Cytotoksyczny i genotoksyczny wpływ acefatu na ludzkie plemniki

Abstract

Ekstensywne stosowanie pestycydów fosforoorganicznych (OP) może zmieniać jakość nasienia i DNA plemników na różnych etapach spermatogenezy. Acefat jest wysoce toksycznym, szeroko stosowanym OP, dlatego też naszym celem była ocena wpływu acefatu na jakość ludzkiego nasienia i integralność DNA plemników. Plemniki pobrane od zdrowych mężczyzn poddano działaniu 0, 50, 100 i 200 μg/mL acefatu i inkubowano przez 1 h, 2 h i 3 h. Następnie badano ruchliwość, żywotność, integralność funkcjonalną błony plazmatycznej, kapacytację plemników i uszkodzenia DNA. Wyniki wykazały znaczący spadek ruchliwości w dawce 100 μg/mL po 3 h oraz w dawce 200 μg/mL po 1 h, 2 h i 3 h. Żywotność była znacząco obniżona w dawce 200 μg/mL po 2 h i 3 h. Integralność funkcjonalna była znacząco zaburzona w dawce 100 μg/mL po 3 h oraz w dawce 200 μg/mL po 2 h i 3 h. Podobnie, kapacytacja plemników była znacząco zaburzona w dawce 200 μg/mL po 1 h, 2 h i 3 h oraz w dawce 100 μg/mL po 3 h. Uszkodzenia DNA były znacząco zwiększone tylko w dawce 200 μg/mL po 3 h. Badanie sugeruje, że ekspozycja na acefat może powodować zmiany w strukturze i funkcji plemników, przyczyniając się w ten sposób do pogorszenia jakości ludzkiego nasienia, wywołując niepłodność.

1. Wprowadzenie

W ciągu ostatnich kilku dekad wiele badań wykazało destrukcyjne funkcje rozrodcze u zwierząt i u ludzi z powodu chemikaliów wytwarzanych przez człowieka i innych substancji toksycznych. Niestety, stosunkowo niewiele badań systematycznie zajęli się wpływem ekspozycji środowiskowej na zdrowie reprodukcyjne człowieka. Według ostatnich badań, globalnie każdego roku pary cierpiące z powodu niepłodności (brak poczęcia po 12 miesiącach regularnych stosunków seksualnych bez zabezpieczenia) stanowią około 60-80 milionów osób. Dziewięćdziesiąt osiem procent przypadków subpłodności u mężczyzn można przypisać głównie wadliwej jakości plemników. Jednakże subpłodność może być uważana za idiopatyczną i może być wynikiem czynników ryzyka, takich jak środowiskowe czynniki zaburzające gospodarkę hormonalną, w tym pestycydy.

Pestycydy arganofosforanowe są estrami kwasów fosforowych i tiofosforowych, a ich toksyczność była związana z ich zdolnością do hamowania działania acetylocholinoesterazy, co prowadzi do gromadzenia się acetylocholiny w połączeniach nerwowych. Wiele badań epidemiologicznych wykazało związek między narażeniem na pestycydy fosforoorganiczne (OP) a zaburzeniami reprodukcji, takimi jak niepłodność, wady wrodzone, niekorzystne wyniki ciąży i zgony okołoporodowe. Podejrzewa się, że pestycydy fosforoorganiczne zmieniają funkcje rozrodcze poprzez zmniejszenie aktywności acetylocholinoesterazy mózgowej, wpływając na gonadotropinę przysadkową, powodując niepłodność. Wpływ na jakość nasienia może być oceniana przez parametry takie jak stężenie plemników, procent plemników ruchliwych i procent plemników o prawidłowej morfologii, wraz z parametrami ruchu plemników. Kilka badań wykazało, że mężczyźni narażeni na OP mieli wysokie ryzyko rozwoju nieprawidłowych parametrów nasienia, w tym zmniejszonej koncentracji nasienia, zmniejszonej ruchliwości plemników, zmniejszonej liczby plemników i wyższej aneuploidii chromosomów płciowych w spermie. Badanie przeprowadzone w Chinach z użyciem różnych OP wykazało wyraźną zależność pomiędzy obecnością metabolitów insektycydów w moczu a stężeniem i ruchliwością plemników u nowożeńców. Badania in vitro przeprowadzone przy użyciu OP dostarczyły dowodów na to, że pestycydy te mogą uszkadzać DNA w ludzkiej spermie, powodując tym samym efekty genotoksyczne.

Pośród szeroko stosowanych i toksycznych OP na Sri Lance, acefat (O,S-dimetyloacetylofosforoamidotioat) jest środkiem owadobójczym, stosowanym w rolnictwie i do celów domowych ze względu na jego szerokie spektrum właściwości owadobójczych. Acefat jest insektycydem systemicznym o działaniu kontaktowym i żołądkowym. Toksyczny mechanizm działania acefatu przypisuje się nie tylko inhibicji acetylocholinoesterazy (AchE), ale także działaniu jako opóźniony środek neurotoksyczny. Sing i Jiang stwierdzili, że acefat jest silnym związkiem neurotoksycznym, mutagennym, rakotwórczym i cytotoksycznym. Podobnie Farag i wsp. wykazali, że acefat w dawkach 14 i 28 mg/kg/dzień zmniejszył ruchliwość plemników i liczbę plemników u dorosłych samców myszy. Kolejne dwa badania potwierdziły, że acefat znacząco obniża płodność, dynamikę plemników, masę narządów płciowych i poziom hormonów płciowych u samców szczurów albinosów. W związku z tym, podobnie jak w przypadku innych OP, istnieje potencjalne ryzyko wpływu tego związku na zdrowie reprodukcyjne ludzi.

Acefat jest szeroko stosowany przez rolników na Sri Lance, którzy są w najlepszym wieku reprodukcyjnym. W ostatnich dwóch lub trzech dekadach stało się jasne, że narażenie zawodowe na pestycydy może wpływać na płodność mężczyzn, wskazując tym samym na wysokie ryzyko narażenia tych młodych plantatorów. Regulacja pestycydów opiera się głównie na modelach zwierzęcych, a dane dotyczące narażenia ludzi i jakości nasienia są nadal nieliczne i ograniczone. Dlatego obecne badanie zostało przeprowadzone w celu zbadania wpływu acefatu na płodność mężczyzn i integralność DNA plemników w warunkach in vitro.

2. Materiały i Metody

2.1. Materiał badany

Acefat niesformułowany (nazwa handlowa: Surrender; wzór molekularny: C4H10NO3PS; masa cząsteczkowa: 183,16 g/mol; czystość: 99,0%; zalecane przez producenta dawkowanie polowe: 1 g acefatu na 1 L wody) otrzymano z Hayleys Agriculture Ltd., Colombo, Sri Lanka. Ponieważ acefat jest łatwo rozpuszczalny w Biggers Whitten Whittingham (BWW), użyto go jako kontroli.

2.2. Pobranie i przygotowanie nasienia

Próbki nasienia zostały pobrane od zdrowych mężczyzn (wiek 20-30 lat) dawców z Uniwersytetu Sri Jayewardenepura, Sri Lanka, w sterylnej fiolce. Przed pobraniem nasienia dawcy otrzymali arkusz informacyjny i formularz zgody na udział w badaniu. Wszyscy uczestnicy badania zostali poproszeni o powstrzymanie się od jakiejkolwiek aktywności seksualnej przez 3 do 5 dni przed pobraniem nasienia. Do badania wybrano mężczyzn (średnia wieku ) z prawidłową koncentracją, ruchliwością, morfologią, lepkością, czasem upłynnienia i pH nasienia oraz brakiem form niedojrzałych i leukocytów. Parametry nasienia (ruchliwość, żywotność, test pęcznienia hipoosmotycznego i morfologia) oceniano zgodnie z wytycznymi Światowej Organizacji Zdrowia. Ponieważ działanie acefatu może się nasilić w przypadku nieprawidłowych plemników, ważne jest, aby do badania wybrać dawców o akceptowalnej jakości nasienia.

Zgodę etyczną (nr ref.: 712/13) uzyskał Ethics Review Committee, Faculty of Medical Sciences, University of Sri Jayewardenepura, Nugegoda, Sri Lanka.

2.3. Określenie poziomów dawek

Aby określić poziomy dawek, przeprowadzono badanie wartości LD50 acefatu dla ruchliwości plemników. W związku z tym przygotowano próbkę zawierającą 1 mg acefatu w 1 mL BWW, co odpowiada zalecanej dawce polowej (1 g acefatu w 1 L wody) acefatu. Przygotowane próby rozcieńczano następnie BWW w celu uzyskania różnych stężeń acefatu. Zawiesiny plemników (ustalone na 50 × 106 plemników/mL) umieszczano w probówkach Eppendorfa i dodawano odpowiednią objętość BWW lub roztworu badanego (końcowa objętość probówki wynosi 1 mL). Próbki dokładnie mieszano, a następnie inkubowano przez 1 h w nawilżanym inkubatorze (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japonia) w temperaturze 37°C w 5% CO2. Po inkubacji, procentowa ruchliwość plemników była określana dla każdego stężenia przez dwóch niezależnych obserwatorów pod mikroskopem Olympus z optyką fazowo-kontrastową (X 400; Olympus Corporation, Japonia). Na podstawie tego pilotażowego badania mającego na celu określenie wskazań dawek toksycznych dla próbek nasienia wykazano, że wartość LD50 dla acefatu wynosi 200 μg/mL. W związku z tym w obecnym badaniu zastosowano stężenia subletalne poniżej LD50, w tym wartość LD50.

Poniżej podano wybrane poziomy dawek dla obecnego badania: Wysoka dawka: 200 μg/mL (odpowiednik wartości LD50). Dawka średnia: 100 μg/mL. Niska dawka: 50 μg/mL.Ponadto, zdecydowaliśmy się rozszerzyć punkty czasowe z 1 h na 2 h i 3 h w celu określenia przedłużonych efektów ekspozycji na acefat.

2.4. Inkubacja pestycydów

Świeże próbki nasienia () rozcieńczano BWW, aby uzyskać ostateczne stężenie plemników 40 × 106 plemników/mL. Następnie próbki inkubowano albo z pestycydem w stężeniu 50, 100 i 200 μg/mL albo z BWW. Inkubacje prowadzono w 1 mL objętości końcowej przez 1, 2 i 3 h w temperaturze 37°C w inkubatorze (Sanyo Electric Co. Ltd., Tokyo, Japonia) w atmosferze 5% CO2 i 95% O2.

2.5. Determination of Sperm Motility

Total motile spermatozoa were estimated (approximately 100 cells) by two independent observers under phase-contrast optics (X 400; Olympus Corporation, Japan). Obliczono procentową ruchliwość do przodu.

2.6. Cytotoxicity Assay

Żywotność plemników oceniano przy użyciu techniki barwienia Eozyną Y i obliczano ilość martwych i żywych plemników. Procentowa żywotność = (całkowita liczba komórek – liczba wybarwionych/ całkowita liczba komórek) × 100. Całkowita liczba komórek = 100.

2.7. Określenie integralności funkcjonalnej błony plazmatycznej plemników

Integralność funkcjonalną błony plazmatycznej plemników oceniano przy użyciu testu Hypoosmotic Swelling (HOS) opisanego przez Jeyendrana i wsp. W każdym preparacie liczono co najmniej 100 plemników.

2.8. Określenie kapacytacji

Podwielokrotność 150 μL podłoża BWW umieszczano w ogrzanej wcześniej szalce hodowlanej (35 × 10 mm, Corning, Nowy Jork, USA) i przykrywano ogrzanym wcześniej szkiełkiem nakrywkowym 22 × 22 mm. Do rogu szkiełka nakrywkowego dodawano porcję 20 μL próbki spermy. Naczynie hodowlane umieszczano w mikroskopie odwróconym (Diaphot, Nikon, Londyn, Wielka Brytania) wyposażonym w termostatycznie kontrolowaną szafkę z podgrzewanym powietrzem (Nikon, Londyn, Wielka Brytania), wyrównaną w temperaturze 37°C. Status kapacytacji plemników oceniano na podstawie hiperaktywacji metodą obiektywnej fotografii przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym Olympus IX71. Ponieważ hiperaktywacja jest zjawiskiem związanym z ruchliwością flagelli, możliwa jest wizualna ocena hiperaktywacji na podstawie ruchliwości plemników; wzorce ruchu flagelli były oceniane w celu wyliczenia plemników niehiperaktywowanych i hiperaktywowanych. Eksperymenty przeprowadzono w dwóch egzemplarzach i powtórzono niezależnie cztery razy.

2.9. Determination of DNA Damage in Spermatozoa

Rozmazy nasienia przygotowywano na oczyszczonych szkiełkach mikroskopowych, a odsetek plemników z prawidłowym DNA określano, licząc 500 plemników pod mikroskopem fluorescencyjnym (BH-2, Olympus Ltd., Japonia) przy wzbudzeniu 490 nm. Czas obserwacji pojedynczego pola wynosił mniej niż 40-50 s. Plemniki wykazujące zabarwienie żółte do czerwonego oceniano jako DNA zdenaturowane, a plemniki wykazujące zabarwienie zielone jako DNA prawidłowe .

2.10. Analiza statystyczna

Liczba plemników dorosłych mężczyzn miała rozkład normalny i była porównywana między grupami za pomocą dwukierunkowej analizy wariancji (ANOVA) przy użyciu pakietu oprogramowania Minitab (Minitab Co., USA) dla głównego efektu pestycydów. Tam, gdzie stwierdzono istotny efekt leczenia, różnice pomiędzy średnimi poszczególnych grup testowano metodą „Tukey 95%”. Dane są wyrażone jako średnia ± Standardowy Błąd Średni (SEM). wartość została ustawiona na .

3. Wyniki

3.1. Ruchliwość plemników

W porównaniu z kontrolą, procentowa ruchliwość była znacząco () obniżona (Tabela 1) przy średniej dawce (100 μg/mL) o 16% po 3 h inkubacji. W przeciwieństwie do tego, wysoce znaczące () zmniejszenie zostało odnotowane w 200 μg/mL po 1 h, 2 h i 3 h inkubacji w porównaniu do kontroli. Ponadto, zmniejszenie ruchliwości jest wyraźne w każdej dawce z rosnącym czasem inkubacji.