Antiasthmatic Effects of Sanglong Pingchuan Decoction through Inducing a Balanced Th1/Th2 Immune Response

Abstract

Objective. Zbadanie działania przeciwastmatycznego odwaru Sanglong pingchuan (SLPCD) i poznanie mechanizmów jego działania. Metody. Surowica, płyn z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF) i tkanki płuc myszy z astmą alergiczną wywołaną przez OVA zostały pobrane 24 godziny po ostatnim podaniu leku. Zmiany patologiczne w płucach obserwowano za pomocą barwienia H&E. Komórki zapalne w BALF liczono metodą cytometrii przepływowej. Poziom całkowitego IgE w surowicy i cytokin w BALF oznaczano metodą ELISA. Poziom ekspresji mRNA cytokin w płucach oceniano metodą qRT-PCR. Wyniki. SLPCD znacząco hamował zapalenie dróg oddechowych, zmniejszał liczbę komórek zapalnych w BALF, obniżał poziom całkowitej IgE w surowicy i cytokin Th2 (IL-10 i IL-13) w BALF oraz obniżał poziom ekspresji mRNA cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13) w płucach myszy chorych na astmę. Natomiast SLPCD znacząco podnosił poziom cytokiny Th1 IFN-γ w BALF i zwiększał poziom ekspresji mRNA cytokin Th1 (IL-2 i IFN-γ) w płucach myszy chorych na astmę. Wnioski. SLPCD może osłabiać zapalenie dróg oddechowych i łagodzić patogenezę astmy u myszy poprzez indukowanie zrównoważonej odpowiedzi Th1/Th2 i może działać jako skuteczny lek w leczeniu astmy.

1. Wprowadzenie

Astma jest złożoną, przewlekłą chorobą układu oddechowego, która charakteryzuje się nadreaktywnością oskrzeli, zapaleniem i przebudową dróg oddechowych, utrudnieniem przepływu powietrza oraz infiltracją różnego rodzaju komórek zapalnych indukowanych przez cytokiny i inne mediatory. Astma jest wywoływana przez czynniki środowiskowe, takie jak alergeny, wirusy i narażenie zawodowe u osób predysponowanych genetycznie, jednak jej ostateczna przyczyna jest niejasna. Częstość występowania astmy znacznie wzrosła na całym świecie, szczególnie u małych dzieci, stając się jedną z najczęstszych chorób układu oddechowego. Szacuje się, że na astmę choruje 300 milionów osób w różnych krajach. Obecnie najskuteczniejszymi lekami w leczeniu astmy są kortykosteroidy. Chociaż leki te mogą poprawić objawy astmy, nie leczą tej choroby. Środki te mają również poważne działania niepożądane, szczególnie u dzieci, w tym obniżenie odporności, wtórne infekcje, zanik mięśni, osteopenię, osteoporozę, zaćmę i jaskrę. Dlatego też ciągłe poszukiwanie nowych, bezpiecznych i skutecznych leków ma ogromne znaczenie.

Wiele tradycyjnych leków chińskich było stosowanych w leczeniu astmy od wieków i nadal są szeroko stosowane w krajach azjatyckich . Ostatnio opisano mechanizm działania wielu preparatów ziołowych stosowanych w leczeniu astmy alergicznej. Różne produkty naturalne pochodzenia roślinnego o właściwościach przeciwzapalnych zostały również przebadane pod kątem potencjalnego zastosowania w leczeniu astmy .

Sanglong pingchuan decoction (SLPCD) jest preparatem szpitalnym przepisanym przez profesora Qing Chang, krajowego lekarza weterana tradycyjnej medycyny chińskiej odziedziczonego mentora studiów, w Shaoxing Hospital of Traditional Chinese Medicine. SLPCD pochodzi z Shegan Mahuang Tang przez dodawanie i odejmowanie. Shegan Mahuang Tang jest dobrze znany tradycyjnej medycyny chińskiej recepty po raz pierwszy wymienione w Jin Kui Yao Lve. Jako reprezentatywna formuła rozpraszania zimna, łagodzenia zespołu zewnętrznego, ogrzewania płuc, eliminowania flegmy i łagodzenia astmy, Shegan Mahuang Tang jest szeroko stosowany w leczeniu astmy, zapalenia oskrzeli u dzieci, astmy oskrzelowej, zapalenia płuc, ostrego i przewlekłego zapalenia oskrzeli u osób starszych, rozedmy płuc i alergicznego nieżytu nosa. Formuła SLPCD składała się z trzynastu tradycyjnych chińskich leków wymienionych w tabeli 1. Badanie z randomizacją wykazało, że SLPCD jest skuteczny w leczeniu astmy, zwłaszcza w zmniejszaniu częstości zaostrzeń. Skuteczność SLPCD nie została jednak udowodniona w kontrolowanych eksperymentach.

W niniejszym badaniu, w celu dostarczenia podstaw doświadczalnych dla klinicznego zastosowania SLPCD w leczeniu astmy i zbadania mechanizmów jego działania, wykorzystano model mysiej astmy alergicznej indukowanej OVA, przeciwzapalne działanie SLPCD badano za pomocą badania histologicznego, liczenia komórek odpornościowych w płynie z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), kwantyfikacji całkowitej IgE w surowicy, cytokin w BALF i ekspresji mRNA cytokin w tkankach płuc.

2. Materiały i Metody

2.1. Materiały i odczynniki roślinne

Cortex Mori (numer partii: 140901), Pheretima Aspergillum (numer partii: 150406), Herba Ephedrae przetworzona w miodzie (numer partii: 150302), Rhizoma Belamcandae (numer partii: 141213), Semen Armeniacae Amarum (numer partii: 150312), Fructus Perillae pieczony w mieszance (numer partii: 150115), Scorpio (numer partii: 150126), Semen Descurainiae (numer partii: 150208), Flos Farfarae smażony w miodzie (numer partii: 150301), Herba Houttyniae (numer partii: 150327), Rhizoma Fagopyri Dibotrydis (numer partii: 150308), Radix Angelicae Sinensis (numer partii: 150213), i Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (numer partii: 140917) zostały zakupione z Shaoxing Hospital of Chinese Medicine i zostały uwierzytelnione przez profesora Yonghai Jiang z Shaoxing Institute for Food and Drug Control, Zhejiang, Chiny. Standardy kwasu chlorogenowego i rutyny zakupiono od Zhejiang Institute for Food and Drug Control, Hangzhou, Chiny, a czystość obu związków wynosiła ponad 98%.

Ovalbumin (OVA) zakupiono od Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA; zestawy ELISA wykrywające mysie IL-10, IL-13 i IFN-γ zakupiono od Wuhan Boster Biological Technology Co. Ltd., Hubei, Chiny; zestaw ELISA mysiej IgE pochodził od RayBiotech Inc., Norcross, GA, USA, płodowa surowica cielęca (FCS) pochodziła z Gibco, Grand Island, NY, USA. Oczyszczone anty-mysie CD16/CD32 (blok receptorów Fc), Ly-6G-FITC (klon: RB6-8C5), antygen F4/80 PE-Cy5 (klon: BM8), Ly-6C-APC (klon HK1.4), Fc epsilon Receptor 1 alfa (FceR1)-APC (klon: MAR-1), CD117 (c-Kit)-PE-Cy5 (c-Kit, klon: 2B8) i przeciwciała siglec-F-PE (klon: E50-2440) zakupiono w eBioscience, Inc, San Diego, CA, USA. Odczynnik Trizol zakupiono w firmie Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; odwrotna transkryptaza revert Aid™ M-MLV pochodziła z firmy Fermentas, Amherst, NY, USA; inhibitor rybonukleazy i oligo(dT)18 pochodziły z firmy Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd., Chiny; FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) pochodził z firmy Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA. Żel wodorotlenku glinu (Alum) zakupiono od China Animal Husbandry Industry Co., Ltd., Beijing, Chiny; deksametazon (Dex) pochodził od Hubei Tianyao Pharmaceutical Co., Ltd., Xiangyang, Chiny.

2.2. Przygotowanie SLPCD

Leki recepturowe SLPCD (440 g) macerowano w 8 podwielokrotnościach wody destylowanej przez 30 min, a następnie gotowano wodę przez 1 h. Po pierwszym wywarze pozostałości gotowano w 6 podwielokrotnościach wody destylowanej przez kolejne 30 min. Supernatant uzyskany z dwukrotnego odwaru przesączano przez jałową gazę i zatężano w aparacie rotavapor (Buchi, Szwajcaria) pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 65°C do końcowego stężenia 1,1 g surowego leku/ml. Skoncentrowany odwar przechowywano w temperaturze -20°C, a następnie rozcieńczano wodą destylowaną do kilku różnych stężeń przed użyciem.

2.3. Analiza SLPCD metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)

Analizę HPLC przeprowadzono przy użyciu kolumny Diamon C18 (250 mm × 5 mm, 5 μm) i detektora Waters 2996 PDA w aparacie Water 600E HPLC. Fazę ruchomą stanowiła mieszanina acetonitrylu (A) i 0,1% kwasu fosforowego (B). Elucję w gradiencie liniowym prowadzono w następujący sposób: 0-8 min przy 2% A, 8-35 min przy 6% A, 35-40 min przy 8% A, 40-45 min przy 13% A, 45-70 min przy 14% A, 70-80 min przy 17% A i 80-90 min przy 17-2% A. Szybkość przepływu wynosiła 1 ml/min, a objętość nastrzyku 10 μl. Temperatura kolumny była stale utrzymywana na poziomie 30°C. Analizę HPLC standardów (kwas chlorogenowy i rutyna) oraz próbek przeprowadzono w ustalonych warunkach doświadczalnych, jak wspomniano powyżej.

2.4. Zwierzęta doświadczalne

Kobiety myszy BALB/c w wieku 5 tygodni zostały zakupione z Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (certyfikat nr SCXK 2007-0005). Myszy były aklimatyzowane przez 1 tydzień przed użyciem. Karma dla gryzoni laboratoryjnych i woda z kranu były podawane ad libitum i utrzymywane w kontrolowanych warunkach z temperaturą 24 ± 1°C, wilgotnością 50 ± 10% i 12/12-godzinnym cyklem światło/ciemność. Wszystkie procedury były ściśle zgodne z przepisami ChRL dotyczącymi wykorzystania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi oraz z wytycznymi ustanowionymi przez Instytut Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu Zhejiang i zostały zatwierdzone przez uniwersytecki komitet ds. doświadczeń na zwierzętach.

2.5. Uczulenie, wyzwanie i leczenie myszy

Kobiety BALB/c podzielono na sześć grup: normalna grupa kontrolna (NC), grupa kontrolna modelu (MC), pozytywna grupa kontrolna (leczona Dex, 2 mg/kg) i grupy SLPCD (5,5, 11 i 22 g/kg). Każda grupa składała się z dziesięciu myszy. Zapalenie dróg oddechowych u myszy wywoływano za pomocą OVA. Zwierzęta immunizowano poprzez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu zawierającego 50 μg OVA i 200 μg wodorotlenku glinu przez 3 dni. W 14. dniu podawano uczulenie przypominające. Tydzień po ostatnim uczuleniu myszy poddawano ekspozycji na aerozolizowaną 2% OVA za pomocą nebulizatora PARI TurboBOY N (1205) (PARI GmbH, Niemcy) przez 1 h dziennie przez 8 dni. Cztery dni wcześniej uczulonym myszom podawano doustnie SLPCD w dawkach 5,5, 11 i 22 g/kg lub wstrzykiwano dootrzewnowo 2 mg/kg deksametazonu (Dex) codziennie przez 12 dni. Modelowe grupy kontrolne otrzymywały taką samą objętość soli fizjologicznej. Objętość dawki wynosiła 0,2 ml/10g masy ciała. Dziesięć myszy jako normalna grupa kontrolna było jedynie uczulanych i poddawanych działaniu soli fizjologicznej. Procedury zastosowane do uczulenia na OVA i wyzwania, jak również leczenie SLPCD, przedstawiono na rycinie 1.

Rycina 1

Protokół eksperymentalny dla modelu astmy wywołanej OVA i procesy leczenia.

2.6. Histopatologia płuc

Tkanki płuc pobrano 24 h po ostatnim podaniu, a następnie utrwalono 4% paraformaldehydem, osadzono w parafinie i wykonano sekcje o grubości 5 μm. Serię mikroskopów barwiono hematoksyliną i eozyną (H&E) w celu oceny histologicznej.

2.7. Bronchoalveolar Lavage Fluid (BALF) Collection and Flow Cytometry

BALF pobierano przez płukanie płuc roztworem buforowanym fosforanami (PBS) podawanym przez cewnik dotchawiczny 24 h po ostatnim podaniu. BALF odwirowywano przez 5 min, a komórki przemywano lodowatym PBS zawierającym 2% FCS. Komórki blokowano 0,5 μg oczyszczonego przeciwciała anty-mysiego CD16/CD32 (blok FcR) przez 10 min na lodzie w celu zahamowania niespecyficznego barwienia, a następnie barwiono kombinacją przeciwciał anty-mysiego Ly-6G-FITC, antygenu F4/80-PE-Cy5 i Ly-6C-APC lub przeciwciał FceR1-APC, CD117-FITC i Siglec-F-PE w temperaturze pokojowej przez 30 min w ciemności. Wybarwione komórki przemywano lodowatym PBS i ponownie zawieszano w PBS. Sto tysięcy zdolnych do życia komórek na każde leczenie analizowano przy użyciu cytometru przepływowego BD FACScan z oprogramowaniem CellQuest.

2.8. Pomiar całkowitego przeciwciała IgE w surowicy

Surowicę pobierano 24 h po ostatnim podaniu. Całkowite przeciwciała IgE wykrywano w poszczególnych próbkach surowicy za pomocą zestawu RayBio® mouse IgE ELISA. Próbki surowicy rozcieńczone w stosunku 1:1250 lub standard IgE dodano do płytek 96-dołkowych pokrytych specyficznym przeciwciałem anty-mysim IgE. Płytki inkubowano przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie czterokrotnie przemywano. Do każdego dołka dodawano przeciwciało wykrywające. Płytki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 h przed dodaniem ABC sprzężonego z peroksydazą chrzanową. Po inkubacji przez 45 min, płytki płukano i wywoływano za pomocą TMB przez 30 min w temperaturze pokojowej. Reakcję zatrzymywano przez dodanie 20 μl roztworu zatrzymującego. Absorbancję mierzono na czytniku ELISA (BIO-RAD 680) przy długości fali 450 nm.

2.9. Pomiar cytokin w BALF

Stężenia cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, i IL-13) i Th1 (IFN-γ i IL-2) w BALF wykrywano przy użyciu komercyjnych zestawów ELISA, jak poprzednio .

2.10. Ilościowy Real-Time PCR (qRT-PCR)

Poziomy ekspresji mRNA cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13) i Th1 (IFN-γ i IL-2) w tkankach płuc określono za pomocą qRT-PCR. Całkowite RNA izolowano z homogenizowanych tkanek płuc za pomocą odczynnika Trizol zgodnie z protokołem producenta, a odwrotną transkrypcję przeprowadzono jak poprzednio. Następnie przeprowadzono amplifikację w 20 μl reakcji z użyciem FastStart Universal SYBR Green Master. Real-time PCR przeprowadzono przy użyciu urządzenia ABI 7400 Real-Time PCR System. Primery do qRT-PCR zostały zsyntetyzowane przez Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. (Chiny). (Chiny), a ich sekwencje wymieniono w Tabeli 2. Cykl qPCR przeprowadzono w następujący sposób: wstępna denaturacja w 95°C przez 10 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95°C przez 10 s, annealing w 60°C przez 1 min. GAPDH był używany jako kontrola endogenna. Wydajność amplifikacji i specyficzność primerów została zweryfikowana dla każdego zestawu primerów. Poziomy ekspresji badanych genów w stosunku do GAPDH określono metodą i jako indukcję fałdową .

2.11. Analiza statystyczna

Dane zostały wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) i zbadane pod kątem ich statystycznej istotności różnic za pomocą ANOVA i testu post hoc Tukeya. -Wartości mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne.

3. Wyniki

3.1. HPLC Profile of SLPCD

Zawartość kwasu chlorogenowego i rutyny w SLPCD analizowano metodą HPLC. W porównaniu ze standardowymi związkami odniesienia, kwas chlorogenowy i rutyna zostały zidentyfikowane i oznaczone (Rysunek 2). Równania regresji krzywej wzorcowej wynosiły A = 3719,7C – 102166 (R2=0,9999) i A = 9137,3C – 408038 (R2=0,9996) odpowiednio dla kwasu chlorogenowego i rutyny. Stężenia kwasu chlorogenowego i rutyny w SLPCD wynosiły odpowiednio 1,4 mg/g i 0,15 mg/g.

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rysunek 2

Chromatogramy HPLC SLPCD. Przedstawiono reprezentatywne chromatogramy standardowych związków odniesienia (a) i SLPCD (b). ① kwas chlorogenowy i ② rutyna.

3.2. SLPCD Attenuated Airway Inflammation in Asthmatic Mice

Wpływ SLPCD na stan zapalny płuc u myszy astmatycznych indukowanych OVA obserwowano poprzez barwienie H&E, a wyniki przedstawiono na rycinie 3. Myszy z modelem astmy wykazywały poważniejsze śródmiąższowe, okołobronchiolarne i okołonaczyniowe nacieki komórek zapalnych w płucach w porównaniu z normalnymi myszami kontrolnymi. Jako kontrola pozytywna, Dex znacznie złagodził naciek śródmiąższowych, okołobronchiolarnych i okołonaczyniowych komórek zapalnych w płucach u myszy z astmą. Nacieki zapalne w płucach myszy uczulonych na OVA zostały również znacząco złagodzone przez SLPCD w porównaniu z kontrolą modelową.

(a)

(b)

(c)

(c)

(d)

(e)

(f)

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)

Rycina 3

Wpływ leczenia SLPCD na zmiany histopatologiczne w płucach. Sekcje płuc wybarwiono przy użyciu hematoksyliny i eozyny. Przedstawione fotomikrografy świetlne były reprezentatywne dla wycinków płuc od dziesięciu myszy z każdej grupy. (a) kontrola normalna (NC); (b) kontrola modelowa (MC); (c) deksametazon (Dex, kontrola pozytywna); (d) SLPCD (5,5 g/kg); (e) SLPCD (11 g/kg); i (f) SLPCD (11 g/kg).

3.3. SLPCD Reduced Inflammatory Cells in BALF of Asthmatic Mice

Aby ustalić wpływ SLPCD na infiltrację komórek zapalnych w płucach myszy astmatycznych indukowanych OVA, Liczbę komórek zapalnych, w tym eozynofilów (Sigilec F+), bazofili (CD117+), neutrofilów (Ly-6C+y-6), makrofagów (F4/), monocytów (Ly6G-Ly6C+) i komórek tucznych (FcER1+) w BALF przeprowadzono za pomocą cytometrii przepływowej. Jak pokazano na rycinie 4, liczba eozynofilów (1756-krotnie), makrofagów (114-krotnie), neutrofili (110-krotnie), bazofili (91,7-krotnie), monocytów (45,8-krotnie) i komórek tucznych (6,9-krotnie) w BALF od myszy chorych na astmę była znacznie podwyższona w porównaniu z normalnymi myszami kontrolnymi. Dex znacząco zmniejszył liczbę różnych komórek zapalnych badanych w BALF myszy astmatycznych (), prawie do poziomu zbliżonego do normalnych myszy. Liczby tych komórek zapalnych w BALF od myszy astmatycznych były znacząco zależnie od dawki zmniejszone przez SLPCD w porównaniu z grupą kontrolną modelu (, , lub ).

Rycina 4

Wpływ SLPCD na rekrutację komórek zapalnych do BALF u myszy z astmą indukowaną OVA. BALF pobierano 24 h po ostatnim podaniu preparatu, a skład komórek analizowano metodą FACS opisaną w tekście. Wartości przedstawione są jako średnie ± SD (). Istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną modelu astmatycznego (MC) oznaczono jako , , i . Dex: deksametazon (kontrola pozytywna), NC: normalna grupa kontrolna.

3.4. SLPCD Decreased Serum Total IgE Levels of Asthmatic Mice

Wpływ SLPCD na całkowity poziom IgE w surowicy u myszy astmatycznych przedstawiono na rycinie 5. Całkowity poziom przeciwciał IgE w surowicy u myszy z astmą był znacznie wyższy niż u normalnych myszy kontrolnych (). Jako pozytywny lek, Dex znacznie zmniejszył całkowity poziom przeciwciał IgE w surowicy u myszy astmatycznych indukowanych OVA (). Poziomy całkowitych przeciwciał IgE w surowicy u myszy astmatycznych były znacząco zależne od dawki przez SLPCD w porównaniu z grupą kontrolną modelu ().

Rycina 5

Wpływ SLPCD na poziomy całkowitego IgE w surowicy myszy astmatycznych indukowanych OVA. Surowicę pobrano 24 h po ostatnim podaniu i zmierzono poziomy całkowitego IgE za pomocą zestawów ELISA opisanych w tekście. Wartości są przedstawione jako średnie ± SD (). Istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną modelu astmatycznego (MC) oznaczono jako . Dex: deksametazon (kontrola pozytywna) i NC: normalna grupa kontrolna.

3.5. SLPCD Modulated the Levels of Cytokines in BALF of Asthmatic Mice

Poziomy cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-10, i IL-13) i Th1 (IFN-γ i IL-2) w BALF mierzono metodą ELISA. Jak pokazano na rycinie 6, prowokacja OVA doprowadziła do znacznego wzrostu poziomu IL-10 i IL-13 oraz spadku poziomu IFN-γ w BALF myszy chorych na astmę w porównaniu z normalną grupą kontrolną ( lub ). Natomiast zawartość IL-4, IL-5 i IL-2 w BALF myszy z grupy kontrolnej była bardzo niska i zbliżona do granicy wykrywalności. Podawanie SLPCD w trzech dawkach i Dex znacznie zmniejszyło poziom IL-13 i IL-10, jak również znacznie podniosło poziom IFN-γ w BALF myszy astmatycznych indukowanych OVA w porównaniu z modelowymi myszami kontrolnymi ( lub ) (Figura 6).

Rysunek 6

Wpływ SLPCD na poziom cytokin w BALF u myszy z astmą indukowaną OVA. BALF został pobrany 24 h po ostatnim podaniu. Poziom cytokin Th1 (IL-10 i IL-13) oraz Th1 (IFN-γ) w BALF mierzono przy użyciu zestawów ELISA opisanych w tekście. Wartości przedstawiono jako średnie ± SD (). Istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną modelu astmatycznego (MC) oznaczono jako i . Dex: deksametazon (kontrola pozytywna) i NC: normalna grupa kontrolna.

3.6. SLPCD Regulated the mRNA Expression Levels of Cytokines in Lung Tissues of Asthmatic Mice

Wpływ SLPCD na ekspresję mRNA cytokin typu Th1 i Th2 w tkankach płuc myszy chorych na astmę indukowaną OVA wykryto za pomocą qRT-PCR, a wyniki przedstawiono w Tabeli 3. W porównaniu z normalnymi myszami kontrolnymi, poziomy ekspresji mRNA cytokin typu Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13) były znacznie podwyższone, a poziomy ekspresji mRNA cytokin typu Th1 (IL-2 i IFN-γ) były znacznie obniżone w tkankach płuc myszy z astmą (P < 0,001). Podawanie SLPCD w trzech dawkach i Dex powodowało znaczące obniżenie poziomu ekspresji mRNA cytokin Th2 IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13 oraz podwyższenie poziomu ekspresji cytokin Th1 IL-2 i IFN-γ w tkankach płuc myszy z astmą w porównaniu z grupami modelu astmatycznego (P < 0,05, P < 0,01 lub P < 0,001).

Grupa Dawka IL-4 IL-5 IL-.10 IL-13 IL-2 IFN-γ NC – 1.00±0.14 1.00±0.23 1.00±0.19 1.00±0.31 1.00±0.19 1.00±0.13 MC – 38.91±2.96 5.22±0.64 7.49±0.23 142.3±14.6 0.73±0.13 0.59±0.15 CTX (mg/kg) 50 19.08±2.62 2.56±0.42 5.07±0.67 44,00±7,74 1,20±0,20 2,14±0,34 SLPCD (g/kg) 5.5 21.70±4.64 4.06±0.38 6.68±0.68 71.26±10.62 1.28±0.20 1.12±0.20 11 21.30±3.71 3.74±0.37 6.21±0.44 65.4±11.99 1.33±0.26 1.53±0.21 22 23.09±3.27 3.07±0.34 6.03±0.65 61.51±8.77 1.49±0.34 1.71±0,23

Tkanki płuc pobrano 24 h po ostatnim podaniu leku, a poziomy ekspresji mRNA GAPDH i cytokin wykryto metodą qRT-PCR z użyciem specyficznych starterów. Gen housekeeping GAPDH został użyty jako kontrola endogenna. Wartości przedstawione są jako średnie ± SD (). Istotne różnice w porównaniu z grupą kontrolną modelu astmatycznego (MC) oznaczono jako , , i . Dex: deksametazon (kontrola pozytywna) i NC: normalna grupa kontrolna.

Tabela 3

Wpływ SLPCD na poziom ekspresji mRNA cytokin w tkankach płuc myszy astmatycznych indukowanych OVA.

4. Dyskusja

Astma stała się problemem zdrowia publicznego na całym świecie, zwłaszcza w krajach rozwiniętych. Glikokortykoidy są terapią pierwszego rzutu w leczeniu i kontroli astmy. Chociaż leki te mogą poprawić objawy astmy, były one ściśle kontrolowane do trwałego stosowania z powodu ich poważnych działań niepożądanych. Dlatego też konieczne są nowe metody leczenia astmy. Wiele tradycyjnych leków chińskich wykazuje różne aktywności biologiczne, w tym działanie przeciwbakteryjne, przeciwgrzybicze, przeciwzapalne, przeciwanafilaktyczne i immunomodulacyjne, które mają potencjał w leczeniu astmy. Opisano różne modele alergicznego zapalenia oskrzelowo-płucnego u myszy doświadczalnych. Model mysi astmy alergicznej indukowanej OVA odtwarza wiele cech astmy ludzkiej, co zyskało szeroką akceptację. Dlatego też zbadaliśmy działanie przeciwastmatyczne SLPCD i zbadaliśmy jego mechanizmy molekularne przy użyciu tego modelu.

SLPCD składa się z 13 tradycyjnych chińskich leków. Cortex Mori, Pheretima Aspergillum i Herba Ephedrae to podstawowe składniki, które rozpraszają płuca i łagodzą astmę. Semen Armeniacae Amarum, pieczony Fructus Perillae, Semen Descurainiae i smażony w miodzie Flos Farfarae są składnikami pomocniczymi, które zmniejszają ilość flegmy, łagodzą kaszel i astmę. Składniki wspomagające to Rhizoma Belamcandae, Herba Houttyniae i Rhizoma Fagopyri Dibotrydis, które usuwają zło gorąca i powierzchowne zło, jak również Scorpio i Radix Angelicae Sinensis, które rozpraszają zastoje krwi, pogłębiają boczne, spazmolizują i zatrzymują astmę. Radix et Rhizoma Glycyrrhizae harmonizuje wszystkie leki. Wszystkie składniki razem wzięte uzupełniają się wzajemnie, aby osiągnąć rezultaty w postaci rozproszenia płuc, zejścia Qi oraz złagodzenia kaszlu i astmy. Kontrola jakości SLPCD użytego w tym badaniu została podjęta przy użyciu HPLC, a dwie substancje chemiczne odniesienia (kwas chlorogenowy i rutyna) zostały zidentyfikowane jako główne składniki indeksu (rysunek 2).

Allergic asthma jest zdefiniowana jako ostra-na-przewlekła choroba zapalna dróg oddechowych z charakterystyczną rekrutacją eozynofilów, hiperplazją komórek zwojowych, hipersekrecją śluzu, odkładaniem kolagenu, przerostem komórek mięśni gładkich i zwłóknieniem podnabłonkowym. W tym badaniu oceniano wpływ leczenia SLPCD na stan zapalny płuc u myszy z astmą oskrzelową zakażonych OVA za pomocą barwienia H&E. Typowe alergiczne nagromadzenie i naciek komórek zapalnych obserwowano w tkankach płuc myszy z modelem astmatycznym. Leczenie SLPCD zmniejszyło nacieki zapalne w tkankach płuc myszy z astmą (Figura 3), sugerując, że SLPCD znacznie złagodził zapalenie dróg oddechowych.

Zapalne komórki immunologiczne odgrywają kluczową rolę w patogenezie i ciężkości astmy. Komórki zapalne rekrutujące się z regionalnych węzłów chłonnych do dróg oddechowych mogą wydzielać cytokiny i chemokiny, powodując nadreaktywność dróg oddechowych. Zmniejszenie liczby komórek zapalnych w drogach oddechowych jest skutecznym sposobem leczenia astmy. Aby potwierdzić, że SLPCD może hamować infiltrację komórek zapalnych, dalej liczyliśmy eozynofile, makrofagi, neutrofile, bazofile, monocyty i komórki tuczne w BALF. Inhalacja OVA doprowadziła do znacznego wzrostu liczby tych sześciu rodzajów komórek zapalnych w BALF (rysunek 4). Fałdy wzrostu wynosiły 1756, 114, 110, 91,7, 45,8 i 6,9 razy odpowiednio dla eozynofilów, makrofagów, neutrofili, bazofili, monocytów i komórek tucznych, co wskazuje na zadowalające ustanowienie modelu zaostrzenia astmy w tym badaniu. Leczenie SLPCD znacząco i zależnie od dawki zmniejszyło liczbę tych komórek zapalnych, zwłaszcza eozynofilów, w BALF w porównaniu z myszami chorymi na astmę (ryc. 4). Wyniki te sugerowały, że SLPCD zmniejszał infiltrację komórek zapalnych do płuc u myszy astmatycznych indukowanych OVA, co było zgodne z wynikami obserwacji histopatologicznych.

Wiadomo, że podwyższenie poziomu przeciwciał IgE było skorelowane z alergicznym zapaleniem dróg oddechowych i nadreaktywnością oskrzeli u myszy będących modelami astmy. Coyle i wsp. donieśli, że przeciwciała anty-IgE tłumiły eozynofilowe zapalenie dróg oddechowych i nadreaktywność oskrzeli u myszy chorych na astmę. IgE indukowane alergenem pobudzało eozynofile, bazofile i komórki tuczne do wydzielania cytokin IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13. Dlatego oceniliśmy całkowity poziom IgE w surowicy i stwierdziliśmy, że SLPCD może znacznie obniżyć całkowity poziom IgE w surowicy u myszy z astmą zakażonych OVA (Figura 5).

Nierównowaga komórek Th1/Th2 jest uważana za immunologiczną przyczynę astmy. W astmie aktywność komórek Th1 jest zmniejszona, podczas gdy aktywność komórek Th2 jest aktywowana, co powoduje wzrost cytokin typu Th2 i spadek cytokin Th1. Migrujące do płuc komórki Th2 wydzielają prototypowe cytokiny typu Th2: IL-4, IL-5 i IL-13, powodując hiperplazję komórek zarodkowych, skurcz oskrzeli i eozynofilię w drogach oddechowych. In vitro, IL-13 może pośredniczyć w produkcji IgE i może odgrywać kluczową rolę w patogenezie chorób alergicznych indukowanych przez IgE. IL-13 może również zwiększać przeżywalność eozynofilów i przyczyniać się do patologicznej aktywności tych komórek w astmie. Myszy z nadekspresją IL-13 replikują kilka cech astmy, w tym eozynofilię płucną, hiperplazję nabłonka, niedrożność dróg oddechowych i hiperreakcję na leki cholinergiczne. Z drugiej strony, komórki aktywowane Th1 mogą hamować stan zapalny dróg oddechowych w astmie. Cytokiny Th1, takie jak IFN-γ, hamują indukowaną alergenami rekrutację eozynofilów i uwalnianie IgE poprzez zmniejszenie ekspresji GATA-3, IL-4 i IL-5 w tkankach płuc modelu astmy. W niniejszej pracy ocenialiśmy wpływ SLPCD na poziom cytokin w BALF pochodzącym od myszy chorych na astmę. Wyniki wykazały, że SLPCD w sposób zależny od dawki nie tylko zmniejszał poziom IL-13 i IL-10, ale także podnosił poziom IFN-γ w BALF myszy z astmą (rysunek 6). Hamujące działanie leczenia SLPCD na produkcję cytokin Th2 było zgodne z jego wpływem na poziom całkowitego IgE w surowicy.

Donoszono, że IL-5 odgrywa ważną rolę w proliferacji, różnicowaniu, dojrzewaniu i migracji do miejsc tkankowych eozynofilów . Poziomy ekspresji IL-5 mRNA w biopsjach oskrzeli od astmatyków były podwyższone w porównaniu z nieastmatycznymi kontrolami. Poziomy ekspresji mRNA IL-5 były skorelowane z ciężkością kliniczną astmy. Skumulowana prowokacja alergenowa zwiększała ekspresję IL-4 mRNA w komórkach BALF i obwodowych limfocytach T CD4+ i CD8+. Wskazuje się, że IL-10 również bierze udział w rozwoju astmy. Wzrost ekspresji transkryptów IL-13 w komórkach BALF pacjentów z łagodną astmą po podaniu małej dawki alergenu jest zgodny z wyższym poziomem ekspresji IL-13 mRNA w błonie śluzowej oskrzeli. Wpływ leczenia SLPCD na poziom ekspresji mRNA cytokin w tkankach płuc myszy chorych na astmę określono za pomocą qRT-PCR. Leczenie SLPCD znacząco obniżyło poziom ekspresji mRNA cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-10 i IL-13) i podwyższyło poziom ekspresji cytokin Th1 (IL-2 i IFN-γ) w płucach myszy chorych na astmę. Wyniki te dodatkowo potwierdziły regulacyjny wpływ leczenia SLPCD na odpowiedzi cytokin Th1 i Th2 w tkankach płuc myszy z astmą.

Podsumowując, SLPCD może znacząco zahamować zapalenie dróg oddechowych, zmniejszyć liczbę komórek zapalnych w BALF, obniżyć całkowity poziom IgE w surowicy i modulować zawartość cytokin w BALF oraz ekspresję mRNA cytokin w płucach myszy z astmą. Wyniki te sugerują, że SLPCD może osłabić zapalenie dróg oddechowych i złagodzić patogenezę w mysim modelu astmy poprzez indukowanie zrównoważonej odpowiedzi Th1/Th2 i zatwierdzić jej kliniczne zastosowanie jako skutecznego leku w leczeniu astmy.

Ujawnienie

Obecny adres Binnian Zhu to ACON Biotech (Hangzhou) Co., Ltd., Hangzhou 310030, China.

Konflikt interesów

Autorzy oświadczają, że nie występują konflikty interesów.

Wkład autorów

Binnian Zhu i Jun Dong w równym stopniu przyczynili się do powstania tej pracy badawczej.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Grant-in-Aid z Shaoxing Science and Technology Project (nr 2014B700722).

.