Beta-Galactosidase Assay (A better Miller)

.

z powrotem do protokołów

Tło

β-.Galaktozydaza jest kodowana przez gen lacZ operonu lac u E. coli. Jest to duże (120 kDa, 1024 aminokwasy) białko, które tworzy tetramer. Zadaniem enzymu w komórce jest rozszczepienie laktozy do glukozy i galaktozy, aby mogły być wykorzystane jako źródło węgla/energii. Syntetyczny związek o-nitrofenylo-β-D-galaktozyd (ONPG) jest również rozpoznawany jako substrat i rozszczepiany w celu uzyskania galaktozy i o-nitrofenolu, który ma żółty kolor. Kiedy ONPG jest w nadmiarze w stosunku do enzymu w reakcji, produkcja o-nitrofenolu w jednostce czasu jest proporcjonalna do stężenia β-galaktozydazy; tak więc, produkcja żółtego koloru może być użyta do określenia stężenia enzymu.

Więc, dlaczego nas to obchodzi? Zazwyczaj eksperymenty są zaprojektowane tak, że stężenie β-Galaktozydazy w komórce jest odczytem dla jakiegoś aspektu badanego systemu. Na przykład, badacz może podłączyć promotor do genu lacZ i użyć poziomu β-Gal jako odczytu aktywności promotora w różnych warunkach. W 1972 roku Jeffrey Miller opublikował „Experiments in Molecular Genetics”, który zawierał protokół do oznaczania ilości β-Gal za pomocą ONPG. Z tego powodu testy ONPG/β-Gal są określane jako testy „Millera”, a standaryzowana ilość aktywności β-Gal to „jednostka Millera”.

1 jednostka Millera = \displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420} – (1,75*Abs_{550}))}{(t * v * Abs_{600})} }

gdzie:

• Abs420 jest absorbancją żółtego o-nitrofenolu,
• Abs550 jest rozproszeniem od szczątków komórkowych, które po pomnożeniu przez 1.75 przybliża rozproszenie obserwowane przy długości fali 420nm,
• t = czas reakcji w minutach,
• v = objętość badanej hodowli w mililitrach,
• Abs600† odzwierciedla gęstość komórek.

†Należy zauważyć, że wartość ta jest inna dla każdego używanego spektrofotometru i powinna być skalibrowana przez posiew rozcieńczeń znanych hodowli Abs600 w celu określenia jednostek tworzących kolonie na Abs600.

W swojej książce dr. Miller wyjaśnia, że ten wzór daje około 1 jednostki Millera dla nieindukowanej E. coli (niska produkcja β-Gal) i około 1000 jednostek dla w pełni indukowanej kultury (hodowanej na laktozie lub IPTG).

W moim doświadczeniu, kultury MG1655 indukowane 1 mM IPTG w fazie log mają 1500-1800 jednostek Millera. Przyczyna tej różnicy nie jest znana, ale podejrzewam, że wynika ona z różnic w gęstości Abs600/komórkę pomiędzy spektrofotometrem dr Millera i tym, którego używam, a także z faktu, że ja wykonuję moje testy Millera w 30 °C (dla wygody), podczas gdy dr Miller wykonywał swoje testy w 28 °C. Zrobiłem fuzje promotorów, które generują ~40,000 jednostek Millera; jednakże, jak zostanie omówione poniżej, jest to zbyt wysoka wartość dla testu i dlatego protokół został zmieniony, aby obniżyć tę wartość.

Protokół

Protokół, którego używam pochodzi z pracy Zhanga i Bremera (JBC 270, 1995, Free full text!), w którym oryginalny protokół Millera został znacznie uproszczony, aby umożliwić pomiar większej ilości próbek przy mniejszej ilości manipulacji.

W skrócie, protokół składa się z pomiaru gęstości komórek w kulturze bakterii (Abs600), następnie usuwa się porcję komórek z kuwety i miesza się je z roztworem „permeabilizacji”, który zawiera detergent, który przerywa błony komórkowe (ale pozostawia β-Gal nienaruszony). Powoduje to zabicie komórek i zatrzymanie translacji. Po inkubacji, dodaje się roztwór „substratu” ONPG i pozwala się rozwinąć żółtemu kolorowi. Następnie dodawany jest roztwór „stop” i mierzona jest absorbancja o-nitrofenolu.

1. Hoduj kultury w warunkach, które chcesz zbadać.
2. Podczas wzrostu, odmierzaj 80 μL porcje roztworu permeabilizującego do 1.5 mL i zamknąć je.
3. Pomiar Abs600 i ZAPISZ TO!
4. Odmierz 20 μL porcji hodowli i dodaj ją do 80 μL roztworu permeabilizującego.

Próbka jest teraz stabilna przez kilka godzin. Pozwala to na przeprowadzenie eksperymentów czasowych.

1. Po pobraniu ostatniej próbki, przenieść próbki i roztwór Substratu do ciepłego pomieszczenia o temperaturze 30 °C na 20-30 minut.
2. Dodać 600 μL roztworu Substratu do każdej probówki i ZANOTOWAĆ CZAS DOPUSZCZENIA.
3. Po uzyskaniu wystarczającego koloru, dodać 700 μL roztworu Stop, dobrze wymieszać i ZANOTOWAĆ CZAS DOPUSZCZENIA.
4. Po zatrzymaniu ostatniej próbki (niektóre mogą trwać dłużej niż inne, ale generalnie są gotowe w ciągu 30-90 minut), przenieść probówki do mikrowirówki i wirować przez 5-10 minut z pełną prędkością.
5. Ostrożnie wyjąć probówki z wirówki i przenieść roztwór z górnej części probówek do kuwety (kuwet). Należy unikać obecności cząstek stałych w kuwecie, aby rozpraszanie nie miało wpływu na odczyt.
6. Zapisz Abs420. Powinna ona być mniejsza niż 1 i większa niż 0,05. Jeśli jest nieco poza tym zakresem, nie przejmuj się tym.

Obliczyć jednostki Millera jako:

displaystyle{ 1000 * \frac{(Abs_{420})}{((Abs_{600} \tekst{próbki kultury})*(\tekst{objętość} )*(\tekst{czas reakcji}))} }

Komentarze dotyczące oznaczenia

• Reshma 11:28, 15 października 2007 (CDT): Miller zaleca hodowlę z OD600 = 0.28 do 0.70. Twierdzi jednak, że hodowle nocne mogą być również używane, ale że komórki rosnące wykładniczo dają bardziej precyzyjne oznaczenia .

• Kiedy reakcja jest wykonywana? Nigdy nie znalazłem dobrej odpowiedzi na to pytanie w literaturze. Jeśli pozwoliłem reakcji dojść do końca, mierzyłem Abs420 na poziomie ~2-3. Oczywiście, jest to poza wiarygodnym zakresem spektrofotometru, ale daje wskazówkę, jak daleko może zajść reakcja. Uzyskałem powtarzalne dane, gdy żółty kolor był wykrywalny przed dodaniem roztworu zatrzymującego, aż do koloru bulionu LB przed zatrzymaniem. Pamiętaj, że potrzebujesz substratu do nasycenia enzymu w trakcie reakcji, więc nie pozwól im zajść za daleko. Ja rutynowo robię trzy osobne pomiary dla każdej kultury i uśredniam je.
  • Reshma 11:28, 15 paź 2007 (CDT): Miller zaleca, że odczyt OD420nm powinien idealnie wynosić 0,6-0,9 .

• Często ludzie używają jednorazowych plastikowych kuwet do pomiaru zarówno zmętnienia hodowli, jak i żółtego o-nitropenolu. Z mojego doświadczenia wynika, że te jednorazowe kuwety mają HORRIBLE optykę: tak, są przezroczyste, ale droga światła jest żałośnie zniekształcona (wystarczy spojrzeć przez jedną z nich na odległy obiekt). Nie jest to duży problem, jeśli do ślepej próby i próbki używa się tej samej kuwety i jest ona tak samo zorientowana w spektrofotometrze. Problem pojawia się, gdy wiele różnych próbek jest mierzonych w różnych kuwetach. Wartości mogą się bardzo różnić nawet dla tej samej kultury mierzonej w różnych kuwetach. Zalecam stosowanie wysokiej jakości kuwet szklanych lub kwarcowych, albo mierzenie próbek w czytniku płytek z płaskim dnem 96-dołkowych płytek. Stwierdziłem, że mój błąd przy pipetowaniu 150 μL hodowli do pomiarów Abs600 był O WIELE mniejszy niż przy użyciu kuwet jednorazowych. Oczywiście, mierzone zmętnienie powinno być skalibrowane do komórek/mL, tak jak w przypadku kuwety 1cm.

• Odwirowując próbki i ostrożnie usuwając próbkę z supernatantu, unikasz konieczności mierzenia rozproszenia przy 550nm i zgadywania, co byłoby przy 420nm.

• Jeśli twoja reakcja ma za dużo β-Gal, probówka zmieni kolor na żółty w ciągu kilku minut (lub nawet sekund). To jest zbyt szybko. Jednym z największych błędów będzie oszacowanie przez Ciebie czasu reakcji. Jeśli warunki reakcji są tak ustawione, że trwa ona około godziny, błędy czasowe stają się nieistotne. Jeśli trzeba spowolnić reakcję, można użyć mniejszej liczby komórek i zwiększyć ilość buforu permeabilizującego, tak aby objętość nadal wynosiła 100 μL. Alternatywnie, możecie przeprojektować miejsce wiążące rybosom w waszym konstrukcie β-Gal, aby je osłabić. Stwierdziłem, że jeśli moje komórki wytwarzały 40 000 jednostek Millera β-Gal, były bardzo chore z powodu stresu translacyjnego. W tym przypadku lepiej było osłabić translację mRNA β-Gal.
  • Robię te reakcje tak, jak robię kinetykę enzymatyczną. Zaczynam próbki w odstępie 10 sekund (z odliczaniem czasu), więc możliwe jest uzyskanie dokładnych czasów reakcji, nawet jeśli pozwolisz swoim reakcjom trwać tylko kilka minut. Uzyskuję bardzo powtarzalne wyniki przy czasach reakcji 1,5-30 min. Po określeniu czasu trwania reakcji, łatwo jest pogrupować próbki, które będą potrzebowały tego samego czasu reakcji. Wykonanie każdej próbki w trzech egzemplarzach da Ci pewność, że Twój czas jest powtarzalny.–Kathleen 16:43, 14 grudnia 2005 (EST)

• Tutaj jest przykład niektórych rzeczywistych danych, które uzyskałem używając tego testu. Był to eksperyment z cyklem czasowym. W każdym momencie pobierałem 1 mL z każdej z moich hodowli, mierzyłem OD600, pobierałem trzy 20 µL podwielokrotności bezpośrednio z kuwety i dodawałem każdą z nich do 80 µL roztworu permeabilizującego. Badanie przeprowadziłam dokładnie tak, jak opisano powyżej, a wszystkie próbki były przechowywane w temperaturze pokojowej do czasu zakończenia przebiegu czasowego. OD600 dla tych hodowli wahała się od 0.4 do 4 (w mojej hodowli) w trakcie tego eksperymentu, a czasy reakcji dla testów β-Gal wahały się od 2-25 min. Trzy indywidualne oznaczenia β-Gal dla każdego punktu czasowego dla każdej hodowli (czerwone lub czarne symbole) są wykreślone na wykresie, aby zilustrować odtwarzalność oznaczeń w każdym eksperymencie.Kathleen

Przepisy

Roztwór Permeabilizacyjny

Potrzebujesz 80 μL na próbkę.

• 100 mM dibazowego fosforanu sodu (Na2HPO4)
  • (Protokół Zhanga ma 200 mM fosforanu sodu. Nigdy nie mogłem dostać się do roztworu z innymi składnikami, bez względu na to, co próbowałem, więc cofnąłem go do 100 mM. Używałem nawet 50 mM bez wykrywalnych zmian.)
• 20 mM KCl
• 2 mM MgSO4
• 0.8 mg/mL CTAB (bromek heksadecylotrimetyloamoniowy)
• 0.4 mg/mL deoksycholanu sodu
• 5.4 μL/mL beta-merkaptoetanolu

Roztwór substratu

Potrzebujesz 600 μL na próbkę.

• 60 mM Na2HPO4
• 40 mM NaH2PO4
• 1 mg/mL o-nitrofenylo-β-D-Galaktozydu (ONPG)
• 2.7 μL/mL β-merkaptoetanolu

(Protokół Zhanga zawiera również 20 μg/mL CTAB i 10 μg/mL deoksycholanu. Ja je pomijam, sądząc, że jest ich jeszcze dużo z roztworu permeabilizującego i jeśli jeszcze nie są martwe, to już nie będą.)

Roztwór zatrzymujący

Potrzebujesz 700 μL na próbkę.

• 1 M Węglan sodu (Na2CO3)

Wysokie pH roztworu zatrzymującego denaturuje β-Gal i w przybliżeniu podwaja żółty kolor reakcji.

.