[Antigen retrieval: its significance and drawbacks in immunohistochemistry]

Jednym z największych problemów w immunohistochemii było to, jak utrzymać zarówno dobrą morfologię, jak i immunoreaktywność antygenów w wycinkach tkanek. Opracowano różne techniki odzyskiwania immunoreaktywności antygenów (unmasking) po rutynowych preparatach tkankowych, takich jak utrwalanie, odwadnianie i zatapianie, które obecnie znajdują zastosowanie w immunobarwieniach nie tylko w badaniach cytohistologicznych, ale także w diagnostyce patoklinicznej. W niniejszym opracowaniu, po pierwsze, omówiono mechanizmy i znaczenie utrwalania i pobierania antygenów z punktu widzenia inaktywacji białek. Po drugie, dokonano przeglądu niektórych praktycznych problemów i uwag dotyczących dwóch najpopularniejszych technik demaskowania, trawienia enzymatycznego i heat-induced epitope retrieval (HIER), w celu precyzyjnego zaadaptowania tych technik w immunohistochemii. Głównym artefaktem wywoływanym przez utrwalanie jest maskowanie antygenów tkankowych w wyniku wiązań krzyżowych pomiędzy resztami aminokwasowymi białek. Ważne jest, aby wybrać odpowiednie warunki utrwalania dla każdego antygenu, biorąc pod uwagę jego charakter biochemiczny i odporność na utrwalanie. (Tabela 2), oraz utrzymanie warunków utrwalania na minimalnym poziomie, tak aby immunoreaktywność antygenu mogła być łatwo odzyskana za pomocą różnych technik demaskowania (Tabela 3, Ryc. 1). Odzyskanie antygenu per se jest procesem powodującym denaturację białka w tkankach, podobnie jak wiele innych procesów inaktywacji białka (Tabela 1). Trawienie enzymatyczne może wytrawić maskujące części białek wokół antygenu, aby odsłonić jego epitop. Chociaż trawienie enzymatyczne jest stosunkowo proste, a warunki obróbki łatwe do kontrolowania, wyniki nie zawsze są dramatyczne i spójne w zależności od rodzaju lub partii enzymów. Tak więc, należy znaleźć swój własny podręcznik trawienia, aby osiągnąć najlepszy wynik barwienia dla każdego antygenu (np., Tabela 4). Na przykład, trawienie pepsyną dało najlepsze wyniki w barwieniu immunologicznym bromo-deoksyurydyny (BrdU) i antygenu jądrowego komórek proliferujących (PCNA), podczas gdy inne enzymy miały niewielki wpływ (Tabela 5). Ogrzewanie może również rozszczepiać szkielet polipeptydowy i zaburzać wiązania krzyżowe powstałe w wyniku utrwalania. Wpływ ogrzewania na odzyskiwanie antygenu jest zależny od temperatury i wydaje się być proporcjonalny do iloczynu temperatury i czasu. W przypadku barwienia PCNA na skrawkach utrwalonych paraformaldehydem wymagane było ogrzewanie w temperaturze 90 stopni C przez co najmniej 3 minuty, jednak w miarę zaostrzania się warunków ogrzewania wzrastała również ilość niespecyficznych plam tła (Tabela 6), co jest jednym z najpoważniejszych problemów w odzyskiwaniu antygenu (Ryc. 2a, c). Jednym z możliwych sposobów uniknięcia tego typu niepożądanych wyników jest połączenie suboptymalnego ogrzewania (w temperaturze 80 stopni C przez 10-15 min) z trawieniem pepsyną (ryc. 2b, d). Ważnym teoretycznym rozważaniem przy stosowaniu tak drastycznej metody denaturacji jest to, czy zamaskowane epitopy antygenowe mogą być odpowiednio wyeksponowane bez dawania fałszywie dodatnich (lub fałszywie ujemnych) wyników z uprzednio zaufanymi przeciwciałami. Wydaje się, że każdy antygen wymaga „szytego na miarę” preparatu tkankowego dla optymalnego zachowania jego antygenowości i precyzyjnej lokalizacji. Wraz z rozwojem immunologii, biologii molekularnej, genetyki czy embriologii powinno wzrosnąć zapotrzebowanie na wielokrotne barwienie immunologiczne w połączeniu z innymi technologiami, takimi jak hybrydyzacja in situ, w celu analizy przestrzennych i funkcjonalnych zależności pomiędzy różnymi cząsteczkami in situ. Pobieranie antygenów stałoby się wtedy potężną strategią.