Apc-related models of intestinal neoplasia: a brief review for pathologists

Rak jelita grubego jest częstą przyczyną umieralności z powodu nowotworów w świecie zachodnim. W wielu praktykach patologicznych gruczolaki jelita grubego usuwane podczas przesiewowych kolonoskopii stanowią duży odsetek codziennej pracy, a zatem morfologia ludzkiego raka jelita grubego i gruczolaków, jego zmian prekursorowych, jest znana patologom chirurgicznym. W ośrodkach akademickich patolodzy chirurgiczni mogą być proszeni o interpretację mysich modeli nowotworów dla badaczy, a podstawowe zrozumienie podobieństw i różnic między morfologią ludzkiej neoplazji jelitowej a modelami mysimi jest niezbędne do dokładnej interpretacji.

Genetycznie zmienione mysie modele nowotworzenia, chociaż czasami krytykowane za niedoskonałe modelowanie choroby ludzkiej, są przydatne w ocenie, czy określone mutacje mogą prowadzić do powstawania nowotworów, w badaniach nad chemoprewencją oraz w wyjaśnianiu funkcjonalności zmienionych produktów genowych. Chociaż w literaturze naukowej opisano wiele genetycznie modyfikowanych mysich (GEM) modeli nowotworów jelitowych, można je ogólnie podzielić na 5 grup: modele związane z Apc ze zmianami w sygnalizacji Wnt, modele z niedoborem naprawy niedopasowania, modele poddane działaniu karcynogenów, modele ze zmianami w transformującym czynniku wzrostu β oraz nowotwory związane z zapaleniem jelita grubego powstające w modelach upośledzonych immunologicznie, takich jak myszy IL10-/-. Ten przegląd skupi się na patologii jednego z pierwszych modeli GEM nowotworów jelita, myszy ApcMin+/- i modeli pokrewnych, w celu opisania cech morfologicznych zmian jelitowych, z porównaniem do ludzkich gruczolaków i raków jelita grubego.

Jednym z najczęściej stosowanych modeli ludzkich nowotworów jelita jest model ApcMin+/-, opracowany w 1990 roku w laboratorium Williama Dove (Moser i in., 1990). Mysz ApcMin+/-, pierwszy mysi model mutacji germinalnej nowotworu jelita, jest nosicielem autosomalnej dominującej mutacji utraty funkcji w kodonie Apc 850 wygenerowanej przez ekspozycję na N-etylo-N-nitrozomocznik (ENU), silnie działający mutagen. Od tego czasu wygenerowano szereg innych modeli z mutacją Apc, wiele z mutacjami truncatingowymi (Tabela 1).

Tabela 1 ApcMin+/- i wybrane powiązane genetycznie zmienione mysie modele neoplazji jelitowej

Te modele związane z Apc są szczególnie użyteczne, ponieważ najczęstszą mutacją sterującą rakiem jelita grubego u ludzi jest mutacja w genie supresorowym nowotworu APC, Prowadzi to do inaktywacji APC i aktywacji szlaku sygnałowego Wnt, ze stabilizacją β-kateniny i jej translokacją do jądra. Gen APC u ludzi koduje 213 kilodaltonowe białko zaangażowane w adhezję i ruchliwość komórek, regulację cyklu komórkowego, apoptozę i transdukcję sygnału (Boman & Fields, 2013), a jego mutacja germinalna skutkuje rodzinną polipowatością gruczolakowatą (FAP). Ten zespół predyspozycji nowotworowych charakteryzuje się rozwojem setek gruczolaków jelita grubego, prowadzących do gruczolakoraka w młodym wieku. Większość mutacji powodujących FAP znajduje się w 5′ połowie genu i skutkuje obciętymi polipeptydami.

Genetyka modeli zwierzęcych związanych z APC

Wiele modeli mysich związanych z Apc zostało zaprojektowanych tak, aby zawierały mutacje germinalne w Apc, które prowadzą do ekspresji obciętego białka Apc; w większości tych modeli tylko heterozygoty są zdolne do życia, ponieważ homozygotyczność jest śmiertelna zarodkowo. Utrata kontroli wzrostu po utracie pozostałej kopii Apc typu dzikiego prowadzi do powstania mnogich gruczolaków jelitowych. Specyficzna lokalizacja mutacji Apc wpływa na mnogość polipów, lokalizację i długość życia myszy (McCart et al., 2008). Na przykład, mysz Apc1638N/+ ma zmniejszone obciążenie polipami i dłuższą żywotność w porównaniu do myszy ApcMin/+ (Smits i in., 1998), u myszy Apc1322T zmutowane białko zachowuje jedno 20-aminokwasowe powtórzenie wiążące/degradujące β-kateninę (u myszy ApcMin/+ nie ma go wcale); gruczolaki u tych myszy są wykrywalne wcześniej, mają cięższą dysplazję i są większe (Pollard i in., 2009) w porównaniu z myszami ApcMin/+. Czas utraty funkcji Apc może być również ważny; na przykład stopniowa utrata Apc przy użyciu Apc(Min/CKO) lub Apc(1638N/CKO) powoduje rażąco widoczną neoplazję w jelicie, podczas gdy jednoczesna utrata prowadzi do ukrytej ekspansji klonalnej poprzez rozszczepienie krypt bez morfologicznej transformacji (Fischer i in., 2012). Delecja całego genu Apc u myszy ApcΔel-15 powoduje szybszy rozwój nowotworu w porównaniu do truncacji Apc, ze zmniejszoną przeżywalnością, cięższą polipowatością i bardziej zaawansowaną progresją nowotworów jelita grubego w porównaniu do myszy ApcMin/+ (Cheung i in., 2010).

Genetycznie zmienione modele szczurów z mutacją Apc są również dostępne i są atrakcyjne ze względu na długowieczność modeli i względną łatwość wykonywania kolonoskopii, co pozwala na eksperymenty podłużne (Tabela 2). Najpopularniejsze z nich to szczur Kyoto Apc Delta (KAD) i szczur Pirc. Szczur KAD został wyprowadzony poprzez mutagenezę ENU i posiada mutację nonsensowną w kodonie 2523 w eksonie 15 Apc, dając okrojone białko. Szczury te są zdolne do życia w stanie homozygotycznym i nie rozwijają spontanicznie guzów jelitowych. Leczenie azoksymetanem i sodowym siarczanem dekstranu (AOM/DSS) jest konieczne do wywołania neoplazji jelit. Szczur Pirc, również produkowany poprzez mutagenezę wywołaną ENU, posiada mutację Apc w nukleotydzie 3409, co powoduje powstanie okrojonego białka. Mutacja ta jest embrionalnie letalna w stanie homozygoty. Mutacja ma 100% penetrację, u wszystkich szczurów rozwijają się polipy okrężnicy po 4 miesiącu życia.

Tabela 2 Modele związane z Apc, inne gatunki

Opracowano genetycznie zmieniony model świni niosącej mutację APC 1311, ortologiczną do ludzkiej APC 1309. Zwierzęta te rozwijają aberracyjne ogniska krypt, pojedyncze gruczolaki krypt i liczne gruczolaki jelita grubego, podobne do ludzkiego FAP. Większe gruczolaki wykazują progresję w postaci dysplazji wysokiego stopnia. Charakterystyczne jest zajęcie powierzchni, podobne do ludzkich gruczolaków (Flisikowska i in., 2012).

Modifiers of Cancer Phenotypes

Różnice rasowe od dawna są uznawane za mające znaczący wpływ na obciążenie nowotworowe w modelu ApcMin+/-, który jest zwykle utrzymywany na tle C57Bl/6J. Krzyżowanie myszy B6 Min/+ z AKR i innymi szczepami wsobnymi spowodowało spadek średniej liczby guzów u myszy F1 (Shoemaker et al., 1997). Eksperymenty krzyżowania wstecznego i inne analizy genetyczne mające na celu mapowanie loci modyfikatorów dostarczyły wielu genów kandydujących na modyfikatory Min (Mom) (McCart et al., 2008). Ponadto, dieta i mikrobiom jelitowy kolonii myszy mają istotny wpływ na mnogość, progresję i wielkość polipów. Na przykład wykazano, że dieta o wysokiej zawartości tłuszczu i niskiej zawartości włókien w stylu zachodnim zwiększa liczbę polipów i progresję guza u myszy ApcΔ716/+ (Hioki i in., 1997).

Patologia

Morfologia zmian jelitowych w modelach ApcMin+/ i pokrewnych jest podobna we wszystkich modelach, chociaż wiek wystąpienia, stopień dysplazji i rozmieszczenie w przewodzie pokarmowym różnią się (Tabela 1). Najwcześniejsze rozpoznawalne zmiany składają się z pojedynczej powiększonej krypty lub małego skupiska krypt wyścielonych stłoczonymi komórkami ze zwiększonym stosunkiem jąder do cytoplazmy i hiperchromazją jądrową (ryc. 1). Te wczesne zmiany są zmianami dysplastycznymi niskiego stopnia, podobnymi do gruczolaków cewkowych jelita grubego obserwowanych u pacjentów z FAP. W jelicie cienkim, w strefie proliferacyjnej na styku krypt i kosmków, w blaszce właściwej rozwija się niewielka inwolucja (ryc. 2). Komórki gruczolakowate wciskają się w blaszkę właściwą i w górę do kosmka, tworząc podwójną warstwę nabłonka gruczolakowatego pod prawidłową powierzchnią błony śluzowej (ryc. 3). W okrężnicy wczesne gruczolaki wnikają do blaszki właściwej między kryptami, chociaż można również zidentyfikować pojedyncze gruczolaki kryptowe (Oshima i in., 1997). Immunohistochemia dla beta kateniny może być użyta do pomocy w identyfikacji wczesnych gruczolaków, ponieważ nawet pojedyncze gruczolaki krypt w ApcMin+/- i pokrewnych modelach wykazują akumulację jądrowej beta kateniny (Fig. 4).

Fig. 1
figure1

Mały gruczolak w błonie śluzowej jelita grubego u myszy Apc1638N/+, podobny do ludzkich gruczolaków jelita grubego. Zwróć uwagę na zwiększony stosunek jąder do cytoplazmy i hiperchromatyczne, stłoczone ołówkowate jądra

Fig. 2
figure2

Pojedyncza krypta gruczolakowata w jelicie cienkim myszy ApcMin/+, złożona z poszerzonej, torbielowatej inwazji do wili

Fig. 3
figure3

Adenomy w ApcMin/+ i modelach pokrewnych są często pokryte pojedynczą warstwą normalnego nabłonka nadrzędnego, w przeciwieństwie do ludzkich gruczolaków jelita grubego, gdzie powierzchniowa błona śluzowa jest zwykle zaangażowana przez nabłonek gruczolakowaty

Fig. 4
figure4

Immunohistochemia dla beta kateniny w ApcMin/+ i modelach pokrewnych jest przydatna w identyfikacji małych pojedynczych gruczolaków krypt, które wykazują utratę normalnego błoniastego wzoru i akumulację beta kateniny w jądrze wskutek zmian w sygnalizacji Wnt

As the adenomas grow, they form polypoid, pedunculated or sometimes cup-shaped lesions with a depressed center (Fig. 5a i b). W wielu modelach gruczolaki nie ulegają progresji poza dysplazję niskiego stopnia. Jednakże w modelach o dłuższym czasie życia i mniejszej liczbie guzów, niektóre z nich rozwijają dysplazję wysokiego stopnia charakteryzującą się architekturą cribriform, w której nie wszystkie komórki stykają się z błoną podstawną (ryc. 6). Liczne figury mitotyczne i ciała apoptotyczne są powszechne w gruczolakach na wszystkich etapach rozwoju.

Ryc. 5
figure5

a Gruczolaki jelita cienkiego u myszy ApcMin/+ w miarę wzrostu wciskają się w przestrzenie międzyzwieraczowe. Należy zwrócić uwagę na zachowanie normalnego nabłonka na dużej części gruczolaka. b Gruczolak jelita grubego z szypułką u myszy Apc1638N/+

Fig. 6
figure6

Dysplazja wysokiego stopnia, charakteryzująca się architekturą cribriform, w gruczolaku Apc1638N/+

Nowotwory jelita powstające w modelu ApcMin+/- i modelach pokrewnych zawierają wiele typów komórek, ale składają się głównie z komórek typu absorpcyjnego i komórek zwojowych (Tabela 3). Gruczolaki powstające w jelicie cienkim w modelu ApcMin+/- i modelach pokrewnych zawierają komórki Panetha, które łatwo zidentyfikować w barwieniu hematoksyliną i eozyną (ryc. 7) i uwidocznić za pomocą immunohistochemii dla lizozymu. Wykazano, że stanowią one 10% lub mniej komórek w gruczolakach jelita cienkiego (Moser i in., 1992). Okrężnica myszy nie zawiera komórek Panetha, ale w gruczolakach okrężnicy tych modeli zidentyfikowano komórki wykazujące ekspresję lizozymu bez pozytywnego wyniku PAS, co sugeruje różnicowanie podobne do komórek Panetha nawet w zmianach chorobowych okrężnicy (Moser i in., 1992; Husoy i in., 2006). Komórki neuroendokrynne stanowią niewielki odsetek komórek w gruczolakach typu ApcMin+/-, ale specyficzny typ komórek odzwierciedla komórki neuroendokrynne występujące w prawidłowej błonie śluzowej jelita w miejscu występowania gruczolaka (Moser i in., 1992). Na przykład, komórki wykazujące ekspresję serotoniny są najczęstszymi komórkami neuroendokrynnymi w jelicie myszy i występują w całym jelicie; takie komórki stanowią do 5% komórek gruczolaka ApcMin+/-, w zmianach z jelita cienkiego i okrężnicy (Moser i in., 1992). Komórki PYY-pozytywne, w przeciwieństwie do nich, występują tylko w gruczolakach z dystalnej części okrężnicy, co odzwierciedla normalne rozmieszczenie tych komórek. Komórki neuroendokrynne są rozproszone w gruczolakach i nie tworzą małych skupisk, tak jak komórki lizozymo-pozytywne (Moser i in., 1992).

Tabela 3 Typy komórek w gruczolakach w ApcMin+/- i modelach pokrewnych
Fig. 7
figure7

Wielokrotne typy komórek są obecne w gruczolakach w ApcMin/+ i modelach pokrewnych. Tutaj rozproszone komórki Panetha można zidentyfikować dzięki czerwonym ziarnistościom cytoplazmatycznym, a w gruczolaku obecne są nieliczne komórki gobletowe. Dominującym typem komórek są komórki absorpcyjne

Dysplazja w gruczolakach jelita w modelach mysich powinna być oceniana przy użyciu tej samej terminologii (dysplazja niskiego stopnia, dysplazja wysokiego stopnia, rak śródśluzówkowy) i kryteriów, jak w przypadku gruczolaków jelita grubego u ludzi (Washington i in., 2013). Większość gruczolaków u myszy ApcMin+/- i w modelach pokrewnych wykazuje dysplazję niskiego stopnia, ale wiele z nich staje się stopniowo większych w miarę starzenia się myszy, a kilka z nich przechodzi sekwencję gruczolak-rak. Inwazyjny rak jest rzadki, ponieważ większość myszy umiera z powodu niedokrwistości lub wgłobienia jelit przed progresją. Jednakże, w kilku modelach o dłuższym czasie życia z mniejszą liczbą gruczolaków rozwija się gruczolakorak inwazyjny w błonie podśluzowej (Colnot i in., 2004; Fodde i in., 1994; Robanus-Maandag i in., 2010). Przerzuty nie występują u myszy ApcMin+/- i są niezwykle rzadkie w pokrewnych modelach (Fodde et al., 1994).

Patolodzy chirurgiczni poproszeni o analizę próbek jelitowych powinni być świadomi pułapki w ocenie inwazji guza w modelach mysich. Ponieważ warstwy jelita myszy są cienkie i delikatne, przemieszczenie łagodnego nabłonka do błony podśluzowej jest częstym zjawiskiem (Boivin i in., 2003), szczególnie w przypadku wypadnięcia odbytnicy i w stanach zapalnych (ryc. 8a i b). Podobne przemieszczenie gruczolakowatej błony śluzowej (pseudoinwazja) występuje w szypułkowatych gruczolakach jelita grubego u ludzi oraz w colitis cystica profunda. Konsensusowe wytyczne dotyczące odróżniania przepukliny od inwazyjnego gruczolakoraka zostały opracowane podczas Mouse Models of Intestinal Neoplasia Workshop w Jackson Laboratories w 2000 roku przez panel naukowców i patologów (Boivin i in., 2003) i są podsumowane w Tabeli 4. Pewne rozpoznanie raka inwazyjnego może nie być możliwe, zwłaszcza w modelach zapalnych lub obszarach wypadania, a ocena starszych myszy z lepiej rozwiniętymi zmianami może być konieczna do rozstrzygającego stwierdzenia inwazji.

Fig. 8
figure8

a Wypadanie odbytnicy u myszy może naśladować zmiany gruczolakowate, jak u ludzi. Tutaj należy zwrócić uwagę na pogrubiałą, hiperplastyczną błonę śluzową o reaktywnym wyglądzie, ze zmianami włóknisto-mięśniowymi w lamina propria. b W obszarach wypadania przemieszczenie nienowotworowych krypt może imitować inwazyjnego gruczolakoraka. Tutaj w błonie podśluzowej obecna jest pojedyncza przepuklona krypta. Zwrócić uwagę na zaokrąglony profil krypt i podobieństwo do krypt nadległych

Tabela 4 Cechy pomocne w odróżnieniu gruczolakoraka inwazyjnego od zwyrodnienia błony śluzowej (Boivin i in., 2003)

Inwazja do blaszki właściwej charakteryzuje się rozwojem kanciastych profili krypt z pojedynczymi komórkami naciekającymi i mogą jej towarzyszyć zmiany stromalne, takie jak desmoplazja i zwiększona gęstość komórek zapalnych (ryc. 9a i b). 9a i b).

Fig. 9
figure9

a Inwazyjny rak może być widoczny w dłużej żyjących modelach związanych z ApcMin/+. W przeciwieństwie do gładkiego profilu krypt w przypadku przepukliny, przedstawiony tu gruczolakorak inwazyjny ma profil kanciasty z naciekaniem komórek nowotworowych na zrąb desmoplastyczny. b W tym przykładzie pochodzącym od myszy Apc1638N/+, komórki gruczolakoraka naciekają propria lamina w postaci małych kanciastych gruczołów o spiczastym profilu i wywołują reakcję zapalną i zrębową

.