AmpR Increases the Virulence of Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae by Regulating the Initial Step of Capsule Synthesis

Introduction

Klasyczny K. pneumoniae (cKp) i hiperwirulentny K. pneumoniae (hvKp) są dwoma globalnymi patotypami K. pneumoniae krążącymi obecnie w obiegu.1,2 W Ameryce Północnej i Europie większość zakażeń K. pneumoniae jest wywoływana przez izolaty cKp, które są najczęściej patogenami oportunistycznymi wywołującymi zakażenia głównie w placówkach służby zdrowia u nosicieli z obniżoną odpornością. Najbardziej problematyczną cechą tego patotypu jest zdolność do nabywania coraz większej liczby elementów nadających oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe. K. pneumoniae oporny na karbapenemy (CRKP) związany z karbapenemazami kodowanymi przez plazmidy stanowi odrębne wyzwanie kliniczne i powoduje inwazyjne zakażenia o wysokiej śmiertelności.3,4

W doniesieniach z Tajwanu opisano unikalny zespół kliniczny nabytego w społeczności, tkankowo-inwazyjnego zakażenia K. pneumoniae u zdrowych osób, które często występowało w wielu miejscach lub rozprzestrzeniało się, włączając ropnie wątroby.5,6 hvKp została oznaczona w celu odróżnienia tego patotypu od cKp, a częstość występowania zakażeń wywołanych przez hvKp stale wzrastała w ciągu ostatnich 3 dekad w krajach Azji i Pacyfiku.7-11 hvKp jest zwykle wrażliwa na środki przeciwdrobnoustrojowe, ale stwierdzono, że może być oporna, a nawet zgłoszono przypadek skrajnie lekoopornego (XDR) izolatu cKp, który nabył część plazmidu wirulencji hvKp, co spowodowało śmiertelny wybuch epidemii szpitalnej.12-15

Cechą, którą początkowo uważano za czułą i swoistą dla izolatów hvKp, był fenotyp hipermukowiscydozy, który określano na podstawie dodatniego testu sznurkowego.16 Jednak spowodowało to pewne zamieszanie, ponieważ nie wszystkie izolaty hvKp określano jako hipermukowiscydozę, a niektóre izolaty cKp posiadały tę cechę.17 Ostatnio wykazano, że wiele biomarkerów, w tym peg-344, iroB, iucA, rmpA i rmpA2 kodowane przez plazmid oraz ilościowe wytwarzanie sideroforów, dokładnie przewidują izolaty hvKp; te biomarkery mogą być wykorzystane do opracowania testu diagnostycznego do stosowania przez laboratoria kliniczne w celu zapewnienia optymalnej opieki nad pacjentami oraz do stosowania w nadzorze epidemiologicznym i badaniach.18 Jednak w tym badaniu zidentyfikowaliśmy nową grupę izolatów CRKP bez hipermukowiscydozy, w których brakuje większości genów specyficznych dla hvKp. Badanie asocjacyjne obejmujące cały genom (Pan-GWAS), analiza proteomów i test wirulencji na modelu zwierzęcym ujawniły, że AmpR zwiększa wirulencję tych izolatów poprzez regulację inicjacji syntezy kapsułki. Co więcej, stwierdziliśmy również, że ampR przenoszony przez szczepy K-locus 47 (KL47) w tym badaniu nie był w stanie zwiększyć wirulencji KL1 hipermukowiscydozy K. pneumoniae.

Materiały i metody

Izolaty kliniczne i zbieranie danych

Niepowtarzalne kliniczne izolaty K. pneumoniae zostały zebrane z rutynowo wykrywanych i przechowywanych próbek z 5 szpitalnych Departamentów Medycyny Laboratoryjnej w prowincjach Guangdong i Anhui w latach 2018-2019. Wszystkie izolaty były przechowywane w temperaturze -80 ° C przed użyciem. Uzyskano informacje kliniczne na temat pacjentów. Identyfikację gatunków i badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe przeprowadzono za pomocą kompaktowego systemu VITEK-2 (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francja). Wyniki interpretowano zgodnie z wytycznymi opublikowanymi przez Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI; dokument M100-S26).19 Zidentyfikowane gatunki wszystkich izolatów potwierdzono za pomocą spektrometrii masowej wspomaganej laserową desorpcją/jonizacją matrycy (bioMérieux, Marcy-l’Étoile, Francja). CRKP zdefiniowano jako oporny na imipenem lub meropenem.

Charakterystyka fenotypu hipermukowiscydozy

Aby zidentyfikować fenotyp hipermukowiscydozy za pomocą testu sznurkowego, izolaty inokulowano na płytki agarowe zawierające 5% krwi owczej i inkubowano w temperaturze 37°C przez noc. Wynik testu sznurkowego uznawano za pozytywny, gdy po dotknięciu pojedynczej kolonii standardową pętlą inokulacyjną i pociągnięciu kolonii do góry można było wytworzyć lepki sznurek o długości ponad 5 mm.2

Whole Genome Sequencing (WGS)

Do ekstrakcji genomowego DNA (gDNA) (Sangon, Shanghai, Chiny) użyto 1 mL objętości hodowli (gęstość optyczna przy 600 nm równa 0,6). gDNA sekwencjonowano na sekwenatorze Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA) stosując sparowane odczyty 150-bp. Asemblację genomu wykonano przy użyciu programu de novo SPAdes Genome Assembler (wersja 3.12.0).20 Typowanie kapsułkowe przeprowadziliśmy na zmontowanych sekwencjach przy użyciu programu Kaptive (wersja 0.5.1).21 Geny oporności przeciwdrobnoustrojowej i czynniki wirulencji zidentyfikowano u izolatów poprzez skanowanie kontigów genomu w stosunku do baz danych ResFinder i VFDB przy użyciu programu ABRicate (wersja 0.8.7). Typowanie wieloogniskowe (MLST) oraz analizę genotypową core genome MLST (cgMLST) przeprowadzono przy użyciu programu Ridom SeqSphere+ (wersja 5.1.0).22 Typ złożony (CT) określono zgodnie ze schematem cgMLST dla K. pneumoniae (www.cgmlst.org/ncs/schema/2187931). Konstrukcję drzewa filogenetycznego opartego na wariantach pojedynczych nukleotydów (SNVs) w genomie rdzeniowym przeprowadzono przy użyciu pakietu Harvest (wersja 1.2) z testem 1000-bootstrap.23 Do wyświetlania, manipulacji i adnotacji drzewa filogenetycznego użyto narzędzia online iTOL.24 Sekwencje genomowe anotowaliśmy za pomocą programu Prokka (wersja 1.13.3).25

Pan Genome-Wide Association Study (Pan-GWAS) Analysis

Użyliśmy pan genome pipeline Roary (wersja 3.12.0), aby umieścić anotowane asemblacje w formacie GFF3 (wyprodukowane przez Prokka) i obliczyć pan genome.26 Użyliśmy Scoary (wersja 1.6.16), aby pobrać plik z „https://sanger-pathogens.github.io/Roary/”, stworzyliśmy plik cech i obliczyliśmy asocjacje pomiędzy wszystkimi genami w genomie akcesoryjnym i cechami. Zgłosiliśmy listę genów posortowanych według siły asocjacji z P-value < 0,01 dostosowaną metodą Benjamini-Hochberga do korekty wielokrotnych porównań.27

Analiza proteomu

Do ekstrakcji białek użyto 1 mL objętości hodowli (gęstość optyczna przy 600 nm wynosząca 0,6). Próbkę poddano sonikacji trzykrotnie na lodzie przy użyciu procesora ultradźwiękowego o wysokiej intensywności (Scientz) w buforze lizującym (8 M mocznik, 1% koktajl inhibitorów proteaz). Pozostałe szczątki usuwano przez wirowanie przy 12 000 g w 4°C przez 10 min. Na koniec zbierano supernatant, a stężenie białka oznaczano za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcją producenta. W celu trawienia roztwór białka redukowano 5 mM ditiothreitolem przez 30 min w 56°C i alkilowano 11 mM jodoacetamidem przez 15 min w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnie próbkę białka rozcieńczano przez dodanie 100 mM TEAB z mocznikiem o stężeniu poniżej 2M. Na koniec dodawano trypsynę w stosunku masowym 1:50 trypsyny do białka do pierwszego trawienia przez noc i w stosunku masowym 1:100 trypsyny do białka do drugiego trawienia przez 4 godziny. Peptydy tryptyczne rozpuszczano w 0,1% kwasie mrówkowym (rozpuszczalnik A) i bezpośrednio ładowano na domowej roboty kolumnę analityczną z odwróconą fazą (długość 15 cm, i.d. 75 μm). Gradient przeprowadzono w następujący sposób: wzrost z 6% do 23% rozpuszczalnika B (0,1% kwasu mrówkowego w 98% acetonitrylu) w ciągu 26 min, wzrost z 23% do 35% rozpuszczalnika B w ciągu 8 min, wzrost do 80% rozpuszczalnika B w ciągu 3 min i utrzymanie na poziomie 80% rozpuszczalnika B przez ostatnie 3 min przy stałym przepływie 400 nL/min na systemie EASY-nLC 1000 UPLC. Peptydy poddawano działaniu źródła NSI, a następnie tandemowej spektrometrii mas (MS/MS) w Q ExactiveTM Plus (Thermo) sprzężonej online z UPLC. Zastosowane napięcie elektrorozpylania wynosiło 2.0 kV. Zakres skanowania m/z wynosił od 350 do 1800 dla pełnego skanowania, a nienaruszone peptydy były wykrywane w Orbitrap z rozdzielczością 70 000. Peptydy były następnie wybierane do MS/MS przy ustawieniu NCE na 28, a fragmenty były wykrywane w Orbitrap z rozdzielczością 17,500. Procedura zależna od danych polegała na naprzemiennym wykonywaniu jednego skanu MS, po którym następowało 20 skanów MS/MS z 15.0 s dynamicznego wykluczenia. Automatyczna kontrola wzmocnienia (AGC) została ustawiona na 5E4. Stała pierwsza masa została ustawiona na 100 m/z. Uzyskane dane MS/MS przetworzono przy użyciu wyszukiwarki MaxQuant (v.1.5.2.8). Do anotacji domen białkowych wykorzystano InterProScan (wersja 5.37-76.0). Skorygowana wartość p < 0,05 i zmiana fold > 1,2 zostały uznane za znaczące.

Construction of the ampR Complement Mutant

K. pneumonia ampR (Materiały uzupełniające) został zsyntetyzowany i oflankowany miejscami restrykcyjnymi 5ʹXbaI i 3ʹHindIII. Fragment ten poddano trawieniu restrykcyjnemu i sklonowano do pUC57. Rekombinowane DNA odzyskiwano w Escherichia coli DH5α z selekcją ampicylinową. Po trawieniu restrykcyjnym, fragment ampR ligowano do wektora ekspresyjnego pBAD33 (Invitrogen) zgodnie z instrukcjami producenta. pBAD33-ampR użyto do transformacji z zastosowaniem elektroporacji jako standardu dla laboratoryjnie izolowanych E. coli. Szczepy komplementarne ampR zostały potwierdzone za pomocą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) (Tabela S1). Ekspresję ampR indukowano przez dodanie 100 μg/mL arabinozy.

Mouse Pulmonary Infection Models

Model zapalenia płuc K. pneumoniae u myszy został użyty do testowania wirulencji izolatów. Sześcio- do ośmiotygodniowe samice myszy BALB/c w klasie wolnej od specyficznych patogenów zakupiono od Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd.. Myszy znieczulono dootrzewnowo pentobarbitalem sodowym (75 mg/kg) i zaszczepiono 1,0 × 107 jednostek tworzących kolonię (CFU) K. pneumoniae przez nieinwazyjne wstrzyknięcie do tchawicy pod bezpośrednim nadzorem. Przeżycie myszy obserwowano przez 7 dni po zakażeniu. W celu oceny obciążenia bakteryjnego w płucach, narządy zainfekowanych myszy homogenizowano i rozpuszczano w 1 mL roztworu buforu fosforanowego (PBS); 50 μL inokulowano na płytki agarowe z płynnym bulionem (LB) i przeprowadzano liczenie CFU. Do analizy histopatologicznej segmenty płuc utrwalano w 10% obojętnej formalinie, osadzano w parafinie i barwiono hematoksyliną i eozyną do wizualizacji w mikroskopie świetlnym. Obciążenie bakteryjne i analizę histopatologiczną przeprowadzono po 24 godzinach od zakażenia.

Extraction and Quantification of Capsular Polysaccharide

Polisacharydy kapsularne ekstrahowano za pomocą detergentu Zwittergent 3-14. Następnie zmierzono ilość kwasu uronowego zgodnie z metodą opisaną wcześniej.28 Równolegle, seryjne rozcieńczenia hodowli bakteryjnej posiano w celu określenia liczby CFU, a stężenie polisacharydu kapsularnego wyrażono zgodnie z ilością kwasu glukuronowego (μg) na 109 CFU/mL próbki. Każdy eksperyment wykonano w trzech powtórzeniach.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną wykonano przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism wersja 8 (La Jolla, Kalifornia).

Wyniki

Charakterystyka izolatów

W badaniu wykorzystano izolaty CRKP (n = 135). Wszystkie izolaty były typu sekwencyjnego 11 (ST11) i wykazywały ekspresję karbapenemazy K. pneumoniae (KPC-2), a 1 izolat był nosicielem zarówno OXA-23, jak i KPC-2 (Figura S1). Izolaty zostały przypisane do 16 CT przy użyciu schematu cgMLST. Najczęstszymi CT były CT1313 (n = 35), CT1291 (n = 20), CT3176 (n = 14), CT1814 (n = 13) i CT2410 (n = 11), a następnie 11 innych CT zidentyfikowanych w mniej niż 10 izolatach każdy (Figura 1). Wszystkie izolaty zostały przypisane do dwóch typów KL, KL64 (n = 86) i KL47 (n = 49) (Figura S2). Nie stwierdzono izolatów hipermukowiscydozy. Analiza genów wirulencji wykazała, że nie odnotowano wcześniej izolatów posiadających wszystkie biomarkery umożliwiające różnicowanie izolatów hvKp i cKp (Rycina 1, Rycina S2).18

Rycina 1 Analiza filogenetyczna 135 izolatów w tym badaniu. Gałęzie różnych izolatów typu CT są zaznaczone kolorami. Odpowiadające izolaty każdego typu CT to CT1291 (P1291-1 do P1291-20), CT1313 (P1313-1 do P1313-33, AH1313-1 do AH1313-2), CT1689 (AH1689-1 do AH1689-8), CT1772 (AH1772-1 do AH1772-4), CT1814 (AH1814-1 do AH1814-13), CT1819 (AH1819), CT2405 (P2405-1 do P2405-9), CT2410 (od P2410-1 do P2410-11), CT2418 (od P2418-1 do P2418-4), CT2444 (P2444), CT2445 (od P2445-1 do P2445-6), CT3175 (od AH3175-1 do AH3175-2), CT3176 (AH3176-1 do AH3176-14), CT3178 (AH3178-1 do AH3178-4), CT3179 (AH3179-1 do AH3179-2), oraz CT3195 (AH3195). rmpA, rmpA2, magA iroB, peg-344 i iucA zostały zidentyfikowane do różnicowania hiperwirulentnych K. pneumoniae od klasycznych K. pneumoniae w poprzednim badaniu.18

Analiza danych klinicznych

Nie było istotnych różnic między CT pod względem danych demograficznych, typów infekcji, głównych chorób współistniejących, operacji inwazyjnych, wskaźnika chorobowości Charlsona i wyniku bakteriemii Pitta, z wyjątkiem centralnego cewnika żylnego, oraz śmiertelności wewnątrzszpitalnej z wszystkich przyczyn (P = 0,035 i P = 0,001, dokładny test Fishera). Pacjenci zakażeni CT3176 mieli znacząco wyższe wskaźniki śmiertelności (78,6% vs 37,1%, P = 0,012; 78,6% vs 20,0%, P = 0,001; 78,6% vs 7,7%, P = 0,0003; 78,6% vs 31,0%, P = 0,004; dokładny test Fishera) w porównaniu z grupami CT1313, CT1291, CT1814 i innymi grupami CT, odpowiednio. Wykorzystanie centralnych cewników żylnych w CT1814 było znacznie wyższe niż w CT1313 i CT1291 (84,6% vs 51,4%, P = 0,049; 84,6% vs 35,0%, P = 0,011, dokładny test Fishera) (Tabela 1).

Tabela 1 Dane demograficzne, choroby współistniejące, Invasive Procedures and Mortality of Patients with Carbapenem-Resistant Klebsiella pneumoniae Infections

Analiza Pan-GWAS

Aby zidentyfikować genetyczne podstawy CT3176, przeprowadziliśmy analizę Pan-GWAS między grupami CT3176 i nie-CT3176. Zidentyfikowaliśmy 39 genów o znanych funkcjach związanych z CT3176 (P < 0,01 skorygowane metodą Benjamini-Hochberga) (Figura 2), w tym czynniki wirulencji, geny syntezy kapsułek, geny oporności przeciwdrobnoustrojowej i transportery effluksu wielolekowego. Wśród nich największą asocjację z CT3176 wykazywał ampR. Zauważyliśmy jednak, że inne CT, takie jak CT3178 i niektóre izolaty CT1689 (AH1689-2 i AH1689-6), również były nosicielami genu ampR (Figura 1). Wszystkie izolaty niosące gen ampR należą do KL47.

Rysunek 2 Analiza Pan-GWAS pomiędzy grupami CT3176 i nie-CT3176. Pangenom i asocjacje zostały obliczone za pomocą Roary i Scoary. Mapa wykresu została wygenerowana za pomocą ggplot2.

Analiza proteomu

Trzy izolaty ampR+ (AH3176-1, AH3178-1 i AH1689-2) i trzy ampR- (AH1689-3, AH1689-4 i AH1689-5) zostały wybrane do analizy proteomu. W obu grupach zidentyfikowano łącznie 3093 białka na podstawie 36 727 unikalnych peptydów. Ostatecznie zidentyfikowano 24 różnie wyrażone białka (DEPs). Spośród nich 15 uległo podwyższeniu, a 9 obniżeniu w izolatach ampR+ w porównaniu z izolatami ampR- (Rysunek 3A-C, Tabela S2). WcaJ miał najwyższą zmianę fold i dlatego został wyróżniony.

Rysunek 3 Analiza proteomu i barwienie kapsuł. (A) Volcano plot pokazujący porównanie ilościowej ekspresji białek pomiędzy izolatami Klebsiella pneumoniae ampR+ (AH1689-2, AH3176-1 i AH3178-1) i ampR- (AH1689-3, AH1689-4 i AH1689-5). (B, C) Kolorem zaznaczono białka ulegające ekspresji różnicowej o zmianie fałdowej powyżej 1,2.

Wirulencja w modelach zwierzęcych i kwantyfikacja kapsuły

W celu zidentyfikowania roli ampR w wirulencji niehypermucoviscous izolatów CRKP, wybraliśmy trzy izolaty (AH3176-1, AH1689-2 i AH1689-3) i zbadaliśmy ich wirulencję w modelu mysim. AH3176-1 i AH1689-2 były dwoma izolatami ampR+, podczas gdy AH1689-3 był izolatem ampR- (Rysunek 1). Ponadto z naszej kolekcji wybraliśmy dwa hipermukowiscydalne szczepy GM2 i GM6 w celu zbadania wirulencji. Zarówno GM2 jak i GM6 należą do KL1, wśród których GM6 posiada gen ampR, natomiast GM2 nie. Jednakże sekwencja ampR szczepu KL47, który nie jest hipermukowiscydozą, różniła się od sekwencji hipermukowiscydozy KL1, dlatego w niniejszej pracy zostały one nazwane odpowiednio ampRKL1 i ampRKL47.

Jak pokazano na Figurze 4A, AH3176-1 i AH1689-3:ampRKL47 plus arabinoza miały przeżywalność 0% przy inokulum 1 × 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) w 4 d po zakażeniu, podczas gdy 20% przeżywalność z AH1689-2, 40% przeżywalność z AH1689-3:ampRKL47 bez arabinozy, 60% przeżywalność z AH1689-3:pBAD33 i ATCC70721 oraz 80% przeżywalność z AH1698-3 obserwowano w 7 d po zakażeniu. Przeżywalność była znacząco obniżona po komplementacji genem ampRKL47 w AH1689-3 (n = 10; P = 0,033, test log-rank Mantel-Cox), co sugeruje ważną rolę ampR w wirulencji. Zakażenie myszy AH3176-1 powodowało około 10-100-krotny wzrost CFU w płucach w porównaniu z innymi izolatami (Figura 4B). Patologia płuc wykazywała różny stopień pogrubienia ścian pęcherzyków płucnych, nacieku limfocytów i krwawienia wewnątrznaczyniowego w grupie zakażonej. Wśród nich, płucne zmiany patologiczne wywołane przez AH3176-1 były najpoważniejsze, prezentując się jako rozległa konsolidacja płuc i krwawienie wewnątrzpęcherzykowe (Rysunek 4D-F).

Ryc. 4 Potencjał wirulencji niehypermukoidalnych izolatów Klebsiella pneumoniae w mysim modelu zakażenia płuc. (A) Oceniono wpływ 1 × 107 jednostek tworzących kolonie (CFU) AH3176-1, AH1689-2, AH1689-3 i AH1689-3 mutanta dopełniacza ampRKL47 na przeżywalność. (B) W 24 godziny po zakażeniu (hpi) płuca zakażonych myszy zostały zebrane, a obciążenie bakteryjne zostało określone przez policzenie CFU (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, jednokierunkowa ANOVA). Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. (C) Produkcja kwasu uronowego przez różne szczepy. Wykonano nieparowany dwustronny test t-Studenta. Każdy punkt danych powtórzono trzykrotnie (n = 3). Dane przedstawiono jako średnie ± s.e.m. *P < 0,05, ns = brak znaczenia. Płuca myszy bez infekcji (D) lub zakażonych ATCC700721 (E) i AH3176-1 (F) zostały pobrane i zabarwione hematoksyliną i eozyną. Wszystkie obrazy są w powiększeniu ×40. Paski skali: 250 μM.

Jak wykazano na rysunku 5A, wskaźnik przeżycia myszy zakażonych GM6 był znacznie niższy niż GM2 i ATCC700721. Spadek wskaźnika przeżywalności obserwowano po komplementacji ampRKL1 w GM2. Ponadto, ładunek bakterii w płucach myszy zakażonych GM6 był znacznie wyższy niż GM2 i ATCC700721 (Figura 5B); barwienie HE wykazało, że zakażenie GM6 spowodowało rozległą konsolidację płuc i krwotok wewnątrz pęcherzykowy (Figura 5E-G). Jednak wskaźnik przeżycia nie uległ zmianie, jeśli ampRKL47 wprowadzono do GM2 (Figura 5C).

Rysunek 5 Potencjał wirulencji hipermukowiscydozy izolatów Klebsiella pneumoniae w mysim modelu zakażenia płuc. (A) Oceniono wpływ 1 × 106 jednostek tworzących kolonie (CFU) GM2, GM6 i GM2 mutanta dopełniacza ampRKL1 na przeżywalność (n = 10; *P < 0,05, **P < 0,01, test log-rank Mantel-Cox),). (B) W 24 godziny po zakażeniu (hpi) płuca zakażonych myszy zostały zebrane, a obciążenie bakteryjne określono przez wyliczenie CFU (n = 10; **P < 0,01, jednokierunkowa ANOVA). Dane są reprezentatywne dla 3 niezależnych eksperymentów. (C) Oceniono wpływ 1 × 106 CFU GM2 i mutanta dopełniacza GM2 ampRKL47 na przeżycie. (D) Produkcja kwasu uronowego przez różne szczepy. Wykonano nieparowany, dwustronny test t-Studenta. Każdy punkt danych powtórzono trzykrotnie (n = 3). Dane przedstawiono jako średnie ± s.e.m. *P < 0,05, ns = brak znaczenia. Płuca myszy bez zakażenia (E) lub zakażonych GM2 (F) i GM6 (G) zostały pobrane i zabarwione hematoksyliną i eozyną. Wszystkie obrazy są w powiększeniu ×40. Paski skali: 250 μM.

Ponieważ kapsuła jest głównym czynnikiem wirulencji K. pneumonia, a WcaJ, który został wyróżniony zgodnie z wynikami analizy proteomów, reguluje początkowy etap syntezy kapsuły, zbadaliśmy ilości produkowanych polisacharydów kapsulowych. Wynik pokazał, że szczepy komplementarne ampR AH1689-3:ampRKL47 i GM2:ampRKL1 plus arabinoza produkowały znacząco więcej polisacharydu kapsulowego (kwasu uronowego) niż AH1689-3 i GM2, odpowiednio (Figura 4C, Figura 5D).

Dyskusja

MLST jest najczęściej stosowaną techniką do definiowania populacji K. pneumoniae. Dzięki szybkiemu i niedrogiemu WGS możliwe jest porównywanie całych genomów do typowania izolatów, a nie tylko kilku loci, jak w tradycyjnym MLST. Genotypowanie przy użyciu cgMLST wykorzystuje tysiące alleli w całym genomie, co skutkuje wyższym poziomem dyskryminacji izolatów. W tym badaniu użyliśmy cgMLST do klasyfikacji 135 klinicznych izolatów CRKP i stwierdziliśmy różnice pomiędzy typami CT w oparciu o informacje kliniczne. Ze względu na ograniczoną liczbę przypadków, nie byliśmy w stanie uzyskać związku między typami TK a wynikiem klinicznym. Jednak różnice w śmiertelności pozwoliły nam na dalsze badanie izolatów należących do CT3176. Analiza GWAS wykazała, że gen ampR był istotnie związany z izolatami CT3176.

Wcześniejsze badania wykazały, że regulator β-laktamazy AmpC AmpR, członek rodziny czynników transkrypcyjnych LysR, kontroluje również wiele mechanizmów wirulencji u Pseudomonas aeruginosa.29,30 Do tej pory tylko jeden artykuł donosił o roli AmpR w regulacji wirulencji K. pneumoniae. Klonalny izolat K. pneumoniae wykazał, że niewiele znanych genów wirulencji było odpowiedzialnych za ciężkie infekcje. AmpR w tych izolatach był zaangażowany w regulację syntezy kapsułek, modulował tworzenie biofilmu i ekspresję genów fimbrialnych typu 3, jak również kolonizację przewodu pokarmowego myszy.31 Jednakże poziom zjadliwości tych izolatów pozostaje niejasny z powodu braku danych na temat śmiertelnych modeli infekcji. W tym badaniu wykorzystaliśmy model zapalenia płuc, aby potwierdzić zwiększoną wirulencję tych izolatów przenoszących ampR. Wyjaśniałoby to, dlaczego pacjenci zakażeni tymi izolatami mieli wysoką śmiertelność.

Poprzednio powszechne było, że K. pneumoniae typu ST11 był oporny na karbapenemy, ale nie hiperwirulentny. Jednak w 2017 r. zgłoszono epidemię zakażeń szpitalnych wywołanych przez oporne na karbapenemy ST11 hiperwirulentne izolaty K. pneumoniae. Fenotyp hiperwirulencji tych izolatów wynikał z nabycia około 170 kbp plazmidu wirulencji pLVPK-like przez klasyczne izolaty CRKP należące do ST11 i serotypu K47.15 W przeciwieństwie do powyższego doniesienia, w tym badaniu nie znaleziono plazmidów wirulencji w izolatach ST11 CRKP o zwiększonej wirulencji, co sugeruje, że zwiększenie wirulencji nie wynikało z klasycznego mechanizmu.32 W przeciwieństwie do plazmidu wirulencji, który zawiera wiele czynników wirulencji, AmpR może zwiększać wirulencję niezależnie. Zostało to potwierdzone przez badanie wirulencji szczepu komplementarnego ampR.

WcaJ jest enzymem inicjującym syntezę kwasu kolanowego i ładującym pierwszy cukier (glukozę-1-P) na nośnik lipidowy fosforan undkaprenylu. Potencjalna rola WcaJ w wirulencji K. pneumoniae została określona niedawno.33 Wyniki analizy proteomu sugerują, że AmpR zwiększa wirulencję K. pneumoniae poprzez regulację początkowego etapu syntezy kapsydu. Jako regulator, AmpR musi wiązać się z promotorem genu, aby pełnić swoją rolę regulacyjną. Do tej pory zidentyfikowano wiele typów kapsydów u K. pneumoniae,34 a brak miejsc wiązania AmpR w niektórych typach kapsydów może wyjaśniać, dlaczego wirulencja izolatów KL1 nie może być zwiększona przez AmpR znaleziony w izolatach KL47.

Nowe dowody sugerują, że hipermukowatość i hiperwirulencja są różnymi fenotypami, które nie powinny być używane synonimicznie. Co więcej, ważne jest, aby ustalić, że negatywny test strunowy jest niewystarczający do określenia, czy izolat jest hiperwirulentny.35 Kluczowym odkryciem naszej pracy było to, że zidentyfikowaliśmy niehipermukowiskowy podklon ST11 CRKP o zwiększonej wirulencji.

Głównym ograniczeniem tego badania jest niewielka liczba przypadków; dlatego nie jesteśmy w stanie zbadać związku między wynikami klinicznymi a niehipermukowiskowym hiperwirulentnym zakażeniem CRKP. Nie byliśmy również w stanie skonstruować szczepu nokautującego ampR, a to może być wyjaśnione przez analizę genomiczną, która wykazała, że ampR był prawdopodobnie zlokalizowany na plazmidzie (Figura S3). Ponieważ szczepy z fenotypem niehipermucoviscous są prawie nie do odróżnienia w klinice, pilnie potrzebne jest ciągłe monitorowanie i badanie tych nowych szczepów.

.