Ammonium Sulfate Protein Precipitation: The key to Salting-Out

Salt precipitation can be a very powerful tool to purify proteins by precipitation. Siarczan amonu jest zwykle solą z wyboru, ponieważ jest tani, bardzo dobrze rozpuszczalny w wodzie i jest w stanie stać się znacznie bardziej uwodniony (oddziałuje z większą ilością cząsteczek wody) niż prawie każdy inny rozpuszczalnik jonowy. W praktyce siarczan amonu jest albo dodawany bezpośrednio jako ciało stałe lub dodawany jako (zazwyczaj) nasycony roztwór do wytrącania pożądanych protein.

Przy niskich stężeniach soli (<0.15M) dodanie większej ilości soli w ogóle ma tendencję do zwiększania rozpuszczalności białek, ponieważ jony osłaniają cząsteczki białka przed ładunkami innych cząsteczek; tendencja ta jest określana jako „solenie się”. W pewnym momencie siła jonowa staje się zbyt wysoka i zaczyna mieć negatywny wpływ na rozpuszczalność białek, co określa się mianem „salting-out”. Dzieje się tak, ponieważ rozpuszczona sól konkuruje z białkami o nieliczne cząsteczki wody, zwiększając napięcie powierzchniowe wody i powodując w ten sposób ściślejsze zwijanie się białka. Zmniejszenie powierzchni białka oznacza mniej interakcji białko-woda, co pozwala na więcej hydrofobowych interakcji między cząsteczkami białka, powodując agregację, a następnie precipitation.

Białka w roztworze mogą być również frakcjonowane, ponieważ będą one wytrącać się w funkcji stężenia soli. W ten sposób możliwe jest oczyszczanie specyficznych białek poprzez dodanie określonej ilości siarczanu amonu w celu wytrącenia niepożądanych białek, odzyskanie supernatantu, a następnie dodanie nieco więcej siarczanu amonu w celu wytrącenia pożądanego białka, a następnie zapisanie tego granulatu wytrąconego białka. Ponieważ wytrącanie soli wpływa tylko na rozpuszczalność białek i nie denaturuje ich, odzyskana frakcja może być przechowywana w roztworze soli przez dłuższy czas bez obawy o zanieczyszczenie bakteryjne, ponieważ wysoka zawartość soli hamuje wzrost drobnoustrojów lub aktywność proteaz.

Ponieważ wytrącanie siarczanu amonu tylko zmniejsza rozpuszczalność białek i nie denaturuje ich białka mogą być zatężane przez usunięcie pozostałego roztworu siarczanu amonu, a następnie osad białkowy może być resolubilizowany w standardowych buforach lub niższym stężeniu siarczanu amonu. Do dalszego oczyszczania roztworu białka można następnie zastosować chromatografię oddziaływań hydrofobowych lub chromatografię żelową. Siarczan amonu może być również stosowany do prowadzenia niektórych białek rozłożonych przez denaturanty, takie jak mocznik, z powrotem do ich właściwych konformacji natywnych poprzez stopniowe zwiększanie stężenia siarczanu amonu.

Istnieją pewne najlepsze praktyki, które należy rozważyć podczas pracy z siarczanem amonu, takie jak:

• Używaj moździerza i tłuczka do rozbijania grudek i innego rozdrabniania siarczanu amonu w celu ułatwienia dodawania i rozpuszczania.
• Używać buforu takiego jak 50 mM HEPES lub Tris, aby zminimalizować zakwaszający charakter siarczanu amonu.
• Używaj siarczanu amonu klasy analitycznej, ponieważ niższe klasy zazwyczaj wykazują zanieczyszczenie metalami ciężkimi.

Proces wytrącania soli ma pewne wady. Wysalanie białek wymaga wcześniejszej wiedzy na temat rozpuszczalności białka. Ponadto, wszelkie zanieczyszczenia obecne w początkowej próbce mogą być nadal obecne we frakcji zawierającej interesujące nas białko; proces ten koncentruje białko, ale go nie oczyszcza. Ponadto, może być konieczne usunięcie soli z próbki białka, a więc dalsze przetwarzanie w formie dializy lub chromatografii będzie wymagane.

Powiązane posty na blogu

• Jakie techniki strącania białka są stosowane do koncentracji i oczyszczania?
• Ekstrakcja białka roślinnego i techniki strącania białka

.