Dobór endonukleazy AP EXO-3 powoduje opóźnienie rozwoju i nieprawidłową organogenezę sromu, Pvl, through DNA glycosylase-initiated checkpoint activation in Caenorhabditis elegans

Poziom ekspresji endonukleaz AP wzrasta po stadium L4

Po wykluciu, C. elegans rozwijają się w dorosłe osobniki poprzez cztery stadia larwalne (L1-L4), z których każde jest przerywane przez topnienie kutikuli. Dorosłe stadia są nadal podzielone na dwa etapy: stadium młodego dorosłego i stadium ciążowego dorosłego. Aby uzyskać wgląd w rolę endonukleaz AP po embriogenezie, zmierzyliśmy czasową zmianę poziomu ekspresji mRNA egzo-3 lub apn-1. W 0, 24 i 48 godzinie, kiedy większość robaków N2 znajduje się odpowiednio w stadium jaja, L1 i L4, nie stwierdzono różnicy w poziomie ekspresji mRNA dla exo-3 i apn-1 (Rys. 1a,b). W 60 godzinie, kiedy większość robaków N2 znajdowała się w stadium młodego osobnika dorosłego, poziom ekspresji exo-3 i apn-1 był około 13-krotnie i 2,3-krotnie wyższy niż w 0 godzinie, odpowiednio (Rys. 1a,b). Poziom ekspresji w 72 godzinie, kiedy większość robaków N2 znajduje się w stadium gravid adult, był taki sam jak w 60 godzinie (Rys. 1a,b). Wyniki te sugerują, że endonukleazy AP są wymagane po embriogenezie, szczególnie po stadium L4.

Mutanty exo-3 wykazują opóźnienie rozwojowe

Aby wyjaśnić udział endonukleaz AP w rozwoju robaków od stadium L4 do dorosłego, robaki z niedoborem jednej lub obu endonukleaz AP (EXO-3 i APN-1) inkubowano w normalnych warunkach hodowlanych przez 3 dni od stadium zapłodnionego jaja (Rys. 1c). Stadia rozwojowe L4, młodych osobników dorosłych i jajorodnych osobników dorosłych rozróżniano na podstawie stanu morfologii sromu i wylęgu jaj (ryc. 1d,f). Chociaż wszystkie robaki N2 rozwinęły się do stadium gravid adult, tylko 14% mutantów exo-3 było w stadium gravid adult, 85% było w stadium young adult i 1% w stadium larwalnym (Rys. 1g), co sugeruje, że niedobór EXO-3 powoduje zatrzymanie rozwoju lub jego opóźnienie. W przeciwieństwie do tego, wszystkie mutanty apn-1 stały się płodnymi dorosłymi, a mutanty apn-1;exo-3 były w prawie tych samych stadiach rozwojowych co mutanty exo-3 (Rys. 1g). Dwanaście godzin później, wszystkie mutanty exo-3 i apn-1;exo-3 osiągnęły stadium gravid adult (dane nie pokazane), wskazując, że niedobór EXO-3 nie powoduje zatrzymania rozwoju w stadium młodego dorosłego, a jedynie opóźnienie rozwoju. Aby dokładnie zbadać, jak długie było opóźnienie mutantów exo-3, mierzyliśmy czas dotarcia do stadium gravid adult każdego robaka co dwie godziny i obliczyliśmy różnicę średniego czasu między N2 (N = 8) i mutantami exo-3 (N = 16). Różnica wynosiła 6 godzin.

Opóźnienie rozwojowe w mutantach exo-3 jest zależne od glikozylazy DNA NTH-1

Rozsądne jest wnioskowanie, że fenotyp opóźnienia rozwojowego mutantów exo-3 jest spowodowany nagromadzeniem miejsc AP lub 3′-blokowanych SSB w DNA, ponieważ są one substratami dla EXO-315. Te struktury w DNA mogą być generowane przez glikozylazy DNA. Spośród dwóch glikozylaz DNA konserwowanych w C. elegans, UNG-1 generuje miejsca AP poprzez monofunkcyjną aktywność glikozylazy DNA na uracylu w DNA, a NTH-1 wytwarza 3′-blokowane SSB poprzez dwufunkcyjną aktywność glikozylazy DNA na oksydacyjnych zmianach pirymidynowych w DNA. Dlatego zbadaliśmy zależność opóźnienia u mutantów exo-3 od UNG-1 i NTH-1. Trzy dni po rozwinięciu się z jaj, 9% mutantów ung-1;exo-3 było w stadium gravid adult, 86% w stadium young adult i 5% w stadium larwalnym, a proporcje te były prawie takie same jak te wykazane przez mutanty exo-3 (11% w stadium gravid adult, 85% w stadium young adult i 4% w stadium larwalnym) (Rys. 2), co sugeruje, że opóźnienie jest niezależne od UNG-1. W przeciwieństwie do tego, 94% mutantów nth-1;exo-3 znajdowało się w stadium gravid adult, a 6% w stadium young adult. Mutanty nth-1;ung-1;exo-3 wykazywały podobne wyniki (ryc. 2), sugerując, że opóźnienie jest zależne od NTH-1.

Opóźnienie rozwojowe mutantów exo-3 jest wzmocnione przez MMS i NaHSO3

Aby wyjaśnić, czy czynniki generujące miejsca AP mogą powodować opóźnienie rozwojowe, przeprowadziliśmy test rozwojowy z użyciem MMS i wodorosiarczynu sodu (NaHSO3) (ryc. 3a). MMS jest znany z pośredniego tworzenia miejsc AP20,21 i wykazano, że indukuje zmiany DNA w genomie C. elegans22. W 3,5 dnia po złożeniu jaj na płytkach zawierających 0,94 mM MMS, 97% N2 było w stadium gravid adult i 3% było w stadium larwalnym, podczas gdy 61% mutantów exo-3 było w stadium gravid adult, 34% było w stadium young adult i 5% było w stadium larwalnym (Fig. 3b), co sugeruje, że indukowane przez MMS miejsca AP powodują dalsze opóźnienie rozwoju u mutantów exo-3 niż u N2. Z drugiej strony, 93% mutantów apn-1 znajdowało się w stadium gravid adult, 6% w stadium young adult i 1% w stadium larwalnym, co jest podobne do wyników dla N2 (Rys. 3b). NaHSO3 uszkadza DNA głównie poprzez deaminację cytozyny do uracylu23. Cztery dni po rozwinięciu się z jaja, wszystkie mutanty exo-3 nie traktowane NaHSO3 rozwinęły się w jajowate osobniki dorosłe, ale 33% z tych traktowanych 10 mM NaHSO3 było w jajowatym stadium dorosłym, 12% w stadium młodego osobnika dorosłego i 55% w stadium larwalnym (Rys. 3c), wskazując, że NaHSO3 indukował opóźnienie rozwoju u mutantów exo-3. Opóźnienie to zostało złagodzone u mutantów ung-1;exo-3, ponieważ 79% mutantów poddanych działaniu 10 mM NaHSO3 znajdowało się w stadium ciąży dorosłej, 14% w stadium młodego dorosłego, a 7% w stadium larwalnym (Rys. 3c), co sugeruje, że opóźnienie rozwoju wywołane przez NaHSO3 było spowodowane aktywnością UNG-1. Podsumowując, miejsca AP mogą powodować opóźnienie rozwoju tak samo jak 3′-blokowane SSB generowane przez NTH-1.

Opóźnienie rozwojowe mutantów exo-3 jest indukowane przez CHK-2

Następnie wysunęliśmy hipotezę, że opóźnienie rozwojowe mutantów exo-3 inicjowane przez glikozylazę DNA było spowodowane aktywacją punktu kontrolnego uszkodzeń DNA napędzaną przez produkty rozszczepiania wytwarzane przez glikozylazy DNA. Geny punktów kontrolnych uszkodzeń DNA, takie jak chk-2 i clk-2, zostały opisane u C. elegans24. Aby sprawdzić naszą hipotezę, badanie rozwojowe przeprowadzono w warunkach chk-2 (RNAi) lub clk-2 (RNAi) (Rys. 4a). Chociaż 14% robaków exo-3;control (RNAi) znajdowało się w stadium gravid adult i 84% w stadium young adult, a robaki exo-3;clk-2 (RNAi) wykazywały podobne proporcje (18% w stadium gravid adult i 82% w stadium young adult), 93% robaków exo-3;chk-2 (RNAi) znajdowało się w stadium gravid adult (Rys. 4b). Tak więc, knockdown chk-2 uratował opóźnienie rozwojowe u mutantów exo-3, sugerując, że CHK-2 indukuje opóźnienie rozwojowe u mutantów exo-3.

EXO-3 zapobiega powstawaniu Pvl wywołanemu przez dut-1 (RNAi)

DUT-1 jest nukleotydohydrolazą trifosforanu deoksyurydyny (dUTPazą), która hydrolizuje dUTP do dUMP. Dlatego dut-1 (RNAi) prowadzi do zwiększenia dUTP w puli nukleotydów, który jest włączany do DNA na drodze replikacji DNA zamiast dTTP, powodując akumulację uracylu w DNA25,26. Stwierdzono, że dut-1 (RNAi) indukuje nieprawidłową organogenezę sromu, Pvl, u robaków N2 typu dzikiego, oraz że indukowana przez dut-1 (RNAi) Pvl jest zależna od UNG-127. Spekulowaliśmy, że niedobór EXO-3 powoduje wzrost częstości występowania Pvl indukowanego dut-1 (RNAi), ponieważ EXO-3 jest potrzebny do naprawy miejsc AP po rozszczepieniu uracylu w DNA przez UNG-1. Aby to potwierdzić, zaobserwowano tworzenie Pvl wywołane dut-1 (RNAi) u mutantów pozbawionych endonukleazy AP (Rys. 5a-c). Spośród osobników dorosłych, które przeżyły 4 dni po rozwinięciu się z jaj, 52% stanowiły mutanty exo-3 z Pvl indukowanym przez dut-1 (RNAi), a 13% stanowiły robaki N2 z Pvl (Rys. 5d), co sugeruje, że niedobór EXO-3 powoduje wzrost Pvl indukowanego przez dut-1 (RNAi). Z drugiej strony, 15% mutantów apn-1 miało Pvl, co jest podobne do proporcji robaków N2 z Pvl (Rys. 5d). Mutanty apn-1;exo-3 i mutanty exo-3 miały podobną proporcję, z 52% posiadającymi Pvl (Rys. 5d).

Wzrost Pvl indukowanego przez dut-1 (RNAi)w mutantach exo-3 jest zależny od UNG-1 niezależnie od NTH-1

Aby zbadać, czy wzrost Pvl indukowanego przez dut-1 (RNAi)w mutantach exo-3 zachodził poprzez aktywność UNG-1, zbadaliśmy zależność fenotypu od UNG-1. Odsetek mutantów ung-1;exo-3 z Pvl wynosił 2%, co było takie samo jak mutantów ung-1 z Pvl (1%) (Fig. 6a), co sugeruje, że wzrost Pvl w mutantach exo-3 jest spowodowany wyłącznie ekspresją UNG-1.

Następnie zbadaliśmy, czy produkty rozszczepienia wytwarzane przez UNG-1 są potrzebne do indukowania Pvl, tj. czy miejsca AP są przekształcane w 3′-blokowane SSB poprzez aktywność AP liazy NTH-1. Odsetek mutantów exo-3 z Pvl był porównywalny z mutantami nth-1;exo-3 (ryc. 7b), co sugeruje, że NTH-1 nie jest niezbędny do indukowanego przez dut-1 (RNAi) Pvl.

Wzrost Pvl wywołanego przez dut-1 (RNAi) w mutantach exo-3 jest napędzany przez CHK-2

Postawiliśmy hipotezę, że zależny od UNG-1 wzrost Pvl wywołanego przez dut-1 (RNAi) w mutantach exo-3 może wystąpić poprzez aktywację punktu kontrolnego DNA napędzaną przez produkty rozszczepienia wytwarzane przez UNG-1 oprócz opóźnienia rozwoju. Stwierdzono również, że Pvl indukowany przez dut-1 (RNAi) jest wywoływany przez kinazę punktu kontrolnego CLK-227. Dlatego sprawdziliśmy, czy wzrost Pvl indukowanego dut-1 (RNAi) w mutantach exo-3 był zależny od CHK-2 i CLK-2. Chociaż 49% robaków exo-3;control (RNAi) miało Pvl indukowany dut-1 (RNAi), to tylko 10% robaków exo-3;chk-2 (RNAi) miało go (Rys. 6b). Z drugiej strony, odsetek robaków exo-3;clk-2 (RNAi) z Pvl był prawie taki sam (44%) jak robaków exo-3;control (RNAi). Tak więc, knockdown chk-2 uratował wzrost Pvl wywołany przez dut-1 (RNAi) w mutantach exo-3, jak zaobserwowano w przypadku opóźnienia rozwoju. Wyniki te sugerują, że wzrost Pvl wywołany przez dut-1 (RNAi) w mutantach exo-3 zachodzi poprzez ekspresję CHK-2.

Oksydacyjne czynniki uszkadzające DNA zwiększyły proporcję Pvl w mutantach exo-3 tylko w połączeniu z dut-1 (RNAi)

Aby zbadać inne czynniki uszkadzające DNA, które powodują wzrost Pvl w mutantach exo-3, oceniliśmy, czy tworzenie Pvl jest wzmocnione przez oksydacyjne czynniki uszkadzające DNA, takie jak ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) i metylowy wiologen (MV). NDX-1 i NDX-2 hydrolizują 8-oxo-dGDP do 8-oxo-dGMP24,28. Odpowiednio, ndx-1 (RNAi) i ndx-2 (RNAi) prowadzą do wzrostu 8-oxo-dGDP w puli nukleotydów. Obecność 8-oxo-dGDP zmniejsza aktywność 8-oxo-dGTPazy NDX-4, powodując gromadzenie się 8-oxo-dGTP w puli24. 8-oxo-dGTP jest wbudowywany do DNA podczas replikacji DNA, co prowadzi do akumulacji 8-oxoG w DNA24,28. MV generuje rodniki ponadtlenkowe, które następnie powodują zmiany oksydacyjne w DNA29. Jednakże, pojedyncze traktowanie ndx-1 (RNAi), ndx-2 (RNAi) lub MV nie miało wpływu na występowanie Pvl u mutantów exo-3. (dane nie pokazane). Następnie zbadaliśmy, czy w połączeniu z traktowaniem dut-1 (RNAi), każdy oksydacyjny czynnik uszkadzający DNA jeszcze bardziej wzmocnił wzrost Pvl w mutantach exo-3 (Fig. 7a). Każdy testowany zabieg wzmocnił wzrost dut-1 (RNAi) indukowany Pvl w mutantach exo-3 o około 10% (ryc. 7b), co sugeruje, że zmiany oksydacyjne w DNA mogą również powodować wzrost Pvl.

W eksperymentach in vitro, NTH-1 stwierdzono, że posiada słabą aktywność glikozylazy DNA w kierunku 8-oxoG w DNA, oprócz jego znacznie wyższej aktywności w kierunku oksydacyjnych zmian pirymidynowych30. Dlatego podejrzewamy, że większy wzrost Pvl indukowanego dut-1 (RNAi) przez dodatkowe czynniki oksydacyjne zależy od aktywności NTH-1. Chociaż potwierdziliśmy zależność fenotypu od NTH-1, niedobór NTH-1 nie zmienił proporcji robaków wykazujących Pvl (Fig. 7b).