Brainbow
Techniki Brainbow opierają się na rekombinacji Cre-Lox, w której białko rekombinaza Cre napędza inwersję lub wycięcie DNA pomiędzy miejscami loxP. Oryginalna metoda Brainbow obejmuje zarówno Brainbow-1 jak i Brainbow-2, które wykorzystują różne formy rekombinacji Cre/lox. Brainbow-3, zmodyfikowana wersja Brainbow-1, została opracowana w 2013 roku. Dla wszystkich podtypów Brainbow ekspresja danego XFP jest zdarzeniem stochastycznym, czyli losowym.
Brainbow-1 wykorzystuje konstrukty DNA z różnymi genami białek fluorescencyjnych (XFP) rozdzielone zmutowanymi i kanonicznymi formami loxP. Tworzy to zestaw wzajemnie wykluczających się możliwości wycięcia, ponieważ rekombinacja indukowana przez cre zachodzi tylko między identycznymi miejscami loxP. Po rekombinacji białko fluorescencyjne, które pozostaje bezpośrednio za promotorem, ulega unikalnej ekspresji. Tak więc, konstrukt z czterema XFP oddzielonymi trzema różnymi miejscami loxP, trzema zdarzeniami wycięcia i oryginalnym konstruktem może produkować cztery różne białka fluorescencyjne.
Brainbow-2 wykorzystuje wycięcie Cre i inwersję, aby umożliwić wiele możliwości ekspresji w danym konstrukcie. W jednym segmencie DNA z dwoma przeciwnie zorientowanymi XFP, Cre wywołuje losowe zdarzenie inwersji, które pozostawia jedno białko fluorescencyjne w odpowiedniej orientacji do ekspresji. Jeśli dwie z tych inwersyjnych sekwencji są wyrównane, możliwe są trzy różne zdarzenia inwersyjne. Gdy uwzględni się również zdarzenia wycięcia, jedno z czterech białek fluorescencyjnych ulegnie ekspresji dla danej kombinacji wycięć i inwersji Cre.
Brainbow-3 zachowuje format loxP Brainbow-1, ale zastępuje geny RFP, YFP i CFP genami mOrange2, EGFP i mKate2. mO2, EGFP i mK2 zostały wybrane zarówno dlatego, że ich fluorescencyjne widma wzbudzenia i emisji minimalnie się pokrywają, jak i dlatego, że mają minimalną homologię sekwencji, co pozwala na zaprojektowanie selektywnych przeciwciał, które mogą być używane do ich wykrywania w protokołach immunohistochemicznych. Brainbow-3 rozwiązuje również problem nierównomiernego wypełniania neuronów XFPs poprzez zastosowanie farnezylowanych pochodnych XFPs, które są bardziej równomiernie transportowane do błon neuronów.
Brainbow jest wdrażany in vivo poprzez krzyżowanie dwóch transgenicznych szczepów organizmów: jednego, który wyraża białko Cre i drugiego, który został transfekowany kilkoma wersjami konstruktu loxP/XFP. Użycie wielu kopii transgenu pozwala na połączenie XFP w sposób, który może dać jeden z około 100 różnych kolorów. Tak więc każdy neuron jest oznakowany innym odcieniem w oparciu o jego daną kombinatoryczną i stochastyczną ekspresję białek fluorescencyjnych.
W celu objaśnienia zróżnicowanych wzorców ekspresji XFP do widocznej postaci, plasterki mózgu są obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej. Przy ekspozycji na foton o określonej długości fali wzbudzenia, każdy fluorofor emituje sygnał, który jest zbierany do kanału czerwonego, zielonego lub niebieskiego, a wynikowa kombinacja światła jest analizowana za pomocą oprogramowania do analizy danych. Nakładanie różnie zabarwionych neuronów pozwala na wizualne rozplątanie skomplikowanych obwodów neuronalnych.
Brainbow był do tej pory testowany głównie na myszach; jednak podstawowa technika opisana powyżej została również zmodyfikowana do użycia w nowszych badaniach od czasu pojawienia się oryginalnej metody wprowadzonej w 2007 roku.
MiceEdit
Mózg myszy ma 75 000 000 neuronów i jest bardziej podobny do ludzkiego mózgu niż drosophila i inne powszechnie używane organizmy do modelowania tej techniki, takie jak C. elegans. Myszy były pierwszymi organizmami, u których z powodzeniem zastosowano metodę neuroobrazowania Brainbow. Livet i wsp. (2007) stworzyli dwie wersje myszy Brainbow, używając Brainbow-1 i Brainbow-2, które zostały opisane powyżej. Przy zastosowaniu tych metod do stworzenia kompletnej mapy i śledzenia aksonów mięśnia myszy, konieczne jest zebranie dziesiątek tysięcy obrazów i skompilowanie ich w stosy, aby stworzyć kompletny schemat. Następnie możliwe jest prześledzenie każdego aksonu motorycznego i jego kontaktów synaptycznych, aby skonstruować kompletny connectome mięśnia.
Więcej przykładów neuronów badanych techniką Brainbow u transgenicznych myszy znajduje się w nerwie ruchowym unerwiającym mięśnie ucha, szlakach aksonalnych w pniu mózgu i zakręcie zębatym hipokampa.
DrosophilaEdit
Złożoność mózgu Drosophili, składającego się z około 100 000 neuronów, czyni go doskonałym kandydatem do wdrożenia technik neurofizjologii i neurobiologii, takich jak Brainbow. Stefanie Hampel i wsp. (2011) połączyli Brainbow w połączeniu z narzędziami genetycznymi w celu identyfikacji poszczególnych neuronów w mózgu Drosophila i różnych linii neuronalnych. Jednym z narzędzi ukierunkowania genetycznego był binarny system ekspresji GAL4/UAS, który kontroluje ekspresję UAS-Brainbow i kieruje ją do małych grup neuronów. Wykorzystanie metody „Flip Out” zwiększyło rozdzielczość komórkową konstrukcji reporterowej. Ekspresja białek fluorescencyjnych, podobnie jak w przypadku oryginalnego Brainbow, zależała od rekombinacji Cre odpowiadającej dopasowanym miejscom lox. Hampel i wsp. (2011) opracowali również własną odmianę Brainbow (dBrainbow), opartą na znakowaniu epitopów przez przeciwciała, a nie na endogennej fluorescencji. Dwie kopie ich konstruktu dają sześć jasnych, rozdzielnych kolorów. To, wraz z uproszczeniami w przypisywaniu kolorów, umożliwiło im obserwację trajektorii każdego neuronu na dużych odległościach. W szczególności, śledzili neurony motoryczne od płata antenowego do połączeń nerwowo-mięśniowych, co pozwoliło im zidentyfikować konkretne cele mięśniowe poszczególnych neuronów.
Wreszcie, technika ta zapewnia możliwość skutecznego mapowania obwodów neuronalnych w Drosophila tak, że badacze są w stanie odkryć więcej informacji na temat struktury mózgu tego bezkręgowca i jak to się odnosi do jego zachowania.
.