Anakinra, a Recombinant Human Interleukin-1 Receptor Antagonist, Inhibits Apoptosis in Experimental Acute Myocardial Infarction
Ostry zawał mięśnia sercowego (AMI) jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. AMI jest spowodowany nagłym wystąpieniem niedokrwienia mięśnia sercowego i następującą po nim martwicą. U osób, które przeżyły AMI, istnieje wysokie ryzyko zgonu w ciągu kilku lat od wystąpienia tego incydentu. Ponieważ leczenie AMI uległo w ostatnich latach znacznej poprawie, coraz więcej pacjentów przeżywa AMI. Najczęstszym powikłaniem AMI jest wystąpienie dysfunkcji lewej komory i niewydolności serca. Początkowe niedokrwienne uszkodzenie mięśnia sercowego aktywuje kaskadę zdarzeń, które ostatecznie prowadzą do niekorzystnego remodelingu serca i niewydolności serca z następującym nadmiarem zachorowalności i śmiertelności.1 Proces remodelingu zachodzący w niedokrwionym i niedokrwionym mięśniu sercowym jest mediowany przez upregulation i downregulation różnych szlaków, które wyzwalają przerost i apoptozę kardiomiocytów w delikatnej równowadze pomiędzy śmiercią i przeżyciem.1,2 Antagonista receptora interleukiny-1 (IL-1) (IL-1Ra), członek rodziny IL-1, jest naturalnie występującym białkiem przeciwzapalnym, które zachowuje się jak reagent ostrej fazy.3,4 Podobnie jak inne reagenty ostrej fazy, poziom IL-1Ra wzrasta podczas AMI, a jego poziom koreluje z rokowaniem.5,6 Rola wzrastającego stężenia IL-1Ra podczas AMI jest niejasna i spekuluje się, że jej rola waha się od zwykłego markera uszkodzenia, poprzez modulator odpowiedzi zapalnej do potencjalnego czynnika cytoprotekcyjnego.5,8 Ostatnio wykazano, że wymuszona ekspresja IL-1Ra w modelu zwierzęcym ma działanie kardioprotekcyjne w postaci zmniejszenia wielkości zawału i apoptozy.8
Perspektywa kliniczna p 2683
W niniejszym badaniu zbadano wpływ anakinry, egzogennej rekombinowanej ludzkiej IL-1Ra, w 2 modelach doświadczalnych z zastosowaniem chirurgicznego podwiązania lewej tętnicy wieńcowej u gryzoni: badanie polegające na natychmiastowym podaniu anakinry w modelu mysim w celu oceny jej wpływu na apoptozę, wielkość zawału i remodeling oraz badanie polegające na opóźnionym (24 godziny) podaniu anakinry w celu oceny jej wpływu na apoptozę niezależnie od potencjalnego działania oszczędzającego zawał oraz na remodeling serca w modelu szczurzym (w celu oceny również potencjalnych różnic międzygatunkowych). Dodatkowo, działanie antyapoptotyczne anakinry badano in vitro.
- Metody
- Procedury chirurgiczne
- Traktowanie
- Ocena wielkości zawału
- Echokardiografia
- Patologia
- Poziomy cytokin
- Synteza MMP
- Antypoptotyczne działanie preparatu Anakinra In Vitro
- Anakinra Uptake In Vitro
- Atesty aktywności kaspazy-1 i -9
- Analiza statystyczna
- Wyniki
- In Vivo Administration of Anakinra
- Survival
- Rozmiar zawału
- Apoptoza
- Włóknienie mięśnia sercowego i złogi wapnia
- LV Remodeling and Function
- Infiltracja leukocytów
- Poziomy cytokin
- Aktywność MMP-9
- In Vitro Administration of Anakinra
- Apoptosis
- Zwiększony komórkowy wychwyt anakinry podczas hipoksji
- Zahamowanie aktywności kaspazy-1 i -9
- Dyskusja
- Biologia IL-1Ra
- IL-1Ra w AMI
- Ekstogenna IL-1Ra
- Mechanizm działania
- Rola kaspaz w niedokrwieniu i niewydolności serca
- Farmakokinetyka anakinry i odpowiedź dawka-efekt
- Ischemia, apoptoza, a niewydolność serca po AMI
- Wnioski
- Footnotes
Metody
Procedury chirurgiczne
Wszystkie zwierzęta zostały dostarczone przez firmę Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi humanitarnego wykorzystania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi do badań biomedycznych, opublikowanymi przez National Institutes of Health (nr 85-23, poprawione 1996). Dorosłe samce myszy outbred Institute of Cancer Research (wiek, 10 tygodni; waga, 26 do 38 g) i dorosłe szczury Wistar (wiek, 10 tygodni; waga, 350 do 500 g) poddano podwiązaniu wieńcowemu. Procedury chirurgiczne zostały przeprowadzone w dniu 1 przez 2 wykwalifikowanych operatorów (F.N.S. i S.S.), jak opisano wcześniej.9,10 Zwierzęta w znieczuleniu (pentobarbital 50 do 70 mg/kg) zostały zaintubowane i umieszczone na prawej odleżynie, a następnie poddane chirurgicznemu otwarciu klatki piersiowej i podwiązaniu proksymalnej lewej tętnicy wieńcowej. Osiem myszy i 8 szczurów poddano operacji pozorowanej, która obejmowała wszystkie etapy z wyjątkiem podwiązania tętnicy wieńcowej; połowa była leczona codziennymi iniekcjami anakinry (1 mg/kg), a pozostała połowa była leczona iniekcjami soli fizjologicznej. Institutional Animal Care and Use Committee of Virginia Commonwealth University zatwierdził to badanie. Dziesięć myszy i 4 szczury zmarły w bezpośrednim okresie pooperacyjnym i nie zostały uwzględnione w żadnej z analiz.
Traktowanie
Przeprowadzono dwa badania cząstkowe: natychmiastowe podawanie anakinry podczas niedokrwienia u myszy i opóźnione podawanie anakinry 24 godziny po niedokrwieniu u szczura. W modelu mysim anakinra w dawce 1 mg/kg (odpowiadającej dawce zalecanej w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów) była podawana dootrzewnowo podczas zabiegu operacyjnego, a następnie codziennie przez 6 dawek u 20 myszy (16 z podwiązaniem naczyń wieńcowych i 4 pozorowanych). W modelu szczurzym, anakinra była podawana dootrzewnowo w 2. dniu, a następnie codziennie przez 5 dawek u 8 szczurów (4 z podwiązaniem naczyń wieńcowych i 4 sham-operowane). Pozostałe 24 myszy (20 z podwiązaniem naczyń wieńcowych i 4 sham-operowane) i 12 szczurów (8 z podwiązaniem naczyń wieńcowych i 4 sham-operowane) otrzymało iniekcje NaCl 0,9% (sól fizjologiczna). Dwa różne gatunki gryzoni zostały użyte do oceny potencjalnych różnic międzygatunkowych. Dodatkowe 28 myszy poddano ocenie wielkości zawału 24 godziny po operacji: 6 myszy leczonych solą fizjologiczną i 22 myszy leczonych wzrastającymi dawkami anakinry (1 mg/kg , 10 mg/kg , i 100 mg/kg ), aby ocenić potencjalne zależne od dawki działanie anakinry oszczędzające zawał. Wreszcie, 6 dodatkowych myszy (3 leczone anakinrą i 3 leczone solą fizjologiczną) poddano eutanazji 7 dni po podwiązaniu wieńcowym w celu oceny ekspresji metaloproteinazy macierzy-9 (MMP-9). Łącznie w tym badaniu wykorzystano 78 myszy i 20 szczurów.
Ocena wielkości zawału
Dwadzieścia cztery godziny po zakończeniu protokołu zawału serce szybko usunięto i zamontowano na aparacie Langendorffa. Tętnice wieńcowe były perfundowane 0,9% NaCl zawierającym 2,5 mmol/L CaCl2. Po wypłukaniu krwi do aorty wstrzykiwano w bolusie ≈2 mL 10% błękitnego barwnika Evansa do momentu, gdy większa część serca zmieniła kolor na niebieski. Serce perfundowano solą fizjologiczną, aby wypłukać nadmiar błękitu Evansa. Na koniec, serce usunięto, zamrożono i pocięto na 8 do 10 poprzecznych plasterków od koniuszka do podstawy o równej grubości (≈1 mm). Następnie plastry inkubowano w 10% roztworze chlorku trifenylo-tetrazoliowego w izotonicznym buforze fosforanowym (pH 7,4) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Obszary tkanki zawałowej, strefy ryzyka i całej lewej komory określono za pomocą morfometrii komputerowej przy użyciu oprogramowania do obrazowania BIOQUANT (BIOQUANT Image Analysis Corp, Nashville, Tenn). Wielkość zawału wyrażono jako procent obszaru ryzyka niedokrwienia, który określono jako procent lewej komory.
Echokardiografia
Transthoracic echokardiografia w lekkim znieczuleniu (pentobarbital 30 do 50 mg/kg) została wykonana tuż przed operacją i 7 dni po operacji tuż przed śmiercią. Echokardiografię dopplerowską wykonywano przy użyciu systemu obrazowania Vevo770 (VisualSonics Inc, Toronto, Ontario, Kanada) i sondy 30-MHz u myszy; u szczura użyto systemu echokardiograficznego wyposażonego w przetwornik phase-array 15-MHz (Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif). Przetwornik umieszczano po lewej stronie przedniej części klatki piersiowej. Serce było najpierw obrazowane w trybie dwuwymiarowym w widoku krótkiej osi lewej komory. Kursor trybu M ustawiono prostopadle do ściany przedniej i tylnej, aby zmierzyć średnicę końcoworozkurczową i końcowoskurczową lewej komory (LVEDD i LVESD). Zgodnie z zaleceniami American Society of Echocardiography,11 obrazy w trybie M-mode uzyskiwano na poziomie mięśni brodawkowatych poniżej koniuszka zastawki mitralnej. U myszy wykonywano również projekcje koniuszkowe 4- i 5-jamowe w celu pomiaru przepływu przez zastawkę, prędkości odpływu z lewej komory i przepływu przez aortę. Skrócenie frakcji LV (FS) obliczano w następujący sposób: FS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100. Frakcję wyrzutową obliczano za pomocą wzoru Teichholza. Pulsacyjne doplerowskie widma przepływu przez drogę odpływu lewej komory oraz przez drogę odpływu lewej komory uzyskiwano z projekcji koniuszkowej. Dokonywano pomiaru przepływu w drodze odpływu. Mierzono czas izowolumetrycznego skurczu (ICT) i relaksacji (IRT) oraz czas wyrzutu (ET). Mierzono również całkę prędkości w czasie przepływu w drodze odpływu LV (LVOT) (AoVTI). Dane te wykorzystano do obliczenia wskaźnika Tei (Tei index=ICT+ IRT/ET)12 oraz rzutu serca (CO=AoVTI×π×(LVOT diameter/2)2×heart rate, gdzie LVOT mierzono jako pole przekroju poprzecznego w projekcji przymostkowej w osi długiej). U ludzi wyższy wskaźnik Tei jest związany zarówno z dysfunkcją skurczową, jak i rozkurczową oraz gorszym wynikiem leczenia.12 Przydział do różnych metod leczenia był losowy, a badacz wykonujący i odczytujący badanie echokardiograficzne był zaślepiony na leczenie.
Patologia
W 7. dniu, po badaniu echokardiograficznym i w znieczuleniu, aortę brzuszną kaniulowano cewnikiem polietylenowym, klatkę piersiową otwierano, aortę wypełniano buforem fosforanowym (0,2 mol/L, pH 7,4) i heparyną (100 j.m.), a prawy przedsionek przecinano, aby umożliwić drenaż. W szybkim tempie zatrzymywano serce w rozkurczu i rozpoczynano perfuzję buforowaną fosforanami formaliny. Tylko u szczurów, 1 do 2 mL pełnej krwi pobierano z serca do oznaczania osocza cytokin. Komorę lewej komory wypełniano utrwalaczem w celu 10-minutowego utrwalenia. Po zakończeniu procedury pobierano poprzeczne wycinki środkowej trzeciej części lewej komory i przechowywano je w formalinie przez co najmniej 48 godzin. Apoptoza została określona przez barwienie dla terminalnej deoksynukleotydylowej transferazy dUTP nick-end labeling (TUNEL; fragmentacja DNA, Oncor, Gaithersburg, Md). Szczegółowy protokół został opublikowany w innym miejscu.13 Obszar okołozawałowy został zdefiniowany jako strefa granicząca z zawałem, w której przeważało żywe miokardium.13 Wskaźnik apoptotyczny wyrażono jako liczbę kardiomiocytów apoptotycznych na wszystkie kardiomiocyty na pole. Barwienie kosztowe dla TUNEL i aktyny mięśniowej (wstępnie rozcieńczone przeciwciało anty-mysie α-sarcomeric actin, Invitrogen, San Francisco, Calif) zostało wykonane w celu udokumentowania typu komórki. Rozważaliśmy głównie apoptozę w kardiomiocytach, ale mierzyliśmy również apoptozę w tkance ziarninowej (aktyno-negatywne komórki jednojądrowe) w obszarach zawału.
Liczbę leukocytów w mięśniu sercowym mierzono jako liczbę komórek CD45+ na 1 mm2 (przy użyciu przeciwciała anty-mysiego CD45, rozcieńczenie 1:100, Southern Biotech, Birmingham, Ala) i porównywano między myszami z AMI leczonymi anakinrą i solą. Wskaźnik apoptotyczny w regionach okołozawałowych obliczono w 10 losowych polach, które obejmują prawie cały obszar okołozawałowy. Badacze przeprowadzający liczenie komórek nie byli świadomi przydziału leczenia.
Pomierzyliśmy zwłóknienie mięśnia sercowego w 7 dni po AMI u myszy, aby odpowiedzieć na pytanie, czy natychmiastowe stosowanie anakinry było związane z upośledzonym gojeniem zawału. Sekcje serca barwiono barwnikami trichromowymi Massona (Sigma-Aldrich, St Louis, Mo). Krótko mówiąc, sekcje zostały zaprawione w roztworze Bouina przez noc i przepłukane bieżącą wodą z kranu, aby usunąć żółć. Sekcje barwiono hematoksyliną Mayera, fuksyną szkarłatno-kwasową Biebricha, roboczym roztworem kwasu fosfotungstowego/fosfomolibdenowego i błękitem anilinowym przez 5 minut każdy, a następnie umieszczano w 1% kwasie octowym na 2 minuty. Sekcje zostały wypłukane, odwodnione w alkoholu, oczyszczone w ksylenie i utrwalone. Cytoplazma i włókna mięśniowe są czerwone, kolagen i jądra są niebieskie. Obszary zwłóknienia i całej lewej komory określano za pomocą morfometrii komputerowej przy użyciu oprogramowania do obrazowania BIOQUANT, a stosunek użyto do obliczenia obszaru blizny wyrażonego jako procent lewej komory. Stosunek włóknienia do żywotnego miokardium w obszarze okołozawałowym (włóknienie śródmiąższowe) określono za pomocą morfometrii komputerowej przy użyciu powiększenia ×20 i wyrażono jako procent powierzchni. Barwienie Von Kossa (Diagnostic Biosystem, Pleasanton, Calif) stosowano do wykrywania (przed)martwiczych złogów wapnia w mięśniu sercowym.
Poziomy cytokin
Krew pełną pobierano do probówek z cytrynianem sodu u 9 szczurów (4 leczonych anakinrą i 5 leczonych normalną solą fizjologiczną) w chwili śmierci i natychmiast odwirowywano 1000g w temperaturze 4°C przez 10 minut. Supernatant został zebrany i przefiltrowany przez filtr 0,22-μm. Próbki były następnie przechowywane w temperaturze -20°C, a następnie analizowane. Do oznaczenia krążących poziomów IL-1β, czynnika martwicy nowotworów-α, IL-6 i interferonu-γ użyto systemu multiplex cytokine bead array (Bio-Plex Cytokine Assay, Bio-Rad, Hercules, Calif), zgodnie z instrukcjami producenta. Mieszaninę reakcyjną odczytywano za pomocą czytnika matryc białkowych Bio-Plex, a dane analizowano za pomocą programu Bio-Plex Manager.
Synteza MMP
MMP-9, lub żelatynaza B, została wybrana jako prototypowa metaloproteinaza wyregulowana po AMI i związana z niekorzystnym remodelingiem.14,15 Całkowite rozpuszczalne białko ekstrahowano z miokardium zawałowego i okołozawałowego 7 dni po podwiązaniu naczyń wieńcowych u 6 myszy (3 leczonych anakinrą i 3 z solą fizjologiczną) za pomocą buforu zawierającego 20 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA i 1 mmol/L EGTA. Homogenat odwirowywano przy 14 000g przez 10 minut w temperaturze 4°C, a supernatant odzyskiwano. Następnie 50 μg białka z każdej próbki rozdzielano za pomocą 7,5% żeli akrylamidowych, przenoszono na membranę nitrocelulozową, a następnie blokowano za pomocą 5% suchego mleka beztłuszczowego w soli Tris-buforowanej Tween-20 (10 mmol/L Tris-HCl, pH 7,4, 100 mmol/L NaCl i 0,1% Tween 20) przez 1 godzinę. Następnie membranę inkubowano z kozim poliklonalnym przeciwciałem pierwotnym w rozcieńczeniu 1:1000 dla MMP-9 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Calif) przez 16 godzin w temperaturze 4°C, po czym przemywano i inkubowano z przeciwciałem wtórnym przeciwciałem anty-rabbitowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową (1:2000; Amersham Biosciences, Inc, Piscataway, NJ) przez 1 godzinę. Kleksy były wywoływane za pomocą systemu chemiluminescencyjnego. Widoczne były dwa pasma, odpowiadające pro-MMP-9 i aktywnemu MMP-9. Do pomiaru wybrano tylko aktywne pasmo (105 kDa) MMP-9. Gęstość optyczną dla każdego pasma zeskanowano i określono ilościowo za pomocą densytometrii i wyrażono jako stosunek aktywnego MMP-9 do β-aktyny.
Antypoptotyczne działanie preparatu Anakinra In Vitro
Kardiomiocyty komorowe izolowano od szczura za pomocą techniki enzymatycznej zmodyfikowanej zgodnie z wcześniejszym opisem.16 Krótko mówiąc, szczura znieczulono pentobarbitalem sodowym (100 mg/kg IP), a serce szybko usunięto z klatki piersiowej. W ciągu 3 minut otwór aorty kaniulowano do systemu perfuzyjnego Langendorffa, a serce poddawano wstecznej perfuzji. Trawienie enzymatyczne rozpoczynano od dodania kolagenazy typu II (0,5 mg/ml każda; Worthington Biochemical Corp, Lakewood, NJ) i proteazy typu XIV (0,02 mg/ml) do buforu perfuzyjnego i kontynuowano przez ≈15 minut. Następnie do roztworu enzymu dodawano 50 μmol/L Ca2+, aby perfundować serce przez kolejne 10-15 minut. Trawioną tkankę komorową krojono na kawałki i delikatnie aspirowano pipetą transferową, aby ułatwić dysocjację komórek. Osad komórkowy był ponownie zawieszany w celu przeprowadzenia 3-stopniowej procedury przywracania Ca2+ (tj. 125, 250 i 500 μmol/L Ca2+). Świeżo wyizolowane kardiomiocyty zostały następnie zawieszone w minimalnej pożywce podstawowej (numer katalogowy M1018, pH 7,35 do 7,45, Sigma). Następnie komórki zostały umieszczone na 35-mm płytkach do hodowli komórkowych, które zostały wstępnie pokryte 20 μg/mL mysiej lamininy w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami z 1% penicyliną-streptomycyną przez 1 godzinę. Kardiomiocyty hodowano w obecności 5% CO2 przez 1 godzinę w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C, co pozwoliło kardiomiocytom przylgnąć do powierzchni szalki przed rozpoczęciem protokołu eksperymentalnego. Następnie kardiomiocyty poddawano symulowanemu niedokrwieniu przez 40 minut, zastępując medium komórkowe „buforem niedokrwienia”, który zawierał 118 mmol/L NaCl, 24 mmol/L NaHCO3, 1,0 mmol/L NaH2PO4, 2,5 mmol/L CaCl2-2H2O, 1,2 mmol/L MgCl2, 20 mmol/L mleczan sodu, 16 mmol/L KCl i 10 mmol/L 2-deoksyglukozę (pH dostosowane do 6,2). Dodatkowo, komórki były inkubowane w warunkach hipoksji w temperaturze 37°C podczas całego okresu symulowanego niedokrwienia poprzez dostosowanie inkubatora trójgazowego do 1% do 2% O2 i 5% CO2. Po 40 minutach symulowano reperfuzję poprzez zastąpienie buforu niedokrwiennego normalnym medium w warunkach normoksycznych. W tym samym czasie na płytkę dodawano anakinrę w rosnących (×100) stężeniach, zaczynając od stężenia 25×10-16g/mL do stężenia 25×10-6g/mL (n=3 na grupę). Równoważna objętość normalnego medium została dodana do 3 płytek, aby służyła jako kontrola. Płytki inkubowano przez 18 godzin. Apoptozę kardiomiocytów analizowano za pomocą barwienia TUNEL zestawem zakupionym od firmy BD Biosciences (San Jose, Calif), który wykrywa fragmentację jądrowego DNA za pomocą testu fluorescencyjnego. W skrócie, po 40 minutach symulowanego niedokrwienia i 18 godzinach reperfuzji, komórki w 2-komorowych szkiełkach były utrwalane 4% formaldehydem/solą fizjologiczną buforowaną fosforanami w temperaturze 4°C przez 25 minut i poddawane testowi TUNEL zgodnie z protokołem producenta. Następnie szkiełka były przeciwbarwione środkiem montażowym Vectashield z 4,6-diamidino-2-fenyloindolem (barwnik interkalujący DNA do wizualizacji jąder w utrwalonych komórkach; numer katalogowy H-1200, Vector Laboratories, Burlingame, Calif). Wybarwione komórki badano pod mikroskopem fluorescencyjnym Olympus IX70 (Olympus Inc, Center Valley, Pa).
Anakinra Uptake In Vitro
KomórkiHL-1, mysia linia komórkowa mięśnia sercowego, która zachowuje cechy fenotypowe dorosłych kardiomiocytów, hodowano do konfluencji w podłożu Claycomb (Sigma Chemical Co) uzupełnionym 10% FCS (JHR Bioscience, Ltd, Andover, Hampshire, UK) i noradrenaliną 0.1 mmol/L (Sigma Chemical Co) na pokrytych żelatyną/fibronektyną 22-mm szklanych szkiełkach nakrywkowych umieszczonych na dnie 35-mm płytek Petriego.17 Następnie do komórek dodano anakinrę sprzężoną z FITC (10 μg/mL), a komórki inkubowano w temperaturze 37°C w warunkach normoksycznych lub hipoksyjnych (2% tlenu) w inkubatorze Micro galaxy, RS Biotech przez 5 godzin. Następnie komórki płukano dwukrotnie roztworem soli Hanksa zawierającym 10% FCS. Jądra komórkowe wybarwiano Hoechstem, a obserwacje prowadzono za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica DM 2000 (Meyer Instruments Inc, Houston, Tex).
Atesty aktywności kaspazy-1 i -9
Zahamowanie przez anakinrę aktywności kaspazy-1 i -9 oceniano za pomocą komercyjnych zestawów testów (QuantiZyme assay system, Plymouth, Pa) z użyciem rekombinowanej ludzkiej kaspazy-1 i YVAD-AMC, wariantu sekwencji YVHD występującego w miejscu rozszczepienia pro-Il-1β, jako fluorogenicznego substratu dla kaspazy-1 i Ac-LEHD-AMC dla kaspazy-9. Eksperyment przeprowadzono w temperaturze 22°C przy użyciu fluorometrycznego czytnika płytek (SLT, Fluostar, Tecan US, Research Triangle Park, NC) w trybie kinetycznym przy długości fali wzbudzenia i emisji odpowiednio 390 i 460 nm. Dla substratu stosowano stężenie początkowe 11,5 μmol/L (równoważne Km kaspazy-1), a następnie zwiększano je do 37,5 μmol/L w celu zbadania kompetycyjnej i niekompetycyjnej inhibicji.18 Dla anakinry wybrano dawkę początkową 100 nmol/L w obecności lub braku 10 μg/mL poliklonalnego przeciwciała blokującego anty-IL-1Ra (R&D Systems, Minneapolis, Minn), a następnie zwiększono do 300 i 900 nmol/L, aby ocenić pod kątem krzywej dawka-odpowiedź. Wykonano korekty ze ślepej próby, a krzywe dopasowano do punktu przecięcia 0,0, ponieważ zakłada się, że aktywność wynosi 0 w czasie 0. Nachylenia regresji (r>0,95) są uzyskiwane dla każdego eksperymentu przy każdej dawce, a współczynniki są porównywane między 3 grupami (anakinra, kontrola, anakinra plus przeciwciało blokujące). Eksperymenty przeprowadzono w trzech powtórzeniach dla każdej grupy, a krzywe wykonano co najmniej 5 razy dla każdej próbki. Wartość prawdopodobieństwa odzwierciedla 1-way ANOVA między grupami z 2-sided post-hoc testem Dunnetta porównującym każdą grupę z anakinrą.
Fizyczną interakcję i wiązanie między anakinrą a kaspazą-1 i -9 badano za pomocą koimmunoprecypitacji. Anakinra (1 μg) była inkubowana z komercyjnie dostępną rekombinowaną ludzką kaspazą-1 i -9 (1 μg, BIOMOL International, Plymouth Meeting, Pa) przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Następnie mieszaninę wytrącano przez dodanie jej do 2 różnych zestawów kulek sefarozowych sprzężonych z przeciwciałem anty-IL-1Ra (Santa Cruz) lub anty-kaspazą-1 (Santa Cruz). Frakcje związane z sefarozą były gotowane w buforze SDS i rozdzielane w SDS-PAGE. Koprecypitowane białka w każdym ustawieniu były następnie immunoblotowane i analizowane metodą Western blot. Przeciwciała anty-IL-1Ra i anty-kaspaza-1 lub -9 były używane do wykrywania immunoreaktywności anakinry i kaspazy-1, odpowiednio, w koprecypitacie. Jeśli nie doszło do koprecypitacji, spodziewano się pojedynczego pasma podczas Western blot odpowiadającego rozpuszczalnemu przeciwciału tego samego typu co przeciwciało związane z kulkami sefarozowymi (tj. immunostarzenie dla IL-1Ra w teście precypitacji kulek sefarozowych związanych z IL-1Ra). Gdyby doszło do koprecypitacji, wówczas oczekiwalibyśmy obecności podwójnego pasma dla obu rozpuszczalnych przeciwciał w obu próbach precypitacji (łącznie 4 pasma). Anakinra i kaspaza-1 lub -9 były prowadzone w Western blot w dodatkowych liniach i używane jako kontrole pozytywne.
Analiza statystyczna
Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu pakietu SPSS 11.0 dla Windows (SPSS Inc, Chicago, Ill). Zmienne ciągłe są wyrażone jako średnia i SE. Jednokierunkowa ANOVA została użyta do porównania środków między wieloma (>2) grupami z 2-stronnym testem Dunnetta post hoc w celu szczegółowego porównania efektów międzyprzedmiotowych z kontrolami w każdej grupie. Test t dla danych niesparowanych został użyty do porównania średnich tylko między 2 grupami. Do porównania parametrów echokardiograficznych przed interwencją i po interwencji między 4 różnymi grupami zastosowano metodę ANOVA z efektami losowymi dla powtarzanych miar, z 2-stronnym testem Dunnetta post hoc w celu szczególnego porównania efektów międzyprzedmiotowych (grupy AMI z anakinrą i solą fizjologiczną). Korelacje między 2 zmiennymi ciągłymi oceniano za pomocą testu Pearsona. Skonstruowano krzywe przeżycia Kaplana-Meiera, a do oceny istotnych różnic między grupami użyto testu log-rank. Wskaźniki przeżycia porównywano również za pomocą dokładnego testu Fishera. Nieskorygowane 2-ogonowe wartości prawdopodobieństwa są zgłaszane w całym badaniu, z istotnością statystyczną ustawioną na poziomie 0,05.
Autorzy mieli pełny dostęp do danych i biorą pełną odpowiedzialność za ich integralność. Wszyscy autorzy przeczytali i akceptują manuskrypt w takiej formie, w jakiej został napisany.
Wyniki
Badanie obejmowało ocenę działania anakinry in vivo (w modelu podwiązania tętnicy wieńcowej u myszy i szczurów) oraz in vitro (w pierwotnej hodowli kardiomiocytów szczurów, hodowli kardiomiocytów HL-1 i izolowanej kaspazy-1).
In Vivo Administration of Anakinra
Survival
Dwudzieści osiem myszy poddano eutanazji po 24 godzinach w celu oceny wielkości zawału. Sześć myszy poddano eutanazji w ciągu 7 dni w celu analizy ekspresji MMP-9; te myszy nie zostały uwzględnione w analizie przeżycia. W 7 dniu po podwiązaniu tętnicy wieńcowej, 15 z 16 myszy (94%) leczonych anakinrą żyło w porównaniu z 11 z 20 myszy (55%) leczonych solą fizjologiczną (P=0,013, test log-rank Kaplana-Meiera; P=0,021, dokładny test Fishera). Podobnie, 4 z 4 szczurów (100%), którym podano anakinrę, żyły, podczas gdy tylko 5 z 8 szczurów (62%), którym podano sól fizjologiczną, żyło. Wszystkie myszy (n=8) i szczury (n=8) poddane sham-operacji były żywe w 7 dniu.
Rozmiar zawału
Nie stwierdzono istotnych różnic w obszarze ryzyka i obszarze zawału (wyrażonym jako obszar zawału na obszar ryzyka) między myszami leczonymi solą fizjologiczną a myszami leczonymi anakinrą w dawkach 1- i 10-mg/kg; jednak anakinra w dawce 100 mg/kg wiązała się ze skromnym, ale istotnym (13%) zmniejszeniem rozmiaru zawału (P=0,015 w porównaniu z solą fizjologiczną; Figura 1).
Apoptoza
Stosowanie anakinry wiązało się ze znacznym zmniejszeniem apoptozy kardiomiocytów w mięśniu sercowym okołozawałowym w obu grupach leczenia natychmiastowego i opóźnionego (3,1±0,2% w porównaniu z 0,5±0,3%, P<0,001; i 4,2±0,4% w porównaniu z 1,1±0,2%, P<0,001, odpowiednio; Figura 2). Wskaźnik apoptotyczny w miokardium okołozawałowym był bezpośrednio skorelowany z oznakami niekorzystnego remodelingu, takimi jak LVEDD (r=0,65, P=0,001), LVESD (r=0,66, P<0,001), FS (r=-0,62, P=0,001), grubość rozkurczowa ściany przedniej (r=-0,50, P=0,012) i grubość skurczowa ściany przedniej (r=-0,50, P=0,012). Wskaźnik apoptozy w odległym mięśniu sercowym był niewykrywalny lub bardzo niski, bez istotnych różnic między zwierzętami z AMI (0,03±0,03%) i zwierzętami operowanymi metodą sham (0,01±0,01%) oraz między zwierzętami leczonymi anakinrą (0,02±0,02%) i zwierzętami leczonymi solą fizjologiczną (0,03±0,03%) (P>0,05 dla wszystkich analiz).
Włóknienie mięśnia sercowego i złogi wapnia
Nie stwierdzono różnic w zwłóknieniu mięśnia sercowego (tworzenie blizn, wyrażone jako procent lewej komory) pomiędzy myszami leczonymi anakinrą i solą fizjologiczną (31±2% versus 33±2%; P=0,81; Figura 1). Włóknienie śródmiąższowe w obszarze okołozawałowym było minimalne u myszy operowanych metodą sham (<0,1%), ale bardziej rozpowszechnione u myszy leczonych anakinrą i solą fizjologiczną bez istotnych różnic między grupami (13±2% versus 15±3%; P=0,58; Figura 1). Stwierdziliśmy minimalne ilości złogów wapnia w mięśniu sercowym przy użyciu barwienia von Kossa 1 tydzień po AMI (<0,1%) bez żadnych różnic między myszami leczonymi anakinrą i solą fizjologiczną.
LV Remodeling and Function
Przedinterwencyjne wartości LVEDD i LVESD były podobne we wszystkich grupach myszy i szczurów. Istotny wzrost LVEDD i LVESD oraz spadek grubości rozkurczowej ściany przedniej, grubości skurczowej ściany przedniej i FS u myszy leczonych solą fizjologiczną (w porównaniu z wartością wyjściową i sham ) zaobserwowano w 7 dniu (Rycina 3). W porównaniu z myszami leczonymi solą fizjologiczną, myszy z AMI otrzymujące anakinrę miały znacząco mniejsze wzrosty LVEDD i LVESD oraz spadek FS w 7 dniu w porównaniu z wartością wyjściową. Zmniejszenie grubości skurczowej ściany przedniej również było mniejsze u myszy leczonych anakinrą (w porównaniu do zwierząt leczonych solą fizjologiczną), co wskazuje na efekt ochronny w obszarze okołozawałowym, podczas gdy nie stwierdziliśmy istotnych różnic w grubości rozkurczowej ściany tylnej (odpowiednio 0,96±0,08 w porównaniu do 0,78±0,11; P=0,86) i grubości skurczowej ściany tylnej (odpowiednio 1,32±0,08 w porównaniu do 1,14±0,12; P=0,44). Myszy otrzymujące anakinrę miały również krótsze wartości izowolumetrycznego czasu skurczu (6±4 versus 16±5 ms; P=0,022) i izowolumetrycznego czasu relaksacji (12±5 versus 29±8 ms; P=0,042), a w konsekwencji niższy wskaźnik Tei (odzwierciedlający wydolność mięśnia sercowego) (0,28±0,03 versus 0,66±0,07; P=0,044; Rycina 3). Wskaźnik FS/Tei, który jeszcze ściślej koreluje z inwazyjnymi pomiarami dP/dt,19 również był istotnie wyższy u myszy z AMI leczonych anakinrą (0,74±0,06 w porównaniu do myszy leczonych solą fizjologiczną 0,17±0,02; P=0,008). Nie stwierdzono różnic pomiędzy myszami leczonymi solą fizjologiczną i anakinrą w grupie sham-operated (Figura 3).
Podobny wpływ na LVEDD i LVESD zaobserwowano w modelu szczurzym (Figura 4). Średni procentowy wzrost LVEDD i LVESD był istotnie większy u myszy niż u szczurów niezależnie od ramienia leczenia (P<0,001). Bezwzględna redukcja zmian LVEDD i LVESD za pomocą anakinry była istotnie większa u myszy niż u szczurów (P<0,001); jednak procentowe redukcje zmian LVEDD i LVESD były podobne u myszy (odpowiednio 56±6% i 53±5%) i u szczurów (68±7% i 47±4%; P=0,66 i P=0,32, odpowiednio), co wskazuje na podobne efekty natychmiastowego i opóźnionego podawania anakinry.
Infiltracja leukocytów
Nie stwierdzono różnic w liczbie leukocytów na 1 mm2 miokardium w obszarze zawału u zwierząt z AMI leczonych anakinrą i solą (Figura 4). Tempo apoptozy w tkance ziarninowej 1 tydzień po AMI było podobne u myszy leczonych anakinrą i solą fizjologiczną (Figura 4). Leukocyty były praktycznie nieobecne w odległych obszarach mięśnia sercowego i u zwierząt operowanych metodą sham-operated.
Poziomy cytokin
Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomach IL-1β, IL-6, czynnika martwicy nowotworów-α i interferonu-γ w osoczu (Rysunek 4).
Aktywność MMP-9
Aktywna MMP-9 była praktycznie niewykrywalna u zwierząt poddanych operacji pozorowanej, natomiast była konsekwentnie wykrywana u myszy z AMI 7 dni po operacji. Nie stwierdzono różnicy w poziomie aktywnego MMP-9 między myszami z AMI leczonymi solą fizjologiczną i anakinrą (Rysunek 4).
In Vitro Administration of Anakinra
Apoptosis
Incubation of cardiomyocytes with anakinra (2.5×10-12 g/mL) w czasie „symulowanej reperfuzji” (po 40 minutach „symulowanego niedokrwienia”) wiązała się z istotnym 36% zmniejszeniem apoptozy (11,2±0,5% versus 17,5±0,1% w kontroli). Zwiększanie (×100) stężenia anakinry do 25×10-6 g/mL nie wykazało dodatkowego zmniejszenia apoptozy, podczas gdy stężenia poniżej 25×10-12 g/mL nie miały wpływu na apoptozę (Figura 5).
Zwiększony komórkowy wychwyt anakinry podczas hipoksji
W porównaniu z normoksją, wychwyt anakinry podczas hipoksji był znacząco zwiększony, będąc widocznym w ≈95% komórek podczas hipoksji (versus 35% podczas normoksji; P=0,048; Figura 6).
Zahamowanie aktywności kaspazy-1 i -9
W warunkach in vitro, anakinra (100 do 900 nmol/L) znacząco hamowała aktywność kaspazy-1 i -9 o ≈50% (P<0,001 dla wszystkich wartości stężenia w porównaniu z kontrolą), bez różnic pomiędzy różnymi stężeniami. Anakinra zachowywała się jak mieszany konkurencyjny i niekompetycyjny inhibitor enzymatyczny dla kaspazy-1 (Ki, 0,201 μmol/L; Kic, 0,239 μmol/L; Kuc, 0,231 μmol/L) i dla kaspazy-9 (Ki, 0,31 μmol/L; Kic, 0,34 μmol/L; i Kuc, 0,28 μmol/L). Dodanie przeciwciał blokujących IL-1Ra odwróciło inhibicję kaspazy-1 i -9 przez anakinrę (Figura 7). Próba koprecypitacji potwierdziła fizyczną interakcję i wiązanie między anakinrą a kaspazą-1 i -9 (Figura 7).
Dyskusja
W badaniu tym po raz pierwszy wykazano, że egzogenna rekombinowana ludzka IL-1Ra anakinra podana w ciągu pierwszych 24 godzin od AMI znacząco poprawia przebudowę serca poprzez zmniejszenie apoptozy kardiomiocytów w 2 różnych modelach zwierzęcych okluzji tętnicy dozawałowej i że anakinra ma bezpośrednie działanie antyapoptotyczne na kardiomiocyty in vitro.
Biologia IL-1Ra
IL-1Ra jest uważana za reaktywator ostrej fazy.3,4 Obecnie rola endogennej IL-1Ra w zapaleniu jest niejasna. IL-1Ra wiąże się z receptorem IL-1 i dlatego jest konkurencyjnym inhibitorem aktywności IL-1, potencjalnie zachowując się jak środek przeciwzapalny.3 Jednakże, ponieważ IL-1 wiąże swój receptor z większym powinowactwem i istnieje nadmiar receptorów (efekt receptora zapasowego), rola endogennego agonisty wydaje się być ograniczona.3 Gen IL-1Ra jest dobrze zachowany w biologii, a różnice międzygatunkowe nie zostały zgłoszone. W tym badaniu testowaliśmy 2 najczęściej występujące gatunki gryzoni i odnotowaliśmy podobne efekty.
IL-1Ra w AMI
Stężenie IL-1Ra znacznie wzrasta po niedokrwieniu-reperfuzji mięśnia sercowego.7 Jej stężenie jest podwyższone wcześnie u pacjentów z AMI z uniesieniem odcinka ST,5 a im większy jest obszar zagrożonego mięśnia sercowego, tym większy jest wzrost stężenia IL-1Ra.6 Ponadto w badaniach obserwacyjnych wyższe stężenie IL-1Ra u pacjentów z ostrymi zespołami wieńcowymi wiązało się z niekorzystnym wynikiem.20,21 Niejasne pozostawało, czy IL-1Ra stanowi marker uszkodzenia, próbę kardioprotekcji poprzez aktywność przeciwzapalną, czy też mediator uszkodzenia. Nadekspresja IL-1Ra w szczurzym modelu globalnego niedokrwienia-reperfuzji po raz pierwszy wykazała kardioprotekcyjne działanie IL-1Ra, powodując zmniejszenie apoptozy kardiomiocytów o około 50%.8
Ekstogenna IL-1Ra
Rekombinowana ludzka IL-1Ra (anakinra) jest dostępna komercyjnie (produkowana przez firmę Amgen), zatwierdzona przez Food and Drug Administration i stosowana u dużej liczby pacjentów w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów.22-24 Rola IL-1 w patogenezie reumatoidalnego zapalenia stawów jest kluczowa. Wykazano, że systemowe podawanie anakinry jest bezpieczne i skuteczne u pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, prowadząc do modyfikacji aktywności choroby. Trwa badanie kliniczne anakinry u chorych z ostrymi zespołami wieńcowymi, ale jego wyniki nie są jeszcze dostępne.25 W niedawno opublikowanym badaniu II fazy 17 chorych z udarem niedokrwiennym mózgu było leczonych anakinrą podawaną w postaci 100-mg bolusa, a następnie 72-godzinnego wlewu; pozostałych 17 chorych otrzymywało odpowiednie placebo.26 Stwierdzono, że anakinra nie powodowała działań niepożądanych związanych z lekiem, a w analizie wtórnej wiązała się z większą liczbą chorych z minimalną niepełnosprawnością lub bez niepełnosprawności związanej z udarem. W eksperymentalnych modelach zwierzęcych udaru mózgu anakinra była związana ze zmniejszeniem apoptozy, zmniejszeniem stanu zapalnego i poprawą wyników behawioralnych.27,28
Mechanizm działania
Dokładny mechanizm, za pomocą którego anakinra wywiera swoje korzystne działanie, nie jest całkowicie jasny. Przyjęty pogląd jest taki, że anakinra podawana w dużych dawkach konkuruje z IL-1 i zmniejsza aktywność IL-1. Anakinra wiąże się z receptorem IL-1 typu I, ale zapobiega transdukcji sygnału wewnątrzkomórkowego poprzez uniemożliwienie interakcji pomiędzy receptorem IL-1 a białkiem pomocniczym IL-1. Wykazano, że IL-1Ra zmniejsza zależne od IL-1 wydzielanie prostaglandyny-E2, która może być bezpośrednio odpowiedzialna za toksyczność komórek i apoptozę.3,29 Nie wiadomo, czy anakinra zakłóca działanie IL-1 pochodzącej głównie z komórek zapalnych, czy też IL-1 uwalnianej lokalnie w sposób parakrynny lub autokrynny, a także czy wywiera bezpośredni wpływ na komórkę niezależnie od jej oddziaływania na receptor IL-1. Wewnątrzkomórkowe działanie IL-1Ra jest niezależne od wewnątrzkomórkowego szlaku sygnałowego IL-1,30 a opisano transmembranowy aktywny transport IL-1Ra przez receptor kanału purynergicznego P2X7.31 Efekty obserwowane in vitro, gdzie hodowane są tylko kardiomiocyty, sugerują, że wpływ anakinry na mięsień sercowy jest, przynajmniej częściowo, niezależny od obecności nacieku zapalnego. W tym modelu doświadczalnym nie stwierdzono wpływu anakinry na poziom krążących cytokin, naciek leukocytów w mięśniu sercowym ani aktywność MMP-9. Antyapoptotyczne działanie IL-1Ra zostało już opisane w neuronach i komórkach nabłonkowych.32,33 Efekty te są widoczne in vivo i in vitro, co sugeruje parakrynne lub autokrynne działanie IL-1Ra.32,33 Tutaj donosimy o wychwycie komórkowym przez anakinrę podczas niedokrwienia, wiązaniu między anakinrą a kaspazą-1 i -9 oraz znaczącym hamowaniu aktywności kaspazy-1 i -9 przez anakinrę. Dane uzyskane w warunkach in vitro, choć stanowią jedynie hipotezę dotyczącą zdarzeń in vivo ze względu na nieodłączne ograniczenia modeli, sugerują rosnący próg apoptozy indukowanej niedotlenieniem przy zastosowaniu anakinry.
Wykazujemy, że wczesne (natychmiastowe) lub opóźnione (24 godziny później) podanie anakinry zmniejsza apoptozę i zapobiega rozstrzeni serca po AMI. W dawce wykazanej w celu zahamowania apoptozy i zapobiegania rozszerzeniu (1 mg/kg), anakinra nie miała wpływu na wielkość zawału, gdy została podana wcześnie, a podobne korzyści w przebudowie są widoczne z anakinrą podaną 24 godziny po AMI, zgodnie z wpływem na przebudowę serca, która jest niezależna od oszczędzania zawału. Warto zauważyć, że korzystne działanie IL-1Ra w zwierzęcych modelach udaru mózgu jest również, przynajmniej częściowo, niezależne od czasu.34 Jednak, jak już zauważono w piśmiennictwie dotyczącym udaru, efekt oszczędzający zawał obserwowano przy 100-krotnie wyższej dawce anakinry. Nie wiadomo, czy niewielkie, ale istotne zmniejszenie wielkości zawału przy zastosowaniu większych dawek przełożyłoby się na istotne klinicznie korzyści w zakresie niewydolności serca lub przeżycia i wymaga dalszych badań.
Nieznany jest optymalny czas trwania leczenia IL-1Ra po AMI. W modelu odpowiedzi ściany naczynia na uszkodzenie, IL-1Ra podawana przez 28 dni wiązała się z większym efektem w porównaniu z IL-1Ra podawaną przez 14 dni.35 Co warte podkreślenia, nie stwierdzono efektu odbicia po przerwaniu leczenia IL-1Ra.35
Rola kaspaz w niedokrwieniu i niewydolności serca
Kaspazy są proteazami zaangażowanymi w kaskadę apoptotyczną i zapalną.36-40 Kaspaza-3 jest centralnym mediatorem kaskady apoptotycznej, prowadzącym do aktywacji wtórnych efektorów odpowiedzialnych za fragmentację DNA i rozszczepianie białek strukturalnych cytoszkieletu. Kaspaza-1, znana również jako enzym konwertujący interleukinę-1, jest uważana za kaspazę prozapalną, ponieważ m.in. przekształca pro-IL-1β w IL-1β. Kaspaza-1 jest jednak również jednym z enzymów, które rozszczepiają pro-kaspazę-3, prowadząc do jej aktywacji.36-40 Rzeczywiście, kaspaza-3 jest zwykle aktywowana w wyniku rozszczepienia przez inne kaspazy, takie jak kaspaza-9, która odgrywa centralną rolę w szlaku mitochondrialnym; kaspaza-8, która jest zaangażowana głównie w apoptozę pośredniczoną przez receptory; oraz kaspaza-1. Badania eksperymentalne wykazały, że zahamowanie aktywności kaspazy-1 wiąże się ze zmniejszeniem apoptozy i korzystniejszą przebudową po AMI niezależnie od poziomu IL-1.38,39 Biorąc pod uwagę, że IL-1 jest substratem dla kaspazy-1, sprawdziliśmy, czy IL-1Ra może wywierać swoje korzystne działanie poprzez bezpośrednie wewnątrzkomórkowe hamowanie kaspazy-1.40 Zgodnie z tym opisujemy po raz pierwszy, że anakinra wiąże się z kaspazą-1 in vitro i znacząco hamuje jej aktywność. Bezpośrednie hamowanie kaspazy-1 przez anakinrę może być odpowiedzialne, przynajmniej częściowo, za jej działanie przeciwzapalne i antyapoptotyczne. Anakinra może jednak wykazywać działanie antyapoptotyczne wynikające z pośredniego wpływu na aktywność kaspazy-1 poprzez zapobieganie translokacji kaspazy-1 do jądra i tym samym hamowanie apoptozy41 lub poprzez hamowanie kaspazy-9. Kaspaza-9 jest kluczowym mediatorem szlaku mitochondrialnego, prowadzącego do aktywacji apoptozy podczas niedotlenienia/niedokrwienia.37 To, czy hamowanie kaspazy-1 czy -9 odgrywa większą rolę w korzyściach obserwowanych z anakinrą, pozostaje do wyjaśnienia. W dawce badanej w tym badaniu anakinra prawdopodobnie miała podobne działanie hamujące na obie kaspazy, a opisywano wzajemne oddziaływanie między różnymi kaspazami w kaskadzie apoptotycznej.36-41
Farmakokinetyka anakinry i odpowiedź dawka-efekt
W badaniu I fazy z udziałem 25 zdrowych ochotników, pojedyncza dawka anakinry w dawce podobnej do stosowanej w tym badaniu (1 mg/kg) podana dożylnie wiązała się z poziomem w osoczu wynoszącym 3,1 μg/ml i okresem półtrwania wynoszącym 2,64 godziny.42 In vivo nie stwierdziliśmy istotnego wpływu na wielkość zawału przy zastosowaniu anakinry w dawce do 10 razy większej niż zalecana dawka, ale stwierdziliśmy niewielkie, ale istotne zmniejszenie wielkości zawału przy zastosowaniu dawki 100 razy większej. Nie jest pewne, czy ten efekt oszczędzający zawał związany z tak dużą dawką przełoży się na korzystny wynik długoterminowy i wymaga dalszych badań. In vivo, stężenie >106 niższe niż szczytowe stężenie w osoczu obserwowane u ludzi było związane ze znacznym zmniejszeniem apoptozy. Mniejsze dawki nie były skuteczne, natomiast większe dawki nie wykazywały działania addytywnego. Dane te są zgodne z profilem klinicznym anakinry, w którym zazwyczaj stosuje się standardową dawkę 1 mg/kg, a większe dawki wiążą się z większą liczbą miejscowych działań niepożądanych bez istotnych dodatkowych korzyści klinicznych.22-24 W niedawnym badaniu,43 anakinra podawana w dawce 100 mg (brutto równoważnej 1 mg/kg) była stosowana w celu zahamowania apoptozy komórek β trzustki i wykazano, że była dobrze tolerowana i wiązała się ze wskaźnikami lepszej czynności komórek β w porównaniu z placebo, nie wpływając na wrażliwość na insulinę.
Ischemia, apoptoza, a niewydolność serca po AMI
Znalezienie związku między apoptozą a remodelingiem wspiera koncepcję apoptozy jako centralnego mediatora remodelingu serca niezależnie od wielkości zawału.1,37,44 Brak różnic w wpływie na apoptozę lub przebudowę między strategią leczenia natychmiastowego i opóźnionego oraz brak wpływu na wielkość zawału przy podawaniu dawki 1 mg/kg sugeruje, że anakinra wpływa swoiście na podostrą przebudowę pozawałową, w której, jak wiadomo, główną rolę odgrywa apoptoza,1,36,43 nie wpływając na gojenie się zawału, degradację macierzy i włóknienie ani nie promując pęknięcia ściany.
Wnioski
Administracja anakinry w ciągu 24 godzin od AMI łagodzi przebudowę pozawałową, jednocześnie hamując apoptozę. Pomimo ograniczeń obecnego badania (takich jak stosunkowo niewielka próba ograniczona do płci męskiej, jednorazowe określenie w czasie interesujących nas wyników oraz użycie echokardiografii, która pozostaje suboptymalną i zależną od operatora metodą oceny przebudowy i funkcji LV), wyniki korzystnego działania egzogennej IL-1Ra (anakinra) podanej w ciągu 24 godzin od AMI mogą otworzyć nowe okno terapeutyczne dla leczenia uszkodzenia niedokrwiennego i przebudowy w zapobieganiu i leczeniu niedokrwiennej niewydolności serca.
Autorzy pragną podziękować dr Verze Di Trocchio (Virginia Commonwealth University, Richmond, Va) za jej wsparcie pisarskie, redakcyjne i graficzne oraz dr Federice Limana (Istituto Dermopatico Italiano, Rzym, Włochy) za jej przydatne sugestie dotyczące projektu badania. Lek (anakinra) użyty w eksperymentach został dostarczony bezpłatnie przez firmę Amgen Inc.
Źródła finansowania
Badanie to było wspierane przez nagrodę Thomas F. Jeffress and Kate Miller Jeffress Trust dla dr Abbate oraz przez grant szkoleniowy od Societá Italiana di Cardiologia dla dr Abbate. Praca ta była również częściowo wspierana przez National Institutes of Health grantami HL51045, HL59469 i HL79424 dla dr Kukreja oraz Mid-Atlantic Affiliate Beginning Grant-in-Aid od American Heart Association dla dr Das.
Disclosures
None.
Footnotes
- 1 Abbate A, Bussani R, Amin MS, Vetrovec GW, Baldi A. Acute myocardial infarction and heart failure: role of apoptosis. Int J Biochem Cell Biol. 2006; 38: 1834-1840.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 2 Severino A, Campioni M, Straino S, Salloum FN, Schmidt N, Herbrand U, Frede S, Toietta G, Di Rocco G, Bussani R, Silvestri F, Piro M, Liuzzo G, Biasucci LM, Mellone P, Feroce F, Capogrossi MC, Baldi F, Fandrey J, Ehrmann M, Crea F, Abbate A, Baldi A. Identification of protein disulfide isomerase (PDI) as a cardiomyocyte survival factor in ischemic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2007; 50: 1029-1037.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 3 Dinarello CA. Interleukin-1. Cytokine Growth Factor Rev. 1997; 8: 253-265.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 4 Gabay C, Kushner I. Białka ostrej fazy i inne ogólnoustrojowe odpowiedzi na zapalenie. N Engl J Med. 1999; 340: 448-454.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 5 Patti G, D’Ambrosio A, Mega S, Giorgi G, Zardi EM, Zardi DM, Dicuonzo G, Dobrina A, Di Sciascio G. Wczesne podwyższenie antagonisty receptora interleukiny-1 u pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego. J Am Coll Cardiol. 2004; 43: 35-38.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 6 Patti G, Mega S, Pasceri V, Nusca A, Giorgi G, Zardi EM, D’Ambrosio A, Dobrina A, Di Sciascio G. Poziomy antagonisty receptora interleukiny-1 korelują z zakresem utraty mięśnia sercowego u pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego. Clin Cardiol. 2005; 28: 193-196.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 7 Airaghi L, Lettino M, Manfredi MG, Lipton JM, Catania A. Endogenni antagoniści cytokin podczas niedokrwienia mięśnia sercowego i terapii trombolitycznej. Am Heart J. 1995; 130: 204-211.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 8 Suzuki K, Murtuza B, Smolenski RT, Sammut IA, Suzuki N, Kaneda Y, Yacoub MH. Overexpression of interleukin-1 receptor antagonist provides cardioprotection against ischemia-reperfusion injury associated with reduction of apoptosis. Circulation. 2001; 104 (suppl I): I-308-I-313.LinkGoogle Scholar
- 9 Salloum FN, Abbate A, Das A, Houser J-E, Mudrick CA, Qureshi IZ, Hoke NN, Roy SK, Brown WR, Prabhakar S, Kukreja RC. Sildenafil (Viagra) attenuates ischemic cardiomyopathy and improves left ventricular function in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2008; 294: H1398-H1406.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 10 Abbate A, Salloum FN, Ockaili RA, Fowler AA, Biondi-Zoccai GGL, Straino S, Lipinski MJ, Crea F, Biasucci LM, Vetrovec GW, Kukreja RC. Improvement of cardiac function with parecoxib, a cyclo-oxygenase-2 inhibitor, in a rat model of ischemic heart failure. J Cardiovasc Pharmacol. 2007; 49: 416-419.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 11 Schiller NB, Shah PM, Crawford M, DeMaria A, Devereux R, Feigenbaum H, Gutgesell H, Reichek N, Sahn D, Schnittger I. Zalecenia dotyczące ilościowej oceny lewej komory za pomocą dwuwymiarowej echokardiografii: American Society of Echocardiography Committee on Standards, Subcommittee on Quantitation of Two-Dimensional Echocardiograms. J Am Soc Echocardiogr. 1989; 2: 358-367.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 12 Tei C, Ling LH, Hodge DO, Bailey KR, Rodeheffer RJ, Tajik AJ, Seward JB. New index of combined systolic and diastolic myocardial performance: a simple and reproducible measure of cardiac function: a study in normals and dilated cardiomyopathy. Am J Cardiol. 1995; 26: 357-366.Google Scholar
- 13 Abbate A, Bussani R, Biondi-Zoccai GGL, Santini D, Petrolini A, De Giorgio F, Vasaturo F, Scarpa S, Severino A, Liuzzo G, Leone AM, Baldi F, Sinagra G, Silvestri F, Vetrovec GW, Crea F, Biasucci LM, Baldi A. Infarct-related artery occlusion, tissue markers of ischaemia, and increased apoptosis in the peri-infarct viable myocardium. Eur Heart J. 2005; 26: 2039-2045.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 14 Creemers EEJM, Cleutjens JPM, Smits JFM, Daemen MJAP. Hamowanie metaloproteinazy macierzy po zawale mięśnia sercowego. Circ Res. 2001; 89: 201-210.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 15 Ducharme A, Frantz S, Aikawa M, Rabkin E, Lindsey M, Rohde LE, Schoen FJ, Kelly RA, Werb Z, Libby P, Lee RT. Targeted deletion of matrix metalloproteinase-9 attenuates left ventricular enlargement and collagen accumulation after experimental myocardial infarction. J Clin Invest. 2000; 106: 55-62.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 16 Das A, Xi L, Kukreja RC. Phosphodiesterase-5 inhibitor sildenafil preconditions adult cardiac myocytes against necrosis and apoptosis: essential role of nitric oxide signaling. J Biol Chem. 2005; 280: 12944-12955.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 17 Claycomb WC, Lanson NA Jr, Stallworth BS, Egeland DB, Delcarpio JB, Bahinski A, Izzo NJ Jr. Komórki HL-1: linia komórek mięśnia sercowego, która kurczy się i zachowuje cechy fenotypowe dorosłego kardiomiocytu. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 2979-2984.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 18 Cortes A, Cascante M, Cardenas ML, Cornish-Bowden A. Zależności między stałymi inhibicji, stężeniami inhibitorów dla 50% inhibicji i typami inhibicji: nowe sposoby analizy danych. Biochem J. 2001; 357: 263-268.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 19 Broberg CS, Pantely GA, Barber BJ, Mack GK, Lee K, Thigpen T, Davis LE, Sahn D, Hohimer AR. Validation the myocardial performance index by echocardiography in mice: a noninvasive measure of left ventricular function. J Am Soc Echocardiogr. 2003; 16: 814-823.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 20 Biasucci LM, Liuzzo G, Fantuzzi G, Caligiuri G, Rebuzzi AG, Ginnetti F, Dinarello CA, Maseri A. Zwiększone poziomy interleukiny (IL)-1Ra i IL-6 podczas pierwszych 2 dni hospitalizacji w niestabilnej dławicy piersiowej są związane ze zwiększonym ryzykiem zdarzeń wieńcowych w szpitalu. Circulation. 1999; 99: 2079-2084.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 21 Patti G, Di Sciascio G, D’Ambrosio, Dicuonzo G, Abbate A, Dobrina A. Wartość prognostyczna antagonisty receptora interleukiny-1 u pacjentów poddawanych przezskórnej interwencji wieńcowej. Am J Cardiol. 2002; 89: 372-376.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 22 Furst DE. Anakinra: przegląd rekombinowanego ludzkiego antagonisty receptora interleukiny-1 w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów. Clin Ther. 2004; 26: 1960-1975.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 23 Dinarello CA. Rola antagonisty receptora interleukiny-1 w blokowaniu zapalenia mediowanego przez interleukinę-1. N Engl J Med. 2000; 343: 732-734.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 24 Informacje o produkcie Kineret. Dostępne na: http://www.kineretrx.com/pi.jsp#topPPI. Accessed March 16, 2008.Google Scholar
- 25 Crossman DC, Morton AC, Gunn JP, Greenwood JP, Hall AS, Fox KA, Lucking AJ, Flather MD, Lees B, Foley CE. Investigation of the effect of Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) on markers of inflammation in non-ST elevation acute coronary syndromes (the MRC-ILA-HEART Study). Trials. 2008; 9: 8-14.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 26 Emsley HC, Smith CJ, Georgiou RF, Vail A, Hopkins SJ, Rothwell NJ, Tyrell PJ, dla Acute Stroke Investigators. A randomized phase II study of interleukin-1 receptor antagonist in acute stroke patients. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 2005; 76: 1366-1372.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 27 Mulcahy NJ, Ross J, Rothwell NJ, Loddick SA. Opóźnione podawanie antagonisty receptora interleukiny-1 chroni przed przejściowym niedokrwieniem mózgu u szczura. Br J Pharmacol. 2003; 140: 471-476.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 28 Garcia JH, Liu KF, Relton JK. Antagonista receptora interleukiny-1 zmniejsza liczbę neuronów martwiczych u szczurów z okluzją tętnicy środkowej mózgu. Am J Pathol. 1995; 147: 1477-1486.MedlineGoogle Scholar
- 29 Takadera T, Yumoto H, Tozuka Y, Ohyashiki T. Prostaglandyna E2 indukuje apoptozę zależną od kaspazy w komórkach korowych szczurów. Neurosci Lett. 2002; 317: 61-64.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 30 Evans I, Dower SK, Francis SE, Crossman DC, Wilson HL. Działanie wewnątrzkomórkowej IL-1Ra (typ I) jest niezależne od wewnątrzkomórkowego szlaku sygnalizacyjnego IL-1. Cytokine. 2006; 33: 274-280.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 31 Wilson HL, Francis SE, Dower SK, Crossman DC. Wydzielanie wewnątrzkomórkowego antagonisty receptora IL-1 (typ I) jest zależne od aktywacji receptora P2X7. J Immunol. 2004; 173: 1202-1208.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 32 Nesic O, Xu GY, McAdoo D, High KW, Hulsebosch C, Perez-Polo R. Antagonista receptora IL-1 zapobiega apoptozie i aktywacji kaspazy-3 po urazie rdzenia kręgowego. J Neurotrauma. 2001; 18: 947-956.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 33 Sun CC, Pang JHS, Cheng HF, Lee YS, Ku WC, Hsiao CH, Chen JK, Yang CM. Interleukin-1 receptor antagonist (IL-1RA) prevents apoptosis in ex vivo expansion of human limbal epithelial cells cultivated on human amniotic membrane. Stem Cells. 2006; 24: 2130-2139.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 34 Mulcahy NJ, Ross J, Rothwell NJ, Loddick SA. Opóźnione podawanie antagonisty receptora interleukiny-1 chroni przed przejściowym niedokrwieniem mózgu u szczura. Br J Pharmacol. 2003; 140: 471-476.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 35 Morton AC, Arnold ND, Gunn J, Varcoe R, Francis SE, Dower SK, Crossman DC. Antagonista receptora interleukiny-1 zmienia odpowiedź na uszkodzenie naczynia w modelu tętnicy wieńcowej u świń. Cardiovasc Res. 2005; 68: 493-501.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 36 Cohen GM. Kaspazy: kaci apoptozy. Biochem J. 1997; 326: 1-26.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 37 Abbate A, Biondi-Zoccai GGL, Baldi A. Pathophysiologic role of myocardial apoptosis in post-infarction left ventricular remodeling. J Cell Physiol. 2002; 193: 145-153.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 38 Merkle S, Frantz S, Schon MP, Bauersachs J, Buitrago M, Frost RJA, Schmitteckert E, Lohse MJ, Engelhardt S. A role for caspase-1 in heart failure. Circ Res. 2007; 100: 645-653.LinkGoogle Scholar
- 39 Syed FM, Hahn HS, Odley A, Guo Y, Vallejo JG, Lynch RA, Mann DL, Bolli R, Dorn GW. Pro-apoptotic effects of caspase-1/interleukin-converting enzyme dominate in myocardial ischemia. Circ Res. 2005; 96: 1103-1109.LinkGoogle Scholar
- 40 Gottlieb R. ICE-ing the heart. Circ Res. 2005; 96: 1036-1038.LinkGoogle Scholar
- 41 Fankhauser C, Friedlander RM, Gagliardini V. Prevention of nuclear localization of activated caspases correlates with inhibition of apoptosis. Apoptosis. 2000; 5: 117-132.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 42 Granowitz EV, Porat R, Mier JW, Pribble JP, Stiles DM, Bloedow DC, Catalano MA, Wolff SM, Dinarello CA. Pharmacokinetics, safety, and immunomodulatory effects of human recombinant interleukin-1 receptor antagonist in healthy humans. Cytokine. 1992; 4: 353-360.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 43 Larsen CM, Faulenbacj M, Vaag A, Volund A, Ehses JA, Seifert B, Mandrup-Poulsen T, Donath MY. Interleukin-1 receptor antagonist in type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 2007; 356: 1517-1526.CrossrefMedlineGoogle Scholar
- 44 Abbate A, Biondi-Zoccai GGL, Bussani R, Dobrina A, Camilot D, Feroce F, Rossiello R, Baldi F, Silvestri F, Biasucci LM, Baldi A. Zwiększona apoptoza mięśnia sercowego u pacjentów z niekorzystnym remodelingiem lewej komory i wczesną objawową pozawałową niewydolnością serca. J Am Coll Cardiol. 2003; 41: 753-760.CrossrefMedlineGoogle Scholar
.