Auxotrophy
GeneticsEdit
W genetyce, mówi się, że szczep jest auksotroficzny jeśli jest nosicielem mutacji, która sprawia, że nie jest w stanie syntetyzować niezbędnego związku. Na przykład, mutant drożdży z inaktywowanym genem szlaku syntezy uracylu jest auksotrofem uracylu (np. jeżeli gen dekarboksylazy 5′-fosforanu orotydyny jest inaktywowany, powstały szczep jest auksotrofem uracylu). Taki szczep nie jest w stanie syntetyzować uracylu i będzie w stanie rosnąć tylko wtedy, gdy uracyl może być pobrany ze środowiska. Jest to przeciwieństwo prototrofu uracylowego, lub w tym przypadku szczepu typu dzikiego, który może nadal rosnąć przy braku uracylu. Auxotroficzne markery genetyczne są często używane w genetyce molekularnej; były one znane z nagrodzonej Nagrodą Nobla pracy Beadle’a i Tatuma nad hipotezą jeden gen – jeden enzym, łączącą mutacje genów z mutacjami białek. To następnie pozwala na biosyntetyczne lub biochemiczne mapowanie szlaków, które mogą pomóc określić, który enzym lub enzymy są zmutowane i dysfunkcyjne w auxotrophic szczepów bakterii badanych.
Badacze użyli szczepów E. coli auxotrophic dla specyficznych aminokwasów do wprowadzenia nienaturalnych analogów aminokwasów do białek. Na przykład komórki auksotroficzne dla aminokwasu fenyloalaniny mogą być hodowane w pożywkach uzupełnionych o analog taki jak para-azido fenyloalanina.
Wiele istot żywych, w tym ludzie, są auksotroficzne dla dużych klas związków wymaganych do wzrostu i muszą uzyskać te związki poprzez dietę (patrz witamina, niezbędny składnik odżywczy, niezbędny aminokwas, niezbędny kwas tłuszczowy).
Złożony wzór ewolucji auksotrofii witaminowej w całym eukariotycznym drzewie życia jest ściśle związany z współzależnością między organizmami.
Test mutagenności (lub test Amesa)Edycja
Test mutagenezy Salmonelli (test Amesa) wykorzystuje wiele szczepów Salmonella typhimurium, które są auksotroficzne w stosunku do histydyny w celu zbadania, czy dana substancja chemiczna może powodować mutacje poprzez obserwowanie jej właściwości auksotroficznych w odpowiedzi na dodany związek chemiczny. Mutacja, którą powoduje substancja chemiczna lub związek chemiczny jest mierzona poprzez zastosowanie jej do bakterii na płytce zawierającej histydynę, a następnie przeniesienie bakterii na nową płytkę bez wystarczającej ilości histydyny do ciągłego wzrostu. Jeśli substancja nie mutuje genomu bakterii z auksotroficznego do histydyny z powrotem do prototroficznego do histydyny, wtedy bakterie nie wykazują wzrostu na nowej płytce. Tak więc przez porównanie stosunku bakterii na nowej płytce do starej płytki i tego samego stosunku dla grupy kontrolnej, możliwe jest ilościowe określenie jak mutagenna jest dana substancja, lub raczej jak prawdopodobne jest, że spowoduje ona mutacje w DNA. Substancja chemiczna jest uważana za pozytywną dla testu Amesa, jeżeli powoduje mutacje zwiększając obserwowany wskaźnik odwracania oraz negatywną, jeżeli przedstawia się podobnie do grupy kontrolnej. Istnieje normalna, ale niewielka liczba kolonii rewersyjnych, których można się spodziewać, gdy bakteria auksotroficzna jest wyhodowana na podłożu bez metabolitu, którego potrzebuje, ponieważ mogłaby ona zmutować z powrotem do prototrofii. Szanse na to są niskie i dlatego też tworzą się bardzo małe kolonie. Jeżeli jednak zostanie dodana substancja mutagenna, liczba revertantów będzie wyraźnie wyższa niż bez substancji mutagennej. Test Amesa, w zasadzie, jest uważany za pozytywny, jeżeli substancja zwiększa szansę mutacji w DNA bakterii na tyle, aby spowodować wymierną różnicę w revertantach na płytce z mutagenem oraz na płytce z grupą kontrolną. Negatywny test Amesa oznacza, że możliwy mutagen NIE spowodował wzrostu liczby revertantów, a pozytywny test Amesa oznacza, że możliwy mutagen ZNACZĄCO zwiększył szansę mutacji. Te mutagenne skutki na bakteriach są badane jako możliwy wskaźnik tych samych skutków na większych organizmach, takich jak ludzie. Sugeruje się, że jeżeli mutacja może powstać w bakteryjnym DNA w obecności mutagenu to ten sam efekt wystąpiłby dla większych organizmów powodując raka. Negatywny wynik testu Amesa mógłby sugerować, że substancja nie jest mutagenem i nie spowoduje tworzenia się guzów w organizmach żywych. Jednak tylko niektóre z pozytywnych wyników testu Amesa zostały uznane za nieistotne, gdy były testowane na większych organizmach, ale pozytywny wynik testu Amesa dla bakterii nadal nie mógł być jednoznacznie powiązany z ekspresją raka w większych organizmach. Chociaż może to być możliwy wyznacznik nowotworów dla organizmów żywych, ludzi, zwierząt i tak dalej, więcej badań musi zostać zakończonych, aby dojść do wniosku.
Metody oparte na auksotrofii w celu włączenia nienaturalnych aminokwasów do białek i proteomówEdit
Duża liczba nienaturalnych aminokwasów, które są podobne do ich kanonicznych odpowiedników w kształcie, rozmiarze i właściwościach chemicznych, jest wprowadzana do białek rekombinowanych za pomocą auksotroficznych gospodarzy ekspresji. Na przykład, auksotroficzne szczepy metioniny (Met) lub tryptofanu (Trp) Escherichia coli mogą być hodowane w określonym podłożu minimalnym. W tym układzie eksperymentalnym możliwa jest ekspresja rekombinowanych białek, których reszty kanoniczne Trp i Met są całkowicie zastąpione przez różne analogi pokrewne, suplementowane pożywką. Metodologia ta prowadzi do nowej formy inżynierii białek, która nie jest wykonywana poprzez manipulację kodonami na poziomie DNA (np. mutageneza kierowana oligonukleotydami), ale poprzez zmiany kodonów na poziomie translacji białka pod efektywną presją selektywną. Dlatego metoda ta jest określana jako selektywna presja włączania (SPI).
Żaden z badanych dotychczas organizmów nie koduje innych aminokwasów niż kanoniczna dwudziestka; dwa dodatkowe aminokwasy kanoniczne (selenocysteina, pirrolizyna) są wprowadzane do białek poprzez przekodowanie sygnałów zakończenia translacji. Granica ta może zostać przekroczona przez adaptacyjną ewolucję laboratoryjną stabilnych metabolicznie szczepów drobnoustrojów auksotroficznych. Na przykład, w 2015 roku podjęto pierwszą wyraźnie udaną próbę wyewoluowania Escherichia coli, która może przeżyć wyłącznie na nienaturalnym aminokwasie tienopyrrol) alaninie jako jedynym substytucie tryptofanu.
.