Effects of Statins on Angiogenesis and Vasculogenesis | Revista Española de Cardiología
INTRODUCTION
Statyny hamują aktywność reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo koenzymu A (HMG-CoA), enzymu, który katalizuje syntezę mewalonianu, etapu granicznego w biosyntezie cholesterolu.1 Wynikająca z tego redukcja cholesterolu wewnątrzkomórkowego prowadzi do kompensacyjnego zwiększenia wychwytu cholesterolu przez receptory lipoprotein o małej gęstości (LDL) i zmniejszenia stężenia cholesterolu w osoczu. Odkrycie statyn i ich zastosowanie u osób z dużym stężeniem cholesterolu umożliwiło znaczną poprawę pierwotnej i wtórnej prewencji choroby wieńcowej.2,3 Ostatnio skuteczność statyn w pierwotnej i wtórnej prewencji choroby wieńcowej zaobserwowano również u osób z mniejszym stężeniem cholesterolu.4-6 Oprócz zmniejszania stężenia cholesterolu LDL (C-LDL) statyny wywierają szereg plejotropowych efektów na kilka elementów miażdżycy, w tym na funkcję śródbłonka, migrację komórek, stan zapalny i skłonność do zakrzepów w blaszkach miażdżycowych.7-12 U zwierząt normocholesterolowych wykazano, że statyny mają działanie ochronne przed zmianami niedokrwienno-reperfuzyjnymi mięśnia sercowego, prawdopodobnie poprzez mechanizmy związane z wytwarzaniem tlenku azotu (NO) przez śródbłonek.13
Serynowa/treoninowa kinaza białkowa Akt lub kinaza białkowa B (PKB) jest wielofunkcyjnym wewnątrzkomórkowym regulatorem przeżycia, wzrostu i metabolizmu komórek 14 (ryc. 1). W odniesieniu do funkcji sercowo-naczyniowych Akt/PKB działa na szlaku wewnątrzkomórkowym stymulowanym przez czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF)14,15 i angiopoetynę,16-18 promując przeżycie komórek i zapewniając odpowiedni rozwój naczyń.19 Stała aktywacja sygnalizacji Akt chroni kardiomiocyty przed apoptozą w zmianach niedokrwienno-reperfuzyjnych.20 Oprócz działania cytoprotekcyjnego Akt działa jako aktywator wytwarzania NO przez śródbłonek w odpowiedzi na VEGF i stres ścinający poprzez zdolność fosforylowania śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS) w serynach 1179 lub 1177,21,22 kontrolując w ten sposób tonus naczynioruchowy.23 Z drugiej strony Akt jest niezbędna w migracji komórek śródbłonka do ogniska produkującego VEGF.24 Dlatego zdolność Akt do pośredniczenia w przeżyciu komórek, produkcji NO i migracji indukowanej VEGF sugeruje, że kinaza białkowa Akt może pośredniczyć w odpowiedzi śródbłonka na bodźce angiogenne.
Rys. 1. Statyny, sygnalizacja Akt i angiogeneza/vasculogeneza. Angiopoetyna 1 (Ang-1), VEGF i czynnik wzrostu fibroblastów (FGF), po związaniu z receptorami błonowymi, indukują przekształcenie 4,5-bifosforanu fosfatydyloinozytolu (PIP2) w 3,4,5-trifosforan fosfatydyloinozytolu (PIP3) przez 3-kinazę fosfatydyloinozytolu (PI3K). Tworzenie PIP3 jest niezbędne do fosforylacji kinazy białkowej Akt przez kinazę PDK-1. Leczenie statynami zwiększa fosforylację Akt, podczas gdy wortmanina (inhibitor PI3K) zapobiega temu procesowi. Mewalonian, produkt reduktazy HMG-CoA, również hamuje PI3K i następczą fosforylację Akt. Dlatego statyny, hamując reduktazę HMG-CoA i produkcję mewalonianu, zwiększają fosforylację Akt, a jednocześnie fosforylację i aktywację śródbłonkowej syntazy tlenku azotu (eNOS), syntezę tlenku azotu (NO) oraz szereg efektów fizjologicznych indukowanych w angiogenezie i waskulogenezie. Akt zapobiega również apoptozie komórek śródbłonka.
Ostatnio wykazano, że statyny stymulują również wewnątrzkomórkowy szlak sygnałowy kinazy białkowej Akt/PKB25-27 w komórkach śródbłonka25 i śródbłonkowych komórkach progenitorowych (EPC) szpiku kostnego,26,27 indukując w ten sposób zarówno angiogenezę25, jak i waskulogenezę.26 Wpływ statyn na kinetykę EPC został również wykazany u ludzi przez Vasa i wsp.28. W niniejszym artykule dokonano przeglądu wpływu statyn na indukcję angiogenezy25 i waskulogenezy26 poprzez mechanizmy związane z aktywacją Akt.25-27
ANGIOGENEZA I WASKULOGENEZA
Angiogeneza i waskulogeneza są odpowiedzialne za rozwój układu naczyniowego w zarodku.29-32 Waskulogeneza to proces tworzenia naczyń krwionośnych z komórek progenitorowych śródbłonka (angioblastów), które migrują i łączą się z innymi komórkami progenitorowymi śródbłonka i różnicują się w komórki śródbłonka, tworząc jednocześnie nowe naczynia krwionośne. Z kolei angiogeneza to proces rozszerzania się powstałych naczyń krwionośnych poprzez pączkowanie nowych kapilar w wyniku migracji i proliferacji wcześniej zróżnicowanych komórek śródbłonka (ryc. 2).
Fig. 2. Schematyczne przedstawienie angiogenezy i waskulogenezy. (A) Waskulogeneza to agregacja angioblastów lub komórek progenitorowych śródbłonka w celu utworzenia naczyń krwionośnych. Angioblasty łączą się in situ lub migrują w celu utworzenia naczyń krwionośnych w odległych miejscach. (B) Angiogeneza to tworzenie nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń poprzez proliferację i migrację zróżnicowanych komórek śródbłonka. (C) Angiogeneza i vasculogeneza mogą zachodzić jednocześnie. (Zaczerpnięte z Cleaver i wsp.29)
Początkowo sądzono, że proces waskulogenezy jest ograniczony do rozwoju embrionalnego, podczas gdy angiogeneza (która również zachodzi w embrionie) jest jedynym procesem zaangażowanym w neowaskularyzację u dorosłych. Ostatnio jednak zrewidowano paradygmat neowaskularyzacji postnatalnej i odkryto, że progenitorowe komórki śródbłonka krążące we krwi obwodowej,33 są włączane przez ogniska neowaskularyzacji u dorosłych zwierząt,34 zwiększają swoją liczbę w odpowiedzi na niedokrwienie tkanek,35 a także promują rozwój bocznych naczyń krwionośnych po ich ekspansji in vitro i późniejszej transplantacji.36. Badania te pozwoliły ustalić, że zarówno angiogeneza, jak i waskulogeneza są odpowiedzialne za neowaskularyzację u dorosłych.
Trzecim mechanizmem, który prawdopodobnie przyczynia się do rozwoju naczyń bocznych, jest zwiększenie rozmiaru i kalibru istniejących wcześniej tętniczych połączeń bocznych, proces zwany arteriogenezą.37 Obecność i liczba tych natywnych naczyń bocznych różni się znacznie u poszczególnych osobników i gatunków. Kiedy naczynie zostaje zatkane, dochodzi do zwiększenia prędkości przepływu krwi przez istniejące wcześniej naczynia poboczne i wzrostu luminalnych naprężeń ścinających, czyli czynników, które przyczyniają się do dojrzewania naczyń pobocznych, zwłaszcza tych o pośredniej wielkości.
Metody badań in vitro
Rozwój technik hodowli komórek śródbłonka umożliwił zrozumienie procesów zaangażowanych w angiogenezę.38 Komórki śródbłonka w hodowli zachowują zdolność do odpowiedzi na czynniki stymulujące lub hamujące angiogenezę, jak również zdolność do tworzenia rurek śródbłonkowych in vitro. Testy proliferacji komórkowej pozwalają na analizę wpływu określonej substancji na proliferację komórek śródbłonka. Migrację komórek śródbłonka w kierunku roztworu zawierającego określoną substancję, oddzielonych przepuszczalną błoną, można badać w komorze Boydena. Mechanizmy powstawania śródbłonka kanalików oraz wpływ określonej substancji na kanaliki można badać za pomocą testów dwu- lub trójwymiarowych. Za pomocą tych technik analizuje się procesy powstawania światła śródbłonka oraz wpływ macierzy zewnątrzkomórkowej na rozwój kapilar.38 Wreszcie hodowle komórek śródbłonka pozwalają na badanie szlaków molekularnych zaangażowanych w procesy angiogenezy.
Ostatnio, dzięki zastosowaniu technik selekcji komórek i specjalnych podłoży hodowlanych, techniki opracowane do badania zróżnicowanych komórek śródbłonka zostały wykorzystane do badania komórek progenitorowych śródbłonka.33-36
Metody badań in vivo
Chociaż techniki in vitro umożliwiają wstępną analizę angiogenezy i waskulogenezy, wiele czynników, które mogą wpływać lub modulować te procesy in vivo.38 W celu zbadania mechanizmów powstawania naczyń krwionośnych in vivo opracowano różne systemy biologiczne pozwalające na ilościowe określenie lub wykazanie działania określonej substancji: modele rogówki mysiej, błony kosmówkowej zarodka kurzego lub implantów gąbczastych.38 Systemy te wymagają poświęcenia zwierzęcia, więc pozwalają uchwycić efekt tylko w określonym momencie. W celu zbadania czasowej ewolucji zdarzeń w pojedynczej tkance, opracowano techniki mikroskopii przyżyciowej dla skóry na grzbiecie lub czaszki myszy.39 Wreszcie, rozwój technik inżynierii genetycznej umożliwił badanie wpływu wyciszenia (knock-out) lub dodania (knock-in) genu na procesy waskulogenezy i angiogenezy.
Badanie postnatalnej waskulogenezy oraz wpływu niektórych substancji na procesy waskulogenezy stało się możliwe dzięki zastosowaniu technik cytometrii przepływowej, sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (fluorescence-activated cell sorting, FACS), specjalnych technik hodowli komórek progenitorowych śródbłonka (endothelial progenitor cells, EPC) z krwi obwodowej oraz modeli przeszczepiania szpiku kostnego u myszy.33-36 FACS służy do wykrywania i ilościowego oznaczania EPC we krwi obwodowej przy użyciu przeciwciał przeciwko antygenom powierzchniowym tych komórek. W ten sposób można analizować wpływ leków lub czynników wzrostu na liczbę tych komórek we krwi obwodowej. Opracowane przez naszą grupę specjalne techniki selekcji i hodowli komórek umożliwiły również wykrywanie i oznaczanie ilości EPC. W modelu przeszczepiania szpiku kostnego u myszy, komórki szpiku kostnego od dawcy myszy są przeszczepiane do mysiego receptora z genem kodującym opracowanie substancji pozwalającej na jej późniejsze wykrycie (Rycina 3). W naszym przypadku gen kodował wytwarzanie beta-galaktozydazy przez komórki śródbłonka. Selektywna ekspresja jest osiągana, ponieważ gen ten jest regulowany przez specyficzny promotor komórek śródbłonka, Tie-2, u mysiego dawcy. Dlatego tylko komórki śródbłonka ze szpiku kostnego dawcy zwierzęcia będą wyrażać beta-galaktozydazę, która może być wykryta w receptorze zwierzęcym. Jeśli opisane powyżej eksperymenty biologiczne zostaną przeprowadzone po przeszczepieniu szpiku kostnego w receptorze zwierzęcym, możemy analizować wpływ danej substancji na waskulogenezę poprzez ilościowe określenie liczby komórek progenitorowych śródbłonka pochodzących ze szpiku kostnego.
Fig. 3. Murine model of bone marrow transplantation for the study of vasculogenesis. Dawcami szpiku kostnego są transgeniczne myszy, u których konstytutywna ekspresja genu LacZ (kodującego beta-galaktozydazę) regulowana jest przez specyficzny promotor śródbłonka, Tie-2. Szpik kostny jest pobierany i przeszczepiany do mysiego receptora, którego szpik kostny został napromieniowany podprzeponowo. Po okresie 4 tygodni w celu osiągnięcia rekonstytucji przeszczepionego szpiku kostnego, wykonuje się jedną lub więcej interwencji w mysim receptorze (przedstawiony przypadek to model rogówki) w celu pobudzenia neowaskularyzacji. Po tych interwencjach zwierzęta są uśmiercane i przeprowadzane jest badanie histologiczne w celu wykrycia ekspresji beta-galaktozydazy. Przy użyciu barwnika X-GAL, komórki wykazujące ekspresję beta-galaktozydazy uzyskują niebieskawe zabarwienie. Zastosowanie specyficznego promotora dla komórek śródbłonka pozwala na identyfikację niebieskich komórek, które zostały włączone do ognisk neowaskularyzacji, jako komórek linii śródbłonka.
WPŁYW STATYN NA INDUKCJĘ ANGIOGENEZY I WASKULOGENEZY
Badania przeprowadzone w naszym laboratorium i w innych miejscach wykazały, że statyny stymulują wewnątrzkomórkowy szlak sygnalizacyjny kinazy białkowej Akt/PKB,25-27 który promuje zarówno angiogenezę25, jak i waskulogenezę.26. Ponadto, Vasa i wsp. byli w stanie wykazać u ludzi wpływ statyn na kinetykę EPC.28
Wpływ statyn in vitro
Statyny szybko aktywują kinazę białkową Akt/PKB w komórkach śródbłonka25 i EPC,26,27 zwiększając w ten sposób fosforylację eNOS i następczą produkcję NO. Aktywacja Akt przez statyny sprzyja proliferacji, migracji i przeżyciu komórkowemu komórek śródbłonka i EPC, a także tworzeniu struktury naczyniowej. Ponadto zahamowanie Akt poprzez zastosowanie adenowirusów kodujących dominujące ujemne formy Akt powoduje zahamowanie efektów indukowanych przez statyny. Potencjał statyn w procesach regeneracji tkanek wykazano wcześniej w osteoblastach. W komórkach tych statyny zwiększały proliferację i poziom aktywności, w konsekwencji zwiększając tworzenie kości.40
Chociaż mechanizmy aktywacji Akt przez statyny nie są dokładnie poznane, prawdopodobny jest udział sygnalizacji przez 3-kinazę fosfatydyloinozytolu (PI3K), ponieważ proces ten jest blokowany przez wortmaninę i LY294002, dwa inhibitory tego enzymu (ryc. 1). Ponadto, hamowanie reduktazy HMG-CoA jest konieczne, ponieważ aktywacja Akt przez simwastatynę została zahamowana przez dodanie mewalonianu do inkubacji (Figura 1). Mewalonian jest niezbędny nie tylko do biosyntezy cholesterolu, ale także do produkcji ubichinonu, dolicholi i izoprenoidów, które są niezbędne w wielu procesach komórkowych. Chociaż statyny stabilizują messenger RNA (mRNA) eNOS poprzez modyfikację syntezy izoprenoidów,41 nie obserwowaliśmy zmian w wartościach syntazy białkowej eNOS. W tym sensie ważne jest podkreślenie, że wzrost stężenia mRNA był późniejszy (24 h) niż aktywacja fosforylacji eNOS przez Akt (15 min). Ten krótszy czas aktywacji jest zgodny ze zmianami indukowanymi przez statyny w produkcji NO i wazodylatacji obserwowanymi w pierścieniach aorty ex vivo.42
Wpływ statyn in vivo
Statyny i aktywacja wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Akt promują angiogenezę w modelach niedokrwienia obwodowego opracowanych u królików normocholesterolowych.25 U zwierząt, które otrzymywały statyny, obserwowano wyższe ciśnienie perfuzji, większą liczbę naczyń bocznych i większą gęstość kapilar (ryc. 4). Z drugiej strony, statyny zwiększają liczbę komórek progenitorowych śródbłonka we krwi obwodowej zarówno u myszy26,27 jak i u ludzi.28 Ponadto statyny zwiększają neowaskularyzację rogówki u myszy normocholesterolowych, częściowo dzięki wazkulogenezie z EPC uzyskanych ze szpiku kostnego (ryc. 3 i 5).26 Stosując model przeszczepu szpiku kostnego u myszy, udało się wykazać większą liczbę EPC ze szpiku kostnego w rogówkach myszy leczonych statynami. Dlatego statyny mają istotny wpływ na kinetykę EPC, jak wykazano wcześniej w przypadku VEGF lub czynnika stymulującego tworzenie kolonii granulocytów i monocytów (GM-CSF),35 a indukowana statynami mobilizacja tych komórek może zwiększać neowaskularyzację postnatalną.
Ryc. 4. Indukowany statyną wzrost neowaskularyzacji w nodze królika w odpowiedzi na jednostronną resekcję tętnicy udowej. a) Tętnica udowa i jej gałęzie są rozcięte. Transferu genetycznego do śródbłonka dokonuje się przez infuzję adenowirusa kodującego beta-galaktozydazę (Ad-βgal) lub Akt (Ad-myrAkt) do dystalnej tętnicy udowej i inkubację przez 15 min przy czasowym zaciśnięciu żyły udowej. b) Trzeciego dnia pobierany jest mięsień brzuchaty łydki i wykonywane jest barwienie X-GAL w celu określenia dystrybucji transgenicznej w preparatach histologicznych barwionych hematoksyliną-eozyną. c) Wykonywana jest angiografia przez tętnicę biodrową wewnętrzną w celu analizy tworzenia się naczyń kolateralnych w różnych grupach leczonych. W angiografii wykonanej po 40 dniach, widoczny jest wzrost tworzenia się naczyń bocznych u zwierząt, które otrzymywały 0,1 mg/kg simwastatyny we wstrzyknięciu dootrzewnowym w porównaniu do zwierząt, które były poddane interwencji, ale otrzymywały tylko roztwór soli fizjologicznej. Analizę ilościową naczyń kolateralnych przeprowadzono w grupie kontrolnej, grupie leczonej simwastatyną oraz w grupie zwierząt, które otrzymały domięśniową iniekcję Ad-VEGF. Wynik angiograficzny analizowano w grupach doświadczalnych, które otrzymały wlew roztworu soli fizjologicznej, Ad-βgal i Ad-myrAkt 31 dni po operacji. d) Barwienie na fosfatazę alkaliczną w mięśniu przywodzicielu niedokrwionej kończyny wykazało większą gęstość kapilar w grupie zwierząt leczonych simwastatyną w stosunku do grupy kontrolnej 40 dni po operacji. Dane z każdego eksperymentu przedstawiono jako średnie±SD (n=6 królików w każdej z grup leczonych, *P25)
Fig. 5. Wzrost neowaskularyzacji rogówki przez waskulogenezę indukowaną statyną. a) Reprezentatywne zdjęcia przedstawiające neowaskularyzację rogówki (lewa, pojazd; prawa, simwastatyna). b) Barwienie X-gal całych rogówek. Niebieskawe punkty to komórki, które wykazują ekspresję beta-galaktozydazy (lewa, pojazd; prawa, simwastatyna). c) Reprezentatywne mikrofotografie histochemicznego badania fluorescencji w zatopionych w parafinie rogówkach od myszy Tie2/LacZ/BMT (lewa, pojazd; prawa, simwastatyna). Obecność podwójnie dodatnich komórek jest dowodem na to, że komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) uzyskane ze szpiku kostnego zostały włączone przez ogniska neowaskularyzacji (vasculogenesis). Kolor czerwony w tym przypadku wskazuje na beta-galaktozydazę, a kolor zielony na specyficzny marker śródbłonkowy – izolektynę B4. Podwójnie pozytywne komórki (kolor żółty) to EPC uzyskane ze szpiku kostnego, które zostały włączone przez nowe naczynia. d) Reprezentatywne mikrofotografie histochemicznego badania fluorescencji w całych rogówkach od myszy Tie2/LacZ/BMT (lewa, pojazd; prawa, simwastatyna). Kolor czerwony pokazuje beta-galaktozydazę, a kolor zielony specyficzny marker śródbłonkowy lektynę BS-1. e) Ilościowa ocena EPC pochodzących z przeszczepu włączonych do neowaskularyzacji. Wyrażona jako stosunek liczby EPC do całkowitej liczby komórek śródbłonka tworzących nowe naczynia. *P26)
KONKLUZJE
Statyny promują proliferację, migrację i przeżycie komórkowe komórek śródbłonka i EPC uzyskanych ze szpiku kostnego poprzez mechanizmy związane z aktywacją serynowej/treoninowej kinazy białkowej Akt lub PKB. W sposób podobny do VEGF statyny promują angiogenezę i waskulogenezę. Dlatego aktywacja Akt może być odpowiedzialna za niektóre z korzystnych efektów działania statyn, w tym za neowaskularyzację postnatalną.
.