testach na przywrócenie były liczbą odpowiedzi na aktywną dźwignię (infuzje + odpowiedzi po upływie czasu) i liczbą odpowiedzi na nieaktywną dźwignię w ciągu trzech godzin. Wszystkie dane behawioralne są przedstawione jako średnie ± SEM. Ze względu na znaczną zmienność w liczbie odpowiedzi dokonanych w różnych testach na przywrócenie, statystyki nieparametryczne dla powiązanych (Friedman i Wilcoxon) i niepowiązanych (Kruskal-Wallis i Mann-Whiney) próbek były używane w stosownych przypadkach.

Dla badania sacharozy (Eksperyment 3A) zależne środki były liczbą odpowiedzi na aktywnych (wzmocnione + odpowiedzi timeout) i nieaktywnych dźwigni i liczby wzmocnień uzyskanych. Przeprowadzono ANOVA z dawką jako czynnikiem wewnątrzprzedmiotowym. W stosownych przypadkach przeprowadzono testy post hoc (LSD Fishera, p < .05) w celu porównania nośnika (0 μg/kg) z warunkami stosowania leku.