Current applications of antibody microarrays

Dzięki unikalnym możliwościom mikromacierzy przeciwciał i możliwości ich zastosowania w wielu projektach biomedycznych, opracowano szereg różnych mikromacierzy przeciwciał, z których niektóre stały się dostępne komercyjnie. W tym miejscu zebraliśmy niektóre z reprezentatywnych badań z ostatnich 7 lat (Tabela 1) i podzieliliśmy nasz przegląd na dwie części w zależności od ukierunkowania projektów: badania oparte na biologii podstawowej i badania kliniczne. Ponieważ praktycznie niemożliwe jest omówienie wszystkich najnowszych zastosowań mikromacierzy przeciwciał, skupiliśmy się na tych zastosowaniach, które uznaliśmy za cieszące się dużym zainteresowaniem i mające istotne znaczenie kliniczne.

Badania podstawowe

Związane ze ścieżkami sygnalizacyjnymi

Zmiany w ścieżkach sygnalizacyjnych są cechą charakterystyczną wielu stanów chorobowych, w tym nowotworów, cukrzycy i zaburzeń neurodegeneracyjnych. Tworzenie tablic przeciwciał przy użyciu odczynników wychwytujących, ukierunkowanych na białka w interesującej nas kaskadzie sygnalizacyjnej, umożliwiło badaczom badanie zmian w profilach białek i modyfikacji w szlakach sygnalizacyjnych w normalnych procesach biologicznych i stanach chorobowych. Naukowcy zastosowali tę koncepcję do szeregu materiałów i preparatów próbek biologicznych, w tym lizatów komórkowych, ekstraktów tkankowych i osocza .

Calbindin-D28 k (CB), ważne białko wiążące wapń, które działa jako bufor wapniowy i stwierdzono, że jest wyrażane na niższych poziomach w mózgach myszy i ludzi z chorobą Alzheimera, ale nie wiadomo, czy te zmiany przyczyniają się do dysfunkcji związanej z chorobą Alzheimera (AD). Kook i wsp. stworzyli mysz transgeniczną z niedoborem CB w chorobie Alzheimera (CBKOTg), aby zbadać udział CB w szlakach sygnałowych w AD. Wykorzystując mikromacierze przeciwciał do badania tkanki mózgowej myszy, zidentyfikowali znaczące zmiany w szlakach śmierci komórkowej, transmisji synaptycznej i szlakach sygnalizacji MAPK po delecji CB. Wyniki te zostały zweryfikowane przez immunohistochemię, która wykazała zwiększoną ilość markerów apoptotycznych i zwiększoną śmierć neuronów, pokazując, że mikromacierze przeciwciał mogą dostarczyć nowych informacji, zwiększając nasze zrozumienie roli CB i jej implikacji w patofizjologii AD.

Mikromacierze przeciwciał zostały wykorzystane do odkrycia fizjologicznej roli w wysoce konserwatywnych białkach, w tym czynnika elongacji 4. Gao i wsp. zbadali mechanizm działania czynnika kontroli jakości mitochondrialnego czynnika elongacji 4 (mtEF4) w translacji przy użyciu mikromacierzy przeciwciał phospho-explorer. Porównując lizaty komórkowe pomiędzy tkankami jąder myszy mtEF4 knock-out i WT, odkryli, że wzbogacenie fałdowe mTOR było najwyższe wśród różnych szlaków sygnalizacyjnych. Autorzy wykazali, że w przypadku delecji mtEF4, głównym sygnałem zwrotnym z cytoplazmy somatycznej jest upregulacja mTOR. Towarzyszyło temu zwiększenie translacji cytoplazmatycznej, co wskazuje, że mTOR odgrywa kluczową rolę jako efektor downstream kompensujący niedobór translacji mitochondrialnej. Co więcej, badanie to powiązało wcześniej nieopisany cross-talk pomiędzy zależną od mtEF4 kontrolą jakości w mitochondriach i ścieżką mTOR w cytoplazmie.

Mechanizm działania leków

Z pomocą testów mikromacierzy przeciwciał badacze mogą badać mechanizmy działania leków w sposób systematyczny i efektywny. Wśród wielu możliwych zastosowań, badano angiogenezę indukowaną przez nowotwory, ponieważ odgrywa ona kluczową rolę w progresji nowotworu. P11, nowy ligand peptydowy zawierający motyw wiążący PDZ (Ser-Asp-Val) o wysokim powinowactwie do integryny αvβ3, został zidentyfikowany z biblioteki heksapeptydowej (PS-SPCL) przy użyciu mikromacierzy przeciwciał. Mechanizm farmakologiczny P11 został wyjaśniony przy użyciu specjalnie zaprojektowanej farmakoproteomicznej mikromacierzy zawierającej 48 przeciwciał związanych z nowotworami. Badanie wykazało, że P11 hamuje proliferację komórek śródbłonka ludzkiej żyły pępowinowej indukowaną bFGF poprzez inhibicję kinazy białkowej aktywowanej mitogenem i kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym. Ponadto, mikromacierze ujawniły, że P11 powodował podwyższenie poziomu markera apoptozy p53, powodował indukcję apoptozy poprzez aktywację systemu kaspaz, co wskazuje, że P11 może odgrywać kluczową rolę w zapobieganiu progresji nowotworu. Związek między P11 i p53 przedstawiają kliniczni i podstawowi badacze nowotworów, którzy pomogą wyjaśnić dalsze wskazówki dotyczące roli P11 i jego hamującego celu.

Lovastatin, naturalny produkt pochodzący z Aspergillus terreus lub Monascus ruber, był szeroko stosowany jako lek obniżający poziom cholesterolu w klinice. Yang i wsp. wykorzystali mikromacierz przeciwciał zawierającą 656 przeciwciał, skupiając się na różnych funkcjonalnych szlakach komórkowych, co sugeruje, że lovastatyna ma również właściwości przeciwnowotworowe, poprzez słabo zdefiniowane mechanizmy. Istnieje silna potrzeba znalezienia skutecznych metod leczenia nowotworów i zrozumienia mechanizmów ich działania. Używając mikromacierzy, komórki raka piersi były badane w warunkach niedotlenienia w celu zbadania mechanizmów molekularnych, poprzez które Lovastin wywiera swój efekt. Wykazano 17 białek o podwyższonej i 20 o obniżonej regulacji w komórkach raka piersi poddanych działaniu lubwastatyny, w porównaniu z komórkami kontrolnymi, a wyniki te zostały następnie potwierdzone metodą real-time PCR. Sygnatura białkowa obejmowała białka zaangażowane w apoptozę, proliferację komórek i przerzuty nowotworów, łącząc modulację tych szlaków z farmakologicznym działaniem lubwastatyny.

Lek przeciwcukrzycowy typu 2 metformina, również zaproponował, aby mieć właściwości przeciwnowotworowe. Lee i wsp. badali siłę działania nowych pochodnych metforminy przy użyciu mikromacierzy przeciwciał zbudowanych w celu badania cząsteczek związanych z cyklem komórkowym. Autorzy wykazali, że maślan metforminy (MFB) ma lepszą skuteczność przeciwnowotworową niż metformina-HCl, dzięki większej aktywności przeciwnowotworowej i lepszej skuteczności w hamowaniu progresji cyklu komórkowego w fazach S i G2/M, a ponadto wydaje się mieć preferencyjne działanie cytotoksyczne na populacje komórek macierzystych raka piersi. Wyniki te podkreślają, jak tablice przeciwciał mogą dostarczyć proteomicznych dowodów wspierających rozwój leków o lepszej skuteczności.

Dla podstawowych badań biologicznych, mikromacierze przeciwciał mogą służyć do wykrywania białek sygnalizacyjnych i białek związanych z określonym fenotypem. Tablice z równoległym wykrywaniem białek stwarzają możliwość badania wielu szlaków sygnalizacyjnych w jednym eksperymencie, zapewniając wgląd w nowe mechanizmy, takie jak badanie progresji choroby, interakcji leków i odpowiedzi na infekcje.

Badania kliniczne

Analiza próbek klinicznych na poziomie białek umożliwi poprawę markerów diagnostycznych i ukierunkowanie opcji leczenia. Ponieważ białka są zaangażowane w większość procesów komórkowych, analiza białek może zapewnić biologiczną sygnaturę choroby, generując szczegółowy wgląd w aktualny stan komórki, organu lub systemu. Mikromacierze przeciwciał mogą dostarczyć informacji w czasie rzeczywistym o bieżących zmianach w procesach biologicznych w czasie zdrowia i choroby. W tej sekcji przedstawimy przykłady zastosowania mikromacierzy przeciwciał do badania kohort klinicznych, głównie analizując próbki surowicy i osocza. Nie jest możliwe omówienie wszystkich aspektów wykorzystania mikromacierzy przeciwciał w badaniach klinicznych, w niniejszym dokumencie skupiamy się jedynie na kilku najważniejszych chorobach, tj. chorobach autoimmunologicznych, chorobach zakaźnych, nowotworach i chorobach neurodegeneracyjnych.

Choroby autoimmunologiczne

Diagnoza tocznia rumieniowatego układowego (SLE) stanowi wyzwanie ze względu na heterogenny obraz kliniczny i brak solidnych biomarkerów pozwalających na odróżnienie go od choroby aktywnej i nieaktywnej, jak również od innych chorób autoimmunologicznych. Lin i wsp. przeprowadzili badanie mikromacierzy przeciwciał DotScan™ na komórkach jednojądrowych krwi obwodowej od 60 pacjentów z SLE o różnej aktywności choroby, 25 pacjentów z reumatoidalnym zapaleniem stawów, 28 próbek innych chorób autoimmunologicznych i 24 zdrowych osób z grupy kontrolnej. Profile mikromacierzy przeciwciał pozwoliły na odróżnienie aktywnych pacjentów z SLE od zdrowych osób z grupy kontrolnej. Użycie tablicy wychwytu leukocytów poprawiło zdolność dyskryminacyjną konwencjonalnej diagnostyki SLE, poprzez weryfikację surowicy anty-dsDNA, dopełniacza C3 i C4, mikromacierze zwiększyły zdolność rozróżniania półaktywnego i aktywnego SLE, informacje, które pomogą w lepszym zarządzaniu chorobą.

W innym badaniu, Carlsson i wsp. skonstruowali 135 ludzkich rekombinowanych jednołańcuchowych zmiennych fragmentów (scFv) ukierunkowanych na białka immunologiczne w celu zbudowania wewnętrznej mikromacierzy przeciwciał. W tym badaniu badali pacjentów z twardziną układową (SSc), SLE i 15 zdrowych ochotników. SSc jest chorobą autoimmunologiczną dotyczącą tkanki łącznej, która może być trudna do zdiagnozowania w odróżnieniu od SLE. Tablica zidentyfikowała 40 różnie wyrażonych białek, tworząc sygnaturę proteomu kandydującego do odróżnienia SLE i jego ciężkości od SSc. Ta sygnatura białkowa była lepszą klasyfikacją choroby niż pojedyncze lub nawet kombinacje konwencjonalnych parametrów klinicznych, w tym, ANA, anty-DNA, SLEDAI-2 k, C1q, C3, C4 i CRP, ilustrując potencjalne zastosowanie mikromacierzy przeciwciał do tworzenia nowych sygnatur choroby, które dodadzą wartość kliniczną do zarządzania chorobą.

Choroby zakaźne

Infekcje aktywują układ odpornościowy w różny sposób, a mechanizmy te mogą być badane przy użyciu tablic przeciwciał na poziomie całego proteomu. Helicobacter pylori jest patogenem, który kolonizuje około połowę światowej populacji i powoduje przewlekłe zapalenie błony śluzowej żołądka. Sukri i wsp. zastosowali mikromacierz przeciwciał DotScan™ do określenia tolerancji układu odpornościowego wobec komórek nowotworowych w raku żołądka, używając 144 przeciwciał CD do profilowania dystrybucji markerów CD pomiędzy zakażonymi Helicobacter pylori i niezakażonymi komórkami gruczolakoraka żołądka. Co ciekawe, odkryli oni, że linia komórkowa gruczolakoraka żołądka AGS zainfekowana przez cagA + H. pylori wykazała zwiększoną ekspresję CD27, która jest niezbędna do utrzymania populacji komórek T, a zwiększone markery CD zostały również wykryte u pacjentów z rakiem żołądka zainfekowanych H. pylori. Badanie to sugeruje nie tylko tolerancję układu odpornościowego wobec raka żołądka, ale także zmienność odpowiedzi immunologicznej wykorzystywaną przez różne szczepy H. pylori.

Co więcej, tablice przeciwciał mogą być przydatne w śledzeniu ciągłych zmian w środowisku fizjologicznym, w tym stanu choroby i odpowiedzi na terapie i interwencje. Po przeszczepie wątroby u 94% pacjentów stwierdzono uszkodzenia histologiczne wywołane wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV), przy czym u niektórych pacjentów doszło do poważnego nawrotu choroby. Istnieje pilna potrzeba opracowania biomarkerów predykcyjnych, które pozwoliłyby na identyfikację ciężkości nawrotu choroby. Używając mikromacierzy przeciwciał CD, zbadano krew obwodową pacjentów zdefiniowanych jako grupa przed przeszczepem, wczesna, środkowa i późna w celu przewidzenia ciężkości nawrotu HCV po przeszczepie. Seryjne próbki krwi pobrane od pacjentów przed i po przeszczepie wątroby umożliwiły śledzenie środowiska choroby, z własnymi wewnętrznymi kontrolami. Pięć markerów CD (CD27, CD182, CD260, CD41 i CD34) było znacząco zwiększonych w ciężkim nawrocie w porównaniu z łagodnym nawrotem. Wynik ten wskazuje, że tablice przeciwciał mogą pomóc w ocenie ciężkości nawrotu choroby HCV po przeszczepieniu wątroby.

Ellmark i wsp. opracowali mikromacierz pojedynczego rekombinowanego przeciwciała ramowego (SinFabs) zawierającą 127 różnych przeciwciał przeciwko antygenom immunoregulacyjnym wybranym z biblioteki n-CoDeR na gruczolakoraku żołądka. Wyjaśnili, że różne sygnatury ekspresji białek związanych z nowotworem, jak również z infekcją, takie jak IL-9, IL-11 i MCP-4, mogą być zidentyfikowane z proteomu osocza i służyć jako potencjalne biomarkery. Odkrycia te mogą pomóc w lepszym zrozumieniu raka wywołanego przez H-pylori i mogą utorować drogę do udoskonalonej diagnostyki w przyszłości.

Bead based antibody arrays have been performed to investigate differential protein profiles in plasma in children suffering from malaria and malaria-related complications . Z 1000 przebadanych białek, 41 białek wykazywało zróżnicowaną ekspresję pomiędzy dziećmi zarażonymi malarią a dziećmi z grupy kontrolnej. Trzynaście kolejnych białek było związanych z ciężkością choroby malarii. Wyniki te wskazują na udział zapalenia, jak również niezrównoważony metabolizm glukozy w ciężkich postaciach choroby, a największe zmiany zaobserwowano w dwóch białkach mięśniowych (anhydraza węglowa 3 i kinaza kreatynowa), co wskazuje na uszkodzenia mięśni i zmiany u dzieci z malarią mózgową. Wyniki te mogą pomóc w opracowaniu prostych testów do klasyfikacji dzieci zarażonych malarią do grupy wykazującej większe ryzyko ciężkiej postaci choroby.

Rak

Mikromacierze przeciwciał zostały zastosowane w badaniach nad rakiem głównie do badania progresji nowotworu i białek kandydujących, które mogą służyć jako biomarkery diagnostyczne. Rak trzustki jest agresywną chorobą o złym rokowaniu, dlatego pilnie potrzebne są specyficzne dla tej choroby biomarkery, które umożliwią wczesną i dokładną diagnozę. Wykorzystując własną platformę mikromacierzy rekombinowanych przeciwciał, Wingren i wsp. przebadali surowice 148 pacjentów z rakiem trzustki, przewlekłym zapaleniem trzustki, autoimmunologicznym zapaleniem trzustki (AIP) oraz zdrowych osób z grupy kontrolnej. Zidentyfikowali panel 25 białek docelowych, w tym IL-2, IL-11, IL-12, TNF-, które przyczyniły się do odróżnienia raka trzustki od zdrowych kontroli. Ta sygnatura 25 białek wykazuje wysoki potencjał diagnostyczny (AUC równe 0,88). Ponadto, grupa ostatnio rozszerzyła analizę swojego panelu na dodatkowe zestawy próbek, w tym chłoniaka, raka prostaty i raka piersi w lizatach komórkowych i osoczu. Wyniki te są przydatne do pomocy w rozwoju nowych i wieloczynnikowych metod diagnostycznych.

Jednym z najważniejszych pytań w biologii nowotworów, jest określenie inwazyjności guza. W jednym z badań opracowano dostosowaną platformę mikromacierzy przeciwciał zawierającą 4096 cech do badania próbek osocza obejmujących choroby przedinwazyjne i inwazyjne z mysiego modelu gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDA). Znaleziono sygnaturę białkową, składającą się z różnicowej ekspresji trzech białek, ERBB2, TNC i ESR1, która może być wykorzystana do poprawy AUC z 0,86 (95% przedział ufności 0,76-0,96) do 0,97 (95% CI 0,92-1,0), gdy marker PDA CA19-9 jest włączony.

Większość nowo zdiagnozowanych przypadków raka pęcherza moczowego jest w niskim stadium, o niskim stopniu zaawansowania, nieinwazyjna dla mięśni. Po standardowej resekcji przezcewkowej 50-70% guzów nawraca, jednak 10-30% guzów ulega progresji do choroby inwazyjnej dla mięśni. Zrozumienie mechanizmu progresji nowotworu może dostarczyć bardziej użytecznych informacji dla celów klinicznych. Srinivasan i wsp. badali lizaty komórkowe z mikromacierzą przeciwciał zawierającą 810 przeciwciał związanych z nowotworami, skonstruowaną przez laboratorium Hoheisela. Autorzy zbudowali wieloczynnikowy klasyfikator zawierający 20 białek, który ułatwiał przewidywanie nawrotów z czułością 80% i specyficznością 100%. Co ciekawe, w raku nawrotowym stwierdzili oni represję szlaku sygnałowego TGF-β. Czynniki sygnalizacyjne IFNG, TNF-α i THBS1 uległy mniejszej ekspresji, a obfitość inhibitora MAPK3 (znanego również jako ERK1) była wyższa, podczas gdy SMAD2, SMAD3 i SMAD4 były ponownie znacząco niedoreprezentowane. Dane te wskazują, że inhibitory szlaku sygnalizacyjnego TGF-β mogą zmniejszyć nawroty raka pęcherza moczowego.

Puig-Costa i wsp. zastosowali mikromacierze przeciwciał w celu odkrycia biomarkerów dla raka żołądka (GC). W szczególności mikromacierz przeciwciał zawierała przeciwciała skierowane przeciwko różnym dobrze znanym białkom funkcjonalnym, które odgrywają kluczową rolę w progresji nowotworu, w tym 120 cytokin, 43 czynniki angiogenne, 41 czynników wzrostu, 40 czynników zapalnych i 10 metaloproteinaz. Analiza ścieżek Ingenuity potwierdziła, że niektóre biomarkery, takie jak ICAM-1 i angiogenina, wskazują na wysoką odpowiedź zapalną u pacjentów z GC. Stwierdzono nadreprezentację ruchów komórkowych i celów handlu komórkami odpornościowymi, takich jak białko chemoatrakcyjne monocytów (MCP)-1 u pacjentów z GC. Pozytywna wartość predykcyjna i negatywna wartość predykcyjna w tej kohorcie walidacyjnej wynosiły odpowiednio 75% (95% CI 53-90) i 80% (95% CI 56-94). Wreszcie, analizy mikromacierzy przeciwciał proteomu zapalnego związanego z GC zidentyfikowały 21-białkową sygnaturę raka żołądka napędzanego białkami zapalnymi (INPROGAS), która dokładnie odróżniała GC od nienowotworowej błony śluzowej żołądka i może dostarczyć nowych wskazówek do analizy progresji raka.

W raku prostaty, Schwenk i wsp. użyli tablic przeciwciał na tablicach paciorków zawieszonych, aby porównać poziomy białek w osoczu pomiędzy różnymi grupami w celu znalezienia dodatkowych biomarkerów obok antygenu swoistego dla prostaty (PSA). Poza klasyfikacją pacjentów na podstawie PSA, zidentyfikowali oni obniżony poziom CNDP1 w osoczu, a w kolejnych większych badaniach wykazano, że wiąże się to z bardziej agresywnymi postaciami choroby. W celu potwierdzenia tych wyników u ponad 1200 pacjentów opracowano test immunologiczny typu sandwich, a związek obniżonego stężenia CNDP1 z przerzutami do węzłów chłonnych został dalej wyjaśniony. Jest to jedno z niewielu badań, które z powodzeniem potwierdziły wstępne wskazanie poprzez zastosowanie mikromacierzy przeciwciał i opracowanie ukierunkowanego testu. W kolejnym badaniu dotyczącym wyniszczenia nowotworowego stwierdzono, że poziom CNDP1 w osoczu jest obniżony u pacjentów z wyniszczeniem nowotworowym, co wskazuje na metaboliczną rolę zmian w poziomie CNDP1.

W badaniu guzów neuroendokrynnych jelita cienkiego Darmanis i wsp. zbadali poziom osocza w dwóch niezależnych zestawach badawczych (77 i 132 próbki) oraz ukierunkowaną macierz perełek dla 124 unikalnych białek. Udało im się osiągnąć dokładność klasyfikacji do 85% przy użyciu panelu białek, a na zakończenie zaproponowali nowych kandydatów do klasyfikacji guzów. Spośród wybranych kandydatów, takich jak IGFBP2 i IGF1, grupa przeprowadziła testy ELISA w celu potwierdzenia wskazań. Wyniki te wskazują na metaboliczne powiązanie białek osocza z rakiem i wspierają rozważenie tych celów w przyszłych badaniach nad rakiem.

Choroby neurodegeneracyjne

Analiza ekspresji białek daje możliwość poszerzenia obecnej wiedzy na temat patofizjologii neurodegeneracyjnej. Ostatnie postępy w dziedzinie proteomiki zaoferowały potencjał do poszukiwania nowych biomarkerów przy użyciu mikromacierzy przeciwciał. Postęp w opracowywaniu protokołów pozwolił badaczom na badanie nie tylko krwi, ale również płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF).

W ramach neuroproteomiki, laboratorium Nilsson przeprowadziło kilka badań z wykorzystaniem przeciwciał z Human Protein Atlas wraz z testami macierzy perełkowej. Profilując CSF od pacjentów ze stwardnieniem rozsianym (MS), znaleźli GAP43, cytoplazmatyczne białko zaangażowane w tworzenie i regenerację neuronów, stąd obiecujący biomarker chorób mózgu. Ostatnio Remnestål i wsp. porównali poziomy białek w 441 próbkach płynu mózgowo-rdzeniowego pobranych z różnych zestawów próbek chorób neurodegeneracyjnych, jak również w płynie mózgowo-rdzeniowym pobranym pośmiertnie. Spośród 376 przeciwciał, białka synaptyczne GAP43 i NRGN okazały się być związane z pacjentami z AD w porównaniu z kontrolami.

Używając próbek osocza, płynu mózgowo-rdzeniowego i tkanki mózgowej od pacjentów cierpiących na stwardnienie rozsiane, przeprowadzono badania przesiewowe na dużą skalę, które rozpoczęły się od wykorzystania 4500 przeciwciał na tablicach koralikowych. Znaleziono zestaw białek , które były związane z podtypami stwardnienia rozsianego w CSF i osoczu. Wykorzystanie niektórych przeciwciał wyhodowanych przeciwko IRF8, IL7 i METTL14 również do analizy immunofluorescencyjnej tkanki mózgowej wykazało zabarwienie neuronów w pobliżu zmian w MS. Wskazuje to, że przeciwciała wybrane z testów opartych na tablicach do analizy płynów ustrojowych mogą również dostarczyć dalszych dowodów w dotkniętej tkance.

Ostatnio, tablice koralikowe zostały użyte do profilowania osocza pacjentów cierpiących na stwardnienie zanikowe boczne (ALS) , gdzie 367 pacjentów z ALS i 101 kontroli zostało przeanalizowanych pod kątem 278 białek. Badanie kończy się zaproponowaniem polipeptydu neurofilamentu średniego (NEFM), rodziny nośników solutu 25 (SLC25A20) i regulatora sygnalizacji białek G 18 (RGS18) jako wartościowych białek, ponieważ są one zaangażowane w procesy związane z patofizjologią choroby, które wymagają dalszej walidacji w niezależnych zestawach próbek.

.