Comparative Study of the Effect of Baicalin and Its Natural Analogs on Neurons with Oxygen and Glucose Deprivation Involving Innate Immune Reaction of TLR2/TNF𝛼

Abstract

Praca ta ma na celu zbadanie działania baicaliny i jej trzech analogów, baicalin, wogonoside, and wogonin, on the protective effect of neuron from oxygen-glucose deprivation (OGD) and toll-like receptor 2 (TLR2) expression in OGD damage. Wyniki wykazały, że bajkalina i jej trzy analogi chronią neurony przed uszkodzeniem przez OGD i obniżają poziom białka TLR2. Kwas D-Glucopyranosiduronic na miejscu 7 w strukturze grał rdzeń cytotoksyczności tych analogów flawonoidów. Grupa metoksylowa na węglu 8 struktury miała związek z ekspresją białka TLR2, jak również z działaniem przeciwzapalnym. Ponadto, wykryliśmy kaspazę3 i zdolność antyoksydacyjną, aby zbadać wpływ czterech analogów na apoptozę komórek i całkowitą kompetencję antyoksydacyjną w modelu OGD.

1. Introduction

Scutellariae radix, chińska medycyna, ma różne efekty farmakologiczne, takie jak przeciwbakteryjne, przeciwwirusowe, przeciwzapalne, przeciwutleniające i przeciwwstrząsowe w klinice . Jego aktywnym składnikiem jest rodzaj flawonów, składających się z baicalin, baicalein, wogonin i wogoniside krótko (rysunek 1) . Podaje się, że Scutellariae radix chroni neurony przed urazem niedokrwienia i reperfuzji. Baicalin, główny składnik flawonów, został potwierdzony z neuroprotekcji szkody przez niedokrwienie i reperfuzji i działania na centralnym układzie nerwowym . Ostatnio, baikaleina była badana z obiecującym efektem neuroakcji na wiele miejsc. Jednakże, żaden raport nie przedstawił efektu działania baikaleiny i ekspresji TLR2 na neurony. Kilka badań donosiło, że wogonina i wogonozyd działały na neurony. Baicalin i baicalein były badane jako antyoksydanty; w kilku modelach baicalein był nawet silniejszy niż baicalin w redukcji kilku wolnych rediali. Porównując je, baikaleina i baikalina znacznie złagodziły uszkodzenie komórek wywołane przez nadtlenek wodoru, ale wogonina i wogonozyd działały słabiej. Sugeruje się, że muszą istnieć inne mechanizmy działania wogoniny i wogonozydu na neuroprotekcję.

Rysunek 1

Struktury chemiczne baikaliny i jej naturalnych analogów, baikaliny, wogonozydu i wogoniny.

As the anti-inflammation of baicalin and baicalein was confirmed, the researches on the innate immune response were studied in cerebral ischemia reperfusion and presented the reason partly why the anti-inflammation of baicalin and baicalein was one of the major assays for the protection of brain from the ischemia reperfusion damage . Kilka receptorów zostało wskazanych jako kluczowe cele urazu reperfuzji niedokrwiennej w gliach, takich jak receptory toll like (TLRs) i NODs (nucleotide-binding oligomerisation domain). Nasze wcześniejsze doświadczenia wykazały, że baicalin osłabia ekspresję NOD2 i TNFα w neuronach z niedokrwieniem i uszkodzeniem reperfuzyjnym in vivo i in vitro. Wogonozyd został zgłoszony z hamowaniem angiogenezy indukowanej lipopolisacharydem poprzez transdukcję sygnału receptora toll-podobnego 4 (TLR4). Jednak TLR2 nie został zbadany przez baicalin i jego naturalne analogi.

Na podstawie wcześniej wymienionych informacji, zbadaliśmy zachowanie regulacyjne baicalin i jego analogów przez jeden rodzaj komórki neuronowej PC12 w celu zbadania możliwych celów baicalin i jego analogów we wrodzonych reakcjach immunologicznych podczas deprywacji tlenu i glukozy (OGD) i relacji między strukturą chemiczną i efektem wśród baicalin i jego naturalnych analogów. Ponieważ TLR2 jest jednym z początkowych receptorów we wrodzonej odporności, a aktywacja zapalna, jak również TNFα, może być hamowana przez baicalin w komórkach płuc, ekspresja białka TLR2 i TNFα zostały przetestowane, aby dowiedzieć się, jaka jest rola baicalin i jej analogów w tym modelu uszkodzenia nerwów. Tymczasem kaspaza3 jest dobrze znanym wskaźnikiem apoptozy, a kilka badań doniosło, że kilka flawonów może indukować apoptozę komórek zapalnych, więc wykryliśmy ekspresję białka kaspazy3. Dodatkowo, wpływ czterech analogów na całkowitą zdolność antyoksydacyjną komórek w modelu OGD został również wykryty w tym artykule, który dalej porównywał całą kompetencję tych flawonów .

2. Materiały i Metody

2.1. Chemikalia i materiały

Baicalin (czystość była 98%) został przedstawiony przez Dr. Lujun Zhang, Laboratory of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University. Wogonozyd (czystość wynosiła 98%) został przedstawiony przez Dr. Xiuwei Yang, School of Pharmaceutical Science, Peking University. Baicaleina i wogonozyna, wszystkie o czystości 98% (numer partii 111595-200604 i 111514-200403), zostały zakupione z China National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products. W całym eksperymencie używano dejonizowanej wody. Pozostałe rozpuszczalniki organiczne i odczynniki były klasy analityczno-odczynnikowej. Bufor PBS o pH7,4 został przygotowany w naszym laboratorium. Komórki PC12 zostały dostarczone przez Bank Komórek Instytutu Medycyny Fundamentalnej, Chińskiej Akademii Nauk Medycznych (Pekin, Chiny). Płodowa surowica bydlęca (FBS) i pożywka RPMI 1640 zostały zakupione od firmy GIBCO. Przeciwciała anty-TLR2/TNFα/caspase3/β-aktyna zostały zakupione od Santa Cruz Company (USA). Przeciwciała drugorzędowe zakupiono od Zhongshan Company (Pekin, Chiny). Zestaw do wykrywania całkowitej zdolności antyoksydacyjnej (T-AOC) został zakupiony od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Chiny).

2.2. Hodowla komórek

KomórkiPC12 dostosowano do około 1 × 106 komórek/mL z 2 mL inokulatu do każdego dołka płytek 6-dołkowych (Costar) w RPMI 1640 uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 5% surowicą końską oraz penicyliną/streptomycyną (100 U/mL każda). Komórki hodowano w nawilżanym inkubatorze (5% CO2) (Sanyo, Japonia) w temperaturze 37°C i pozwalano im przylegać przez co najmniej 48 h.

2.3. Cytotoxicity Assays In Vitro

Bezpieczne dawki baicalin i jego trzech analogów do komórek oceniano za pomocą MTT (methylthiazol tetrazolium) assay in vitro. Po 24 h inkubacji komórek w płytkach 96-dołkowych dodawano baicalinę i jej analogi w dawkach od 10 mg/mL do 0,001 mg/mL. Po 24 h od dodania związków, podłoże hodowlane w płytkach 96-dołkowych inkubowano z MTT (5 mg/mL, 200 μL na studzienkę) w temperaturze 37°C przez 4 h. Następnie ostrożnie aspirowano podłoże i dodawano 200 μL dimetylosulfotlenku (DMSO) na studzienkę w celu rozpuszczenia niebieskich produktów formazanu. Wartości absorbancji przy 490 nm zostały zmierzone przy użyciu czytnika mikropłytek (Model 550，Bio-Rad，USA). Wyniki absorbancji dołków testowych wyrażono jako żywe komórki. Obliczono 50% stężenie cytotoksyczności (CC50) .

2.4. Komórki do deprywacji tlenowo-glukozowej

Do deprywacji tlenowo-glukozowej (OGD) , zastąpiliśmy podłoże wzrostowe podłożem hodowlanym bez glukozy (2 mL na studzienkę) i umieściliśmy płytki w inkubatorze (YCP-30Q, Changsha, Chiny) wypełnionym 95% N2/5% CO2 w 37°C na 120 min. Następnie komórki zostały zwrócone do normalnego medium zasilającego i inkubowane w normalnych warunkach w temperaturze 37°C (Sanyo, Japonia) przez określony czas dla późniejszych eksperymentów. Kontrolne hodowle komórkowe niepozbawione tlenu i glukozy inkubowano w normalnych warunkach w medium z glukozą.

Dla efektu ochronnego związków przed uszkodzeniem OGD, test żywych komórek przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem. Po 24 h inkubacji komórek w płytkach 96-dołkowych dodawano baicalin i jego analogi w dawkach od 10 mg/mL do 0,001 mg/mL. Po 24 h od dodania związków podłoże hodowlane w płytkach 96-dołkowych inkubowano z MTT (5 mg/mL, 200 μL na studzienkę) w temperaturze 37°C przez 4 h. Podłoże dokładnie odsysano, a następnie dodawano 200 μL DMSO na studzienkę w celu rozpuszczenia niebieskich produktów formazanu. Wartości absorbancji przy długości fali 490 nm mierzono za pomocą czytnika mikropłytek. Wyniki absorbancji dołków testowych wyrażono jako liczbę żywych komórek. Obliczono 50% stężenie skuteczne (EC50). W połączeniu z cytotoksycznością (CC50) związków, wskaźniki bezpieczeństwa (SI) zostały obliczone przez EC50/CC50 .

Dla badania TLR2/TNFα i kaspazy3, minimalne stężenie bezpieczeństwa baicalin i jego analogów zostało zamówione jako 10 μg/mL. Związki te (10 μg/mL) dodawano, gdy podłoże hodowlane wymieniano na roztwór glukozy, a komórki hodowano w normalnych warunkach. Komórki pobierano do eksperymentu białkowego w określonym czasie reperfuzji (0,5, 1, 3, 6 h) po dodaniu baicaliny i jej analogów. W kontroli, medium był używany jako nośnik i komórki zostały pobrane w czasie reperfuzji 6 h.

2.5. Przygotowanie próbek

Dwie grupy bez leków były zatrudnione jako kontrola. Jedna grupa komórek została posiana w pożywce z normalnego wzrostu podczas całego procesu eksperymentalnego bez tlenu-glukozy deprywacji. Druga grupa została posiana w pożywce z procesem pozbawienia tlenu-glukozy jako kontrola modelu. W każdym punkcie czasowym, próbka komórek była przygotowywana tak samo jak w poprzednim opisie. Pożywkę wyciągnięto z każdej studzienki, a komórki przepłukano trzykrotnie zimnym PBS (pH 7,4) i użyto 100 μL RIPA do zebrania całkowitego białka do Western blotting.

2.6. Western Blot

Western blot assay for protein expression of β-actin, TLR2, TNFα, and Caspase3 was referenced in with minimodification as follows: loaded samples into the gel (10%), was run until the marker (purchased from Fermentas Republic of Lithuania) and went to the end of the gel. Transfer powinien być półsuchy przez 60 min przy napięciu 12 V i natężeniu prądu 280 mA. Następnie membranę blokowano 10% mlekiem w PBST (1 × PBS + 0,1% Tween20) przez 60 min wstrząsając powoli w temperaturze pokojowej. Membranę umieszczano w 1 mL PBST z przeciwciałem w rozcieńczeniu 1 : 1000, inkubowano przez 60 min w temperaturze pokojowej na wytrząsarce, a po inkubacji przeciwciała pierwotnego płukano 3-krotnie przy użyciu PBST. Następnie membranę inkubowano przez 60 min w PBST z przeciwciałem drugorzędowym o stężeniu 1 : 3000. Membranę płukano 3-krotnie przy użyciu PBST na końcu.

2.7. Wykrywanie całkowitej zdolności antyoksydacyjnej

Zasadą tego doświadczenia było wykrywanie zmiany koloru po redukcji Fe3+ do Fe2+ przez składniki redukujące w próbkach. Składniki redukujące mogą obejmować cząsteczki enzymatyczne i nieenzymatyczne, takie jak rozpuszczalna w lipidach przeciwutleniająca witamina E i rozpuszczalne w wodzie przeciwutleniacze witamina C, bilirubina i kwas moczowy. Następnie mierzono gęstość optyczną przy długości fali 520 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Próbkę komórek przygotowywano tak samo jak w poprzednim opisie i pobierano w określonym czasie reperfuzji (6 h) po dodaniu baicaliny i jej analogów. Z każdej studzienki odciągnięto medium, a komórki przepłukano trzykrotnie zimnym PBS (pH 7,4). Komórki na płytce rozpuszczano za pomocą PBS (1 mL/basenik) poprzez wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie. Supernatant zbierano do badania T-AOC po odwirowaniu 12 000 rpm/min.

2.8. Analiza danych

Wszystkie wartości wyrażono jako średnie ± S.D. Dane poddano analizie statystycznej metodą ANOVA. Porównania Newmana-Keulsa zostały użyte do określenia źródła istotnych różnic, gdy było to właściwe. Wartości P poniżej 0,05 uznawano za istotne statystycznie. Oprogramowanie CALC 2.0 (The China Association of Pharmacology) zostało zastosowane do obliczenia CC50 i EC50.

3. Wyniki

3.1. Profil wzrostu komórek

Komórki były wysiewane na płytkach z pożywką z 10% FBS przez 48 h. Nie byłyby używane do eksperymentów dopóki nie urosłyby dobrze i nie przyczepiłyby się do siebie ciasno w płaskich płytkach wielokomorowych.

3.2. MTT Tests of Cytotoxicity

W celu zbadania cytotoksyczności i określenia bezpiecznych dawek baicalin i jej analogów, przeprowadzono test MTT na komórkach PC12 in vitro. W oparciu o doświadczenia, 10 μg/mL bajkaliny i wogonozydu było najwyższym bezpiecznym stężeniem na normalnych komórkach PC12, a 1 μg/mL bajkaliny i wogonozydu było najwyższym bezpiecznym stężeniem na normalnych komórkach PC12 (rysunek 2).

(a)

(b)

.
(a)
(b)

Rysunek 2

Cytotoksyczność bajkaliny, wogonozydu, baikaleiny i wogoniny w normalnych komórkach PC12 (test MTT). Po 24 h inkubacji komórek w płytkach 96-dołkowych, dodano substancje chemiczne w dawce od 10 mg/mL do 0,001 mg/mL. *𝑃<0,05 versus normalna kontrola. Dane przedstawiono jako średnie ± S.D. z siedmiu niezależnych eksperymentów.

W komórkach PC12 traktowanych deprywacją tlenowo-glukozową, tylko mniej niż 40% komórek przeżyło w porównaniu z normalną kontrolą (𝑃<0,05). W porównaniu z kontrolą modelową, minimalne skuteczne stężenie (MEC) baicaliny i wogoniny wynosiło 10 μg/mL, podczas gdy MEC zarówno wogonozydu, jak i baicaleiny było takie samo i wynosiło 1 μg/mL. Maksymalne skuteczne stężenie (MAXEC) bajkaliny i woroniny było takie samo i wynosiło 1 mg/mL, co sugeruje takie samo bezpieczeństwo ich stosowania. MAXEC wogonozydu wynosiło 1 mg/mL, ale MAXEC baikaleiny było tylko na poziomie 10 μg/mL. Sugerowano, że baikaleina jest bardziej cytotoksyczna niż wogonozyd. Wszystkie te związki nie zostały wykazane w sposób zależny od stężenia wyraźnie (rysunek 3).

(a)

(b)

(c)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

KC50 baikaliny (188,4 μg/mL lub 0,422 mmol/L) wykazało duże różnice w stosunku do pozostałych trzech związków. Baikaleina wykazała większą toksyczność komórkową z CC50 8.9 μg/mL (równe 0.0329 mmol/L). Wogonina i wogonozyd wykazywały toksyczność podobną do CC50 odpowiednio 10,6 μg/mL (równe 0,0373 mmol/L) i 13,7 μg/mL (równe 0,0298 mmol/L). Jednakże baicaleina była bardziej efektywna w ochronie komórek przed uszkodzeniem przez OGD. Minimalna skuteczna dawka baikaleiny wynosiła 1 μg/mL (co odpowiada 0,0037 mmol/L). EC50 bajkaliny wynosiło 1,2 μg/mL (równe 0,0027 mmol/L), a EC50 wogoniny i wogonozydu wynosiło 4.3 μg/mL (co odpowiada 0,0151 mmol/L) i 7,4 μg/mL (co odpowiada 0,0161 mmol/L). Porównując pomiędzy toksycznością a efektem, wskaźniki bezpieczeństwa czterech związków wynosiły odpowiednio 156 (bajkalina), 8,89 (bajkaleina), 2,47 (wogonina) i 1,85 (wogonozyd) (Tabela 1).

. Związki CC50 EC50 SI μg/mL (mmol/L) μg/mL (mmol/L) Baicalin 188.4 (0,422) 1,2 (0,0027) 156 Wogonozyd 13,7 (0,0298) 7,4 (0.0161) 1,85 Baikaleina 8,9 (0,0329) 1,0 (0,0037) 8,89 Wogonina 10.6 (0,0373) 4,3 (0,0151) 2,47

CC50 oznacza 50% stężenie cytotoksyczne. EC50 oznacza 50% stężenie skuteczne. SI (wskaźnik bezpieczeństwa) obliczono przez CC50/EC50.

Tabela 1

Wartości CC50 i EC50 baikaliny, baikaleiny, wogonozydu i wogoniny.

3.3. Effect on the Expressions of TLR2, TNFα, and Caspase3

Po zranieniu przez OGD, białka TLR2 i TNFα w komórkach uległy wyraźnej ekspresji, co oznacza, że OGD stymulował wrodzoną reakcję immunologiczną, powodując stan zapalny. Białko kaspazy3 w modelu OGD było w pewnym stopniu wyregulowane, ale nie było znaczącej wartości statystycznej (rysunek 4). Baicalin zmniejszył ekspresję białka TLR2 i TNFα 3 godziny po podaniu. Gdy bajkalina działała przez 0,5 h, ekspresja TLR2 wykazała istotność statystyczną bez znaczenia w porównaniu z normą lub porównując z modelem (𝑃<0,05), a ekspresja TLR2 z 1 h wzrosła (porównując z normą, 𝑃<0,05); jednak jej ekspresja z 3 h lub 6 h nie wykazała oczywistej różnicy w porównaniu z normą (porównując z modelem, 𝑃<0,05). Ekspresja TNFα z 0,5 h była nadal wyższa niż kontrola (𝑃<0,05), a jej ekspresja z 1 h, 3 h i 6 h została zmniejszona oczywiście, co wykazało znaczącą różnicę od poziomu modelu (𝑃<0,05). Bajkalina nie miała najwyraźniej wpływu na ekspresję białka kaspazy3, co pokazano na rycinie 4(a).

(a)

(b)

(c)

(d)

.
(a)
(b)
(c)
(d)

Rycina 4

Wpływ czterech analogów na ekspresję białek TLR2, TNFα, i kaspazy3 w komórkach PC12 z deprywacją tlenowo-glukozową (OGD). Poziom białka był mierzony metodą Western blot. Model oznacza leczenie deprywacją tlenowo-glukozową. 0.5, 1, 3, i 6 h oznaczają czas procesu reperfuzji po OGD. (a) oznacza efekt baikaliny; (b) oznacza efekt wogonozydu; (c) oznacza efekt baikaleiny; (d) oznacza efekt wogoniny. Bajkalinę, wogonozyd i wogoninę stosowano w stężeniu 10 μg/mL, a bajkaleinę stosowano w stężeniu 1 μg/mL. *𝑃<0,05 versus normalna kontrola. #𝑃<0,05 versus grupa modelowa. Dane przedstawiono jako średnie ± SD z trzech niezależnych eksperymentów.

Po dodaniu wogonozydu (10 μg/mL), TLR2 i TNFα zostały najwyraźniej wyregulowane. Ekspresja TLR2 była znacznie niższa niż w modelu, nawet niż normalny poziom (𝑃<0,05). Odpowiednio, ekspresja TNFα była hamowana przez wogonozyd najwyraźniej od 0,5 h po podaniu do punktu czasowego 6 h (𝑃<0,05). Wogonozyd nie wykazał również oczywistego wpływu na ekspresję kaspazy3 (Figura 4(b)).

Po podaniu baikaleiny, TLR2 był nadal znacznie podwyższony 0,5 h i 1 h po dodaniu baikaleiny (𝑃<0,05), i zmniejszył się do normalnego w 3 h i 6 h. W porównaniu z modelem, TNFα był podwyższony w 0,5 h i stopniowo zmniejszał się później. Podobnie jak TLR2, jego ekspresja spadła do normy po 3 h i 6 h (Figura 4(c)).

W grupie wogoniny, te dwa czynniki najwyraźniej zmalały. TLR2 zmniejszył się do normy po 0,5 h od dodania wogoniny (porównując z modelem, 𝑃<0,05), i pozostał na niższym poziomie podczas przebiegu eksperymentu. W punktach czasowych 0,5 h i 1 h ekspresja TNFα była większa niż normalna (𝑃<0,05), ale mniejsza niż w modelu (𝑃<0,05), a w 3 h i 6 h zbliżyła się do normalnego poziomu, podobnie jak ekspresja TLR2 (Figura 4(d)).

Podobnie do grup baikaleiny i wogonozydu, ekspresja kaspazy3 nie wykazywała znaczących zmian w grupach baikaleiny i wogonozyny (Figura 4(c) i 4(d)).

3.4. Assay of Total Antioxidation Competence (T-AOC)

Wykorzystując zestaw T-AOC, stwierdziliśmy, że kompetencja antyoksydacyjna normalnych komórek wynosiła około 2,5 U/mg, a jedna z komórek poddanych działaniu deprywacji tlenowo-glukozowej była znacznie poniżej 0,5 U/mg. W grupie baicalin, wartość wykrywania wynosiła 1.8 U/mL, pokazując znaczącą różnicę bez względu na to, czy porównywano z normalnymi czy z modelem OGD. W grupach wogonozydu, baikaleiny i wogoniny, wartości wynosiły odpowiednio 1,6, 0,8 i 0,6 U/mg, które wszystkie wykazały znaczącą różnicę w porównaniu z normą lub modelem (Figura 5).

Rysunek 5

Wpływ bajkaliny i jej trzech analogów na całkowitą kompetencję antyoksydacyjną komórek PC12 poddanych działaniu deprywacji tlenowo-glukozowej. Model oznacza leczenie z deprywacją tlenowo-glukozową. Bajkalina, wogonozyd i wogonina były używane w stężeniu 10 μg/mL, bajkaleina była używana w stężeniu 1 μg/mL. **𝑃<0,01 versus normalna kontrola. ##𝑃<0,01 versus grupa modelowa. $$𝑃<0,01 versus grupy baicaliny i wogonozydu. Dane przedstawiono jako średnie ± S.D. z ośmiu niezależnych eksperymentów.

4. Omówienie

Baikalina jest związkiem glikozylowanym pochodzącym od baikaleiny i posiada grupę funkcyjną kwasu D-glukopiranozyduronowego na miejscu 7 baikaleiny (rysunek 1), dzięki czemu będzie wykazywać więcej funkcji biologicznych. Podstawowa struktura bajkaliny składa się z benzopiranu z trzema grupami hydroksylowymi w miejscach 5, 6 i 7 oraz grupą fenylową po drugiej stronie benzopiranu (miejsce 2). Bajkalina posiada również strukturę enolową na pierścieniu benzopiranu w celu utrzymania koniugacji. Dwie różnice między bajkaliną a wogoniną dotyczą grupy metoksylowej na węglu 8 wogoniny i grupy hydroksylowej na węglu 6 bajkaliny. Obecność trzech grup hydroksylowych w bajkalinie może odpowiadać za jej bardziej hydrofilowe właściwości. Ponadto, wogonozyd jest glikozylowaną formą wogoniny z kwasem D-glukopiranozyduronowym na węglu 7. Wszystkie cztery związki mają podobny szkielet węglowy o strukturze benzopiranu, a także grupę hydroksylową na węglu 5; baikaleina i baikalina mają grupy hydroksylowe na węglu 6, podczas gdy wogonina i wogonozyd nie mają; baikaleina i wogonina mają grupy hydroksylowe na węglu 7, podczas gdy wogonozyd i baikalizyna są glikozylowane na grupie hydroksylowej w miejscu 7; wreszcie, wogonina i wogonozyd mają grupy metoksylowe na węglu 8, ale baikaleina i baikalizyna nie mają grup funkcyjnych.

Przez wynik cytotoksyczności i neuroprotekcji, kwas D-glukopiranozyduronowy na miejscu 7 był ważny dla zmniejszenia cytotoksyczności, w którym baicalin był mniej cytotoksyczny niż baicalein i wogonozyd był mniej cytotoksyczny niż wogonin. Grupa metoksylowa na węglu 8 i grupa hydroksylowa na węglu 6 były głównym czynnikiem wpływającym na efekt neuroprotekcyjny, przez co EC50 bajkaliny i bajkaleiny było mniejsze niż wogonozydu i wogoniny (Figura 1 i Tabela 1) po ich podaniu.

W tym badaniu stwierdziliśmy, że TLR2 ulegał wysokiej ekspresji podczas uszkodzenia w wyniku deprywacji tlenu i glukozy (OGD) w komórkach PC12, co sugerowało, że receptor był aktywowany w uszkodzonych neuronach (Figura 4). TLR2 został zidentyfikowany jako kluczowy mediator odpowiedzi immunologicznych i reakcji zapalnych, i pośredniczył w odpowiedzi prozapalnej poprzez aktywację TNFα . Receptor był znacząco podwyższony w porównaniu z normalnym poziomem, wskazując, że dołączył do uszkodzenia neuronu wywołanego przez OGD.

Przez literaturę badań, TLR2 w centralnym układzie nerwowym (CNS) jest realizowany jako bezpośrednie źródło sygnału uszkadzającego i ważny potencjalny cel terapeutyczny. W naszych wynikach, ekspresje TLR2 i TNFα zmniejszyły się najwyraźniej kilka godzin po dodaniu związków. W tym samym profilu, ekspresja TLR2 i TNFα z wogoniną i wogonozydem była bardziej zahamowana niż z bajkaliną i bajkaleiną. Hamowanie ekspresji rozpoczęło się od 0,5 h po podaniu wogoniny i wogonozydu, natomiast hamowanie ekspresji TLR2 i TNFα pojawiło się później, bo po 3 h od podania bajkaliny i bajkaleiny. W związku z tym uznano, że wogonina i wogonozyd wykazują preferencje w stosunku do TLR2. W połączeniu z ich strukturami chemicznymi, wszystkie wyniki sugerowały, że grupa metoksylowa na węglu 8 w strukturze jest hipotezą farmakoforową efektu hamowania TLR2, odnoszącą się do hamowania stanu zapalnego.

Warunkując nadmierną supresję na TLR2 i TNFα przez te analogi, wykryliśmy kaspazę3, aby potwierdzić, czy istniała apoptoza z dodatkiem analogów. Porównując z normalnym, ekspresja białka kaspazy3 w modelu OGD rzeczywiście wzrosła w pewnym stopniu, ale nie wykazała różnicy statystycznej. Przy podawaniu czterech analogów, poziom białka kaspazy3 nie wykazywał oczywistej zmiany, chociaż wykazywał tendencję do zmniejszania się w punkcie czasowym 6 h i zbliżał się do normalnej kontroli (porównując z normalnym lub modelem, 𝑃>0,05). Powyższe wyniki sugerowały, że uszkodzone komórki PC12 w modelu OGD nie miały widocznej apoptozy, a cztery analogi również nie mogły indukować apoptozy w uszkodzonych komórkach PC12. Zgodnie z literaturą, baikalina osłabiła globalne uszkodzenie mózgu w wyniku reperfuzji niedokrwienia u gerbili poprzez szlaki antyoksydacyjne i antyapoptotyczne, a baikaleina i wogonina mogły zarówno indukować apoptozę w ludzkich komórkach raka trzustki, jak i komórkach białaczki HL-60. Dlatego nasze wyniki apoptozy przez te związki wymagają dalszych badań.

Odnosząc się do wykrywania T-AOC, stwierdziliśmy, że sekwencja całkowitej zdolności antyoksydacyjnej była baicalin i wogonoside > baicalein i wogonin, wskazując, że glikozylowana forma na miejscu 2 baicalin i wogonoside odegrała kluczową rolę w ogólnej antyoksydacji.

Authors’ Contribution

The first two authors contributed equally.

Acknowledgments

The author thank all members in their laboratory. Badania były częściowo wspierane przez National Natural Science Foundation of China (30801523, 81073092), National S&T Major Special Project for New Drug R&D of China (2012ZX09103-201-041, 2012ZX09102-201-008, and 2011ZX09101-002-11), and Special Foundation for Laboratory of Tsinghua University (LF 20103579).