Frontiers in Bioengineeringand Biotechnology

Wprowadzenie

Albuminy surowicy są białkami powszechnie stosowanymi w biodiagnostyce oraz jako model w badaniach biointerfejsów (Rosi i Mirkin, 2005; Singh i in., 2005; Arcot i in., 2015). Wśród nich albumina surowicy bydlęcej (BSA) jest najtańszym i szeroko stosowanym białkiem jako czynnik blokujący w testach ELISA (Maingonnat i in., 1999). W diagnostyce papierowej, BSA (Huang et al., 2018) selektywnie zwiększa hydrofobowość papieru, aby poprawić przepływ płynów biologicznych i elucji poprzez zmniejszenie absorpcji cieczy. BSA chroni i zwiększa żywotność funkcjonalnych biomolekuł suszonych na papierze. Funkcjonalność i długowieczność immunoglobiny G i immunoglobiny M suszonych na powierzchniach poddanych działaniu BSA może wzrosnąć o rząd wielkości (van Remoortere i in., 2001). BSA zapobiega również niespecyficznej adsorpcji białek analitów do analizy ilościowej.

Wiele artykułów obszernie opisywało zjawisko sorpcji cząsteczek BSA na różnych interfejsach, takich jak złoto (Dennison i in., 2017), mika (Fitzpatrick i in., 1992), krzem (Jachimska i in., 2016; Givens i in., 2017) i celuloza (Mohan i in., 2014; Lombardo i in., 2017). Na konformację zaadsorbowanej cząsteczki BSA oraz topologię tworzącej się warstwy silnie wpływa pH, siła jonowa oraz temperatura. Cząsteczki BSA zachowują swoją natywną strukturę pomiędzy pH 4,0 a 8,0. Poniżej pH 4,0 i powyżej 8,0, cząsteczki BSA zmieniają swoją konformację fałdową, która różni się od ich struktury natywnej (Su i in., 1998a; Barbosa i in., 2010; Phan i in., 2015). Punkt izoelektryczny BSA znajduje się w pH 4,5. Przy tym pH ładunek powierzchniowy netto staje się zerowy i cząsteczki BSA agregują. Zwiększenie pH powoduje wzrost ładunku BSA, a dominujące odpychanie elektrostatyczne stabilizuje cząsteczki BSA i zapobiega agregacji (Li i in., 2008).

Pomimo tego, że jest to jedno z najlepiej zbadanych białek, pozostaje wiele pytań dotyczących wpływu pH i siły jonowej na konformację BSA po adsorpcji. W tym kontekście pojęcie pokrycia powierzchni, definiowane wyłącznie przez frakcję powierzchniową lub gęstość wagową, nie jest jasne. Istnieje potrzeba lepszego zrozumienia zmiennych definiujących interfejs ciało stałe-ciecz BSA, aby zaprojektować wytrzymałe urządzenia biodiagnostyczne.

Cząsteczki albuminy surowicy bydła adsorbują się na interfejsie tworząc warstwę o grubości w skali nanometrów. Kilka metod charakteryzacji, takich jak refleksyjność (Su i in., 1998b, 2016; Raghuwanshi i in., 2017a, b), elipsometr, mikroskop sił atomowych (AFM), rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR) i mikrobalans kwarcowy z rozpraszaniem (QCM-D) może mierzyć grubość warstwy zaadsorbowanego białka w wymaganej skali nanometrowej. W szczególności, QCM-D może kinetycznie monitorować proces sorpcji biomolekuł poprzez pomiar masy zaadsorbowanego białka na interfejsie w nanogramach (Kristensen i in., 2013; Luan i in., 2017). QCM-D umożliwia kontrolę temperatury, siły jonowej i środowiska pH. Tryb rozpraszania QCM ujawnia sztywność zaadsorbowanych warstw białkowych.

W niniejszej pracy opisano odwracalne, reagujące na pH zachowanie cząsteczek BSA zaadsorbowanych na interfejsie złoto-sól. Zaadsorbowana warstwa BSA zachowuje się jak wrażliwa na pH gąbka, w której cząsteczki wody adsorbują się i desorbują w zależności od otaczającego pH w zakresie od 4 do 8. Praca ta monitoruje i kwantyfikuje zjawisko sorpcji wody w gąbczastej warstwie BSA oraz wyjaśnia mechanizmy zachodzące przy różnym pH i sile jonowej. Naszym celem jest opisanie pokrycia BSA na granicy faz ciało stałe-ciecz pod względem liczby cząsteczek i masy/grubości warstwy. Ma to na celu wyjaśnienie koncepcji pokrycia powierzchni biomolekuły i wyjaśnienie dynamicznego zachowania zaadsorbowanych cząsteczek BSA w kontekście biodiagnostyki.

Materiały i eksperymenty

Materiały

Liofilizowany proszek albuminy surowicy bydlęcej (97%) i sól chlorku sodu (NaCl) (99,5%) zostały zakupione w Sigma Aldrich (Castle Hill, NSW, Australia). Kwas chlorowodorowy (HCl) i wodorotlenek sodu (NaOH) zostały zakupione od firmy Merck Ltd. (Castle Hill, NSW, Australia). Wszystkie chemikalia są klasy analitycznej i zostały użyte bez żadnego oczyszczania.

Pomiary QCM-D

Mikrowaga kwarcowa z pomiarami dyssypacji została przeprowadzona na instrumencie E4-QCM-D firmy Biolin Scientific Ltd.. Czujniki kwarcowe pokryte złotem były używane po czyszczeniu w roztworze H2O2:NH3:H2O (1:5:5) przez 15 min, a następnie po czyszczeniu UV-Ozone przez 10 min.

Złote czujniki były umieszczone w modułach komórek ciekłych. 1 mg/mL BSA rozpuszczono w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl), a pH roztworu ustawiono na pH 7,0 i 4,5. Osobno dostosowano pH roztworu soli do 7,0 i 4,5. Przygotowane roztwory przepuszczano przez moduły ogniw cieczowych za pomocą pompy perystaltycznej. Zmiany częstotliwości rezonansowej czujnika kwarcowego (F) i rozproszenia (D) w odniesieniu do częstotliwości podstawowej 5 MHz i sześciu różnych nieparzystych overtonów (1, 3, 5, 7, 9, i 13) były jednocześnie monitorowane.

Najpierw do komory cieczowej wpompowano roztwór soli fizjologicznej i pozwolono mu się zrównoważyć w celu wygenerowania stabilnej linii podstawowej. Następnie, BSA w roztworze soli fizjologicznej przepuszczono przez komórkę i pozwolono cząsteczkom BSA adsorbować się na złotym interfejsie. Następnie przepompowywano sól fizjologiczną, aby usunąć wszelkie nieprzyłączone cząsteczki BSA. Cykle płukania solami o różnym pH i wodą były następujące:

Uzyskane zmiany częstotliwości rezonansowej ΔF i rozproszenia ΔD zostały dopasowane przez model Sauerbreya przy użyciu oprogramowania Dfind.

Pomiary DLS

Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS) na BSA zdyspergowanym w roztworze soli o różnym pH (4.5 i 7.0) mierzono na analizatorze wielkości cząstek DLS (Brookhaven Nanobrook Omni). Zastosowano źródło 40 mW (640 nm) czerwonego lasera półprzewodnikowego o regulowanej temperaturze. Pomiary wykonywano trzykrotnie i uśredniano. Wszystkie pomiary przeprowadzono w temperaturze pokojowej (22°C).

Pomiary kąta kontaktu

Kąt kontaktu na złocie i BSA zaadsorbowanym przy różnym pH na złotym interfejsie mierzono przy użyciu setupu OCA 35 DataPhysics Instruments GmbH, Niemcy. Pomiary przeprowadzono bezpośrednio na powierzchni czujnika wyjętego po pomiarze z zestawu QCM. Wszystkie pomiary wykonywano w temperaturze pokojowej (22°C). Wykonano minimum pięć pomiarów kąta kontaktowego na powierzchni czujnika i uśredniono je.

Mikroskop sił atomowych (AFM)

Pomiary w mikroskopie sił atomowych przeprowadzono w trybie stukającym za pomocą urządzenia JPK Nanowizard III AFM. Wybrane do obrazowania wsporniki (AC160TS-R3) miały częstotliwość nominalną 300 kHz i stałą sprężystości 26 N/m. Obrazowaniu poddano goły złoty interfejs oraz zaadsorbowaną warstwę BSA o pH 4.5 na złotym interfejsie. Obrazy były wykonywane bezpośrednio na powierzchni czujnika wyjętego po pomiarze z układu QCM. Wszystkie pomiary przeprowadzono w temperaturze pokojowej (22°C).

Wyniki

Odwracalne, reagujące na pH zjawisko sorpcji wody przez cząsteczki BSA zaadsorbowane na granicy faz ciało stałe-ciecz badane jest metodą QCM-D z cyklami płukania roztworu soli o pH 7,0 i 4,5. Złoto zostało wybrane jako stały interfejs, ponieważ jego hydrofobowość ukierunkowuje adsorpcję BSA (Lori i Hanawa, 2004; Phan et al., 2015; Ozboyaci et al., 2016). Warstwy BSA adsorbowane przy różnych wartościach pH są płukane naprzemiennymi cyklami roztworów soli o pH 4,5 i 7,0. Dodatkowo przeprowadzono płukanie czystą wodą Milli-Q, aby ocenić, jaki wpływ na zaadsorbowaną warstwę BSA ma siła jonowa.

Rysunek 1 (górny) przedstawia zmianę częstotliwości (F5 i F7) dla cząsteczek BSA zaadsorbowanych przy pH 7,0 z roztworu BSA/sól fizjologiczna, po czym przeprowadzono płukanie oryginalnym roztworem soli fizjologicznej (pH 7). Kolejny cykl płukania przeprowadzono roztworem soli o pH 4,5. Następnie następowały naprzemienne cykle roztworów soli o pH 4,5 i 7.

Na rysunku 1, po początkowej stabilnej linii podstawowej, zaobserwowano nagły spadek F, co wskazuje na adsorpcję cząsteczek BSA na granicy faz złoto-ciecz. F zmniejszyło się do ΔF = -35.5 i ustabilizowało się. Po spłukaniu solą fizjologiczną (pH 7), F wzrosło z ΔF = -35,5 do ΔF = -34,0, co świadczy o usunięciu z powierzchni niezaadsorbowanych cząsteczek BSA. Po spłukaniu solą fizjologiczną (pH 4,5), F dalej wzrosło do ΔF = -30,0, co wskazuje na dodatkowy ubytek masy z powierzchni czujnika. Co zaskakujące, kolejne cykle płukania solą fizjologiczną (pH 7,0) spowodowały zmniejszenie F do ΔF = -34,0, co oznacza wzrost masy na powierzchni czujnika w wyniku absorpcji cząsteczek wody w warstwie BSA. Kolejne cykle płukania solą fizjologiczną następują po tej samej cyklicznej zmianie masy na powierzchni złota.

W drugim eksperymencie, podobnie jak w pierwszym, po adsorpcji cząsteczek BSA przy pH 4,5 następowały cykle płukania solą fizjologiczną przy różnym pH (Rysunek 1: Dół). Zaadsorbowane cząsteczki BSA odpowiadają spadkowi F do wartości ΔF = -38,5. Płukanie solą fizjologiczną (pH 4,5) usuwa niezaadsorbowane BSA (ΔF = -38,0).

Ponowne płukanie solą fizjologiczną (pH 7,0) powoduje dalszy wzrost masy warstwy na powierzchni złota, co odpowiada spadkowi F do ΔF = -43. Wzrost masy spowodowany jest absorpcją cząsteczek wody w warstwie BSA. Późniejsze płukanie solą fizjologiczną (pH 4,5) desorbuje cząsteczki wody i przywraca wartość F do ΔF = -37. Każdy cykl płukania adsorbuje i desorbuje taką samą ilość cząsteczek wody.

W tym samym eksperymencie badano wpływ siły jonowej na zaadsorbowaną warstwę BSA poprzez płukanie warstwy czystą wodą. Rysunek 1 przedstawia adsorpcję BSA przy pH 7,0 i 4,5 po cyklach płukania solą fizjologiczną o różnym pH oraz czystą wodą Milli-Q.

W obu przypadkach płukanie wodą zwiększa wartość w ΔF = -29,2 (BSA adsorbowany przy pH 4,5) i -26,5 (BSA adsorbowany przy pH 7,0). Wskazuje to, że płukanie wodą powoduje dalsze zmniejszenie masy, co odpowiada dalszej desorpcji cząsteczek wody z interfejsu. Każdy cykl płukania podtrzymuje to samo zachowanie w zmianie masy, która jest spowodowana sorpcją wody w warstwie BSA.

Co ciekawe, we wszystkich eksperymentach, naprzemienne cykle płukania solą fizjologiczną przy pH 4,5 i 7,0 wykazują odwracalną sorpcję cząsteczek wody w obrębie zaadsorbowanej warstwy BSA. Płukanie warstwy BSA solą fizjologiczną o pH 7,0 powoduje adsorpcję cząsteczek wody w strukturze warstwy BSA, co zwiększa masę interfejsu ciało stałe-ciecz. Z kolei płukanie warstwy BSA solą fizjologiczną o pH 4,5 desorbuje cząsteczki wody z warstwy BSA, co zmniejsza masę interfejsu. Zmierzona w pełni odwracalna sorpcja wody wskazuje, że cząsteczki BSA nie desorbują podczas płukania, a ich pokrycie powierzchni pozostaje identyczne; zmienia się jedynie liczba cząsteczek wody w interfazie.

Zjawisko sorpcji wody podczas płukania solą fizjologiczną (przy różnym pH) zachodzi wyłącznie dzięki zaadsorbowanej warstwie BSA i zostało potwierdzone w oddzielnym eksperymencie płukania solą fizjologiczną gołego złotego czujnika (Materiał uzupełniający S1). Roztwór soli (o pH 4,5) utrzymywał stabilną linię podstawową częstotliwości gołego złotego czujnika. Następnie, złoty interfejs został przepłukany alternatywnym cyklem płukania solą fizjologiczną o pH 7.0 i 4.5 (Supplementary Material S1). Wyniki wyraźnie pokazują, że alternatywne płukanie solą fizjologiczną o różnym pH nie ma wpływu na częstotliwość pracy złotego czujnika. Dlatego tylko zaadsorbowana warstwa BSA na złocie wykazuje zmianę częstotliwości na cyklach płukania solą fizjologiczną przy różnych wartościach pH.

Masa zaadsorbowana, pokrycie powierzchni i grubość zaadsorbowanej warstwy BSA są wydobywane przez dopasowanie modelu Sauerbreya do danych QCM. Model ten jest używany do dopasowania sztywnej warstwy, gdzie wartość dyssypacji jest mniejsza niż 2, jak zaobserwowano we wszystkich naszych eksperymentach (Materiał Uzupełniający S2). Równanie Sauerbreya jest dane przez Δm=-CΔfn, gdzie, C = 17.7 ng/Hz.cm2 jest stałą dla kryształu kwarcu pokrytego złotem 5 MHz, n jest overtonem, Δm jest zaadsorbowaną masą, a Δf jest zmianą częstotliwości.

Cząsteczki BSA adsorbowały się do pokrycia masowego 6.3 mg/m2 (grubość 5.6 nm) przy pH 7.0 (Rysunek 2A). Płukanie wstępnie zaadsorbowanej warstwy BSA solą fizjologiczną (pH 4,5) zmniejszyło pokrycie masowe do 5,6 mg/m2 , a jej grubość do 4,9 nm (tab. 1), co wynika z uwolnienia cząsteczek wody ze struktury zaadsorbowanej warstwy BSA. Dalsze płukanie solą fizjologiczną (o pH 7,0) powoduje ponowne zaadsorbowanie cząsteczek wody w tej samej ilości. Różnica zmiany masy wynosi Δm = 0,7 mg/m2.

Podobnie jak na rysunku 2B, płukanie wstępnie zaadsorbowanej warstwy BSA przy pH 4,5 solą fizjologiczną (przy pH 7,0) zwiększa zaadsorbowaną masę z 6,4 mg/m2 do 7,4 mg/m2 i grubość z 6,2 do 6,9 nm; jest to spowodowane absorpcją cząsteczek wody w warstwie BSA. Cykl płukania solą fizjologiczną przy różnych wartościach pH utrzymywał różnicę zmiany masy Δm = 1,0 mg/m2, która jest 1,4 razy większa niż zmiana masy przy pH 7,0 (0,7 mg/m2).

Średnią liczbę cząsteczek wody zaadsorbowanych/desorbowanych w warstwie BSA podczas cyklu płukania solą fizjologiczną obliczono na podstawie różnicy masy zaadsorbowanej przy różnym pH (Materiał uzupełniający S3). Warstwa BSA adsorbowana przy pH 4,5 adsorbuje/desorbuje 3,3 × 1019 cząsteczek wody podczas cykli płukania, co odpowiada 570 cząsteczkom wody/cząsteczkę BSA (Tabela 1). Natomiast warstwa BSA zaadsorbowana przy pH 7,0, adsorbuje/desorbuje 2,3 × 1019 cząsteczek wody, czyli 450 cząsteczek wody/cząsteczkę BSA, podczas odwracalnego cyklu płukania solą fizjologiczną.

Pomiary dynamicznego rozpraszania światła (DLS) wyjaśniają stan zagregowany i niezagregowany BSA w soli fizjologicznej przy pH 4,5 i pH 7,0 (Rysunek 3). Przy pH 4,5, DLS ujawnia agregację cząsteczek BSA i wykazuje wiele rozkładów wielkości: 5 nm, 10 nm, 20 nm i 50 nm. Natomiast w pH 7.0 cząsteczki BSA nie agregują, ze względu na odpychanie elektrostatyczne, a ich rozkład wielkości wynosi 5 i 10 nm. Wielkość 5 i 10 nm uwodnionego BSA jest porównywalna z wielkością i kształtem pojedynczych cząsteczek BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg i in., 1955; Wright i Thompson, 1975).

Obrazy mikroskopu sił atomowych potwierdzają adsorpcję cząsteczki BSA na interfejsie złota (Rysunek 4). Obrazy te pokazują różnice w morfologii powierzchni gołego złota (Rysunki 4a,b) i BSA zaadsorbowanego na interfejsie złota przy pH 4,5 (Rysunki 4c,d). Po porównaniu powiększonych obrazów gołego złota (rysunek 4b) i powierzchni zaadsorbowanej BSA (rysunek 4d) różnice między powierzchniami są zauważalne. Mimo, że obie powierzchnie mają tworzące je cząsteczki, definicja, a więc i obrazowany materiał jest inny. Cząstki na powierzchni gołego złota są bardziej zdefiniowane (np. ostrzejsze granice między kształtami), co wskazuje na twardszy materiał w porównaniu z powierzchnią pokrytą BSA. Złoto pokryte BSA wykazuje obecność dodatkowych agregatów cząsteczek BSA. Powiększony obraz AFM złota pokrytego BSA (rysunek 4d) pokazuje, że wymiar poprzeczny zagregowanych cząsteczek BSA waha się od 30 do 100 nm z wysokością w zakresie 5-15 nm.

Kąt kontaktu utworzony przez krople wody na dwóch powierzchniach: złota i BSA zaadsorbowanego na złocie został zmierzony w celu wyjaśnienia zwilżalności (Rysunek 5). Złoty czujnik jest hydrofilowy z kątem kontaktowym 66°. Jednakże warstwa BSA zaadsorbowana przy pH 4,5 staje się bardziej hydrofilowa, ponieważ kąt kontaktu z wodą zmniejszył się do 60°, a następnie do 55° dla warstwy BSA zaadsorbowanej przy pH 7,0. Podobną obserwację odnotowano dla warstw BSA adsorbowanych na powierzchni krzemu, gdy kąt kontaktu z wodą zmniejszał się z 57° (przy pH 4,5) do 54° (przy pH 7,0) (Jachimska i in., 2016). Zmiana kąta kontaktowego i grubości warstwy dla BSA adsorbowanego przy różnym pH wskazuje na różnice strukturalne i topograficzne podczas procesu adsorpcji na interfejsie złota.

Dyskusja

Punkt izoelektryczny BSA znajduje się pomiędzy pH 4,5-4,8; jest to pH, przy którym ładunek netto cząsteczki staje się zerowy. W pobliżu punktu izoelektrycznego, cząsteczki BSA mają mniejsze międzycząsteczkowe odpychanie elektrostatyczne. Wysoka siła jonowa soli fizjologicznej (0,15 M) również odgrywa rolę w ekranowaniu ładunków i utrudnianiu oddziaływań elektrostatycznych. Dlatego cząsteczki BSA agregują się w zawiesinie BSA/sól fizjologiczna. Pomiary DLS (Rysunek 3A) potwierdzają obecność agregatów BSA o rozmiarach do 60 nm w zawiesinie BSA/solanka przy pH 4,5.

Podczas adsorpcji BSA (przy pH 4,5) na interfejsie złota nie oczekuje się elektrostatycznego przyciągania BSA w kierunku interfejsu złota. Jednak słaby ładunek dodatni z globularnego białka BSA może zapewnić wystarczający dryf do adsorpcji na interfejsie (Su i in., 1998a; Jachimska i in., 2016). Wiele artykułów wcześniej donosiło, że adsorpcja BSA i podobnych białek w pobliżu punktu izoelektrycznego jest napędzana przez oddziaływania hydrofobowe, które przeważają nad oddziaływaniami elektrostatycznymi (Uyen i in., 1990; Tilton i in., 1991; Figueira i Jones, 2008; Norde, 2008; Jeyachandran i in., 2009; Rabe i in., 2011; Huang i in., 2017; Xu i in., 2018; Attwood i in., 2019). Pomiary kąta kontaktowego (Rysunek 5) pokazują, że interfejs gołego złota jest mniej hydrofobowy, a albumina wiąże się ze złotem poprzez oddziaływania hydrofobowe (Norde i Giacomelli, 2000; Figueira i Jones, 2008). Ponieważ odpychanie między cząsteczkami BSA jest ekranowane, uwodnione cząsteczki BSA adsorbują się w dużych ilościach (6,4 mg/m2) jako agregaty i z wieloma punktami kontaktowymi na złotym interfejsie (Rysunek 6A). Obraz AFM (rys. 4c,d) potwierdza adsorpcję i agregację cząsteczek BSA na powierzchni złota. Obrazy AFM ujawniają boczne wymiary agregatów w zakresie od 30 do 100 nm z wysokością w zakresie od 5 do 15 nm. Potwierdza to, że cząsteczki BSA adsorbują się jako kombinacja zarówno stojącej jak i płaskiej konformacji.

Przy pH 7,0 cząsteczki BSA są naładowane ujemnie. Powoduje to odpychanie elektrostatyczne pomiędzy cząsteczkami BSA, co utrudnia aglomerację BSA w roztworze. Pomiary DLS pokazują dystrybucję niezagregowanych cząsteczek BSA o wielkości 5 i 10 nm (Rysunek 3B). Rozmiary te są porównywalne z wymiarami pojedynczych cząsteczek BSA (14 nm × 4 nm × 4 nm) (Anderegg i in., 1955; Wright i Thompson, 1975). Podczas adsorpcji BSA na złocie, kombinacja zarówno odpychania elektrostatycznego, jak i oddziaływań hydrofobowych tworzy warstwę BSA na interfejsie. Silne boczne odpychanie międzycząsteczkowe pomiędzy zaadsorbowanymi cząsteczkami BSA zmniejsza pojemność adsorpcyjną BSA (5,6 mg/m2) na interfejsie. Dlatego cząsteczki BSA adsorbują się jako pojedyncze cząsteczki (nie agregaty) i tworzą monowarstwę na złotym interfejsie (rysunek 6A).

W eksperymentach QCM-D (rysunek 1), wstępnie uwodnione cząsteczki BSA są adsorbowane na interfejsie. Po przepłukaniu alternatywną solą fizjologiczną o różnym pH, warstwa BSA dalej adsorbuje/desorbuje cząsteczki wody. BSA zaadsorbowany przy pH 4,5 zatrzymuje i uwalnia więcej cząsteczek wody (1,0 mg/m2) w porównaniu z cząsteczkami BSA zaadsorbowanymi przy pH 7,0 (0,7 mg/m2). Powodem jest to, że ilość BSA zaadsorbowanego przy pH 4,5 (6,4 mg/m2) jest większa niż przy pH 7,0 (5,6 mg/m2).

Obliczona sucha masa (nie uwodniona) cząsteczek BSA zaadsorbowanych dla całkowitego pokrycia powierzchni złotego czujnika wynosi około 2 mg/m2 (Materiał uzupełniający S3). Obliczona sucha masa jest porównywalna z podawaną w literaturze (Jachimska i in., 2016). Kiedy sucha cząsteczka BSA ulega uwodnieniu, jej grupy hydrofilowe gwałtownie wiążą się z wodą. Wiązanie to wynika z dipolarnej struktury wody oddziałującej z grupami polarnymi w BSA. W uwodnionym BSA niektóre cząsteczki wody są związane silnie, podczas gdy inne cząsteczki wody są związane luźno lub są po prostu uwięzione pomiędzy strukturą pętli BSA. Ilość wody hydratyzującej warstwę BSA zwiększa ułamek masy adsorbowanej na granicy faz. W cyklu płukania solą fizjologiczną przy różnych wartościach pH dochodzi do redystrybucji ładunków na zaadsorbowanej warstwie BSA. Ta redystrybucja ładunków tworzy gradient pomiędzy zaadsorbowaną warstwą BSA a roztworem objętościowym. Gradient działa jako siła napędowa do uwięzienia i uwolnienia luźno związanych cząsteczek wody z warstwy BSA.

Grubość warstwy BSA jest oceniana przez dopasowanie modelu Sauerbreya do danych QCM-D (Rysunek 2). Uwodniona warstwa BSA zaadsorbowana przy pH 4,5 i spłukana solą fizjologiczną (pH 7,0) daje większą grubość 6,9 nm (rysunek 6B). Duża ilość zaadsorbowanych cząsteczek BSA (6,4 mg/m2) zatrzymuje wiele cząsteczek wody, co powoduje pęcznienie warstwy BSA. Spłukanie tej samej warstwy solą fizjologiczną (pH 4,5) powoduje zmniejszenie grubości warstwy do 6,4 nm, co jest spowodowane uwolnieniem cząsteczek wody z warstwy. Podobne zjawisko obserwuje się dla cząsteczek BSA zaadsorbowanych w pH 7.0. Jednak grubość warstwy BSA jest cieńsza niż dla warstwy BSA adsorbowanej przy pH 4,5 (Rysunek 6B).

Ponadto, zaadsorbowana warstwa BSA przy obu wartościach pH pozostaje sztywna i nieodwracalnie związana podczas cykli płukania solą fizjologiczną. Podczas zmian pH zachodzi jedynie sorpcja cząsteczek wody. Sztywność i nieodwracalność zaadsorbowanej warstwy BSA jest spowodowana dużym rozmiarem i wysoką masą cząsteczkową BSA. Cząsteczka BSA tworzy wiele punktów kontaktowych na granicy faz złoto-ciecz poprzez oddziaływania elektrostatyczne i hydrofobowe, które zapobiegają desorpcji cząsteczek BSA z granicy faz.

Warstwa BSA nie odrywa się od granicy faz złota nawet przy zmianach siły jonowej roztworu (płukanie wodą dejonizowaną). Płukanie wodą desorbuje jedynie więcej cząsteczek wody z warstwy BSA, a masa na powierzchni czujnika ulega dalszemu zmniejszeniu (Rysunek 2). Zmiana siły jonowej uwodnionego BSA za pomocą czystej wody powoduje uwolnienie większej ilości cząsteczek wody z warstwy. Warstwa BSA kurczy się do grubości 4,8 nm (gdy jest adsorbowana przy pH 4,5) i 4,3 nm (gdy jest adsorbowana przy pH 7,0), jak pokazano na rysunku 6B. Kontynuowanie cykli płukania solą fizjologiczną powoduje to samo odwracalne zjawisko sorpcji wody.

Wniosek

Albumina surowicy bydlęcej w roztworze soli fizjologicznej (0,9% NaCl) była adsorbowana na granicy faz złoto-ciecz przy pH 7,0 i 4,5. Dynamiczny proces mierzono metodą QCM-D i potwierdzono pomiarami AFM, DLS i kąta kontaktu. Odwracalne, szybkie i zależne od pH zjawisko sorpcji wody zaobserwowano dla zaadsorbowanej warstwy BSA po wykonaniu cykli płukania solą fizjologiczną o pH 4,5 i 7,0. Cząsteczki wody hydratyzują warstwę BSA przy pH 7,0 i dehydratyzują ją przy pH 4,5. Warstwa BSA zaadsorbowana przy pH 4,5 jest uwodniona przez 1,4 razy więcej cząsteczek wody niż warstwa BSA zaadsorbowana przy pH 7,0. Zjawisko to tłumaczy się różnymi konformacjami przyjmowanymi przez cząsteczki BSA adsorbowane przy różnym pH. W pobliżu punktu izoelektrycznego przy pH 4,5 cząsteczki BSA ulegają neutralizacji i adsorbują się w postaci agregatów w dużych ilościach: 6,4 mg/m2. Przy pH 7.0, cząsteczki BSA stają się naładowane (odpychanie elektrostatyczne) i adsorbują się jako warstwa pojedynczych cząsteczek w ilości 5,6 mg/m2. Warstwa zagregowanych cząsteczek BSA (przy pH 4,5) zaadsorbowanych na powierzchni złota zatrzymuje więcej cząsteczek wody (570 cząsteczek wody/BSA) niż warstwa pojedynczych cząsteczek BSA (przy pH 7,0), które zatrzymują 450 cząsteczek wody/BSA. Zmiana siły jonowej poprzez spłukanie warstwy BSA czystą wodą powoduje jedynie desorpcję większej ilości wody ze struktury zaadsorbowanej warstwy. We wszystkich przypadkach, warstwa BSA jest sztywna i nieodwracalnie zaadsorbowana na złotym interfejsie i tylko cząsteczki wody adsorbują się/desorbują podczas cyklu płukania. Zaobserwowane zjawisko jest ważne dla fundamentalnego zrozumienia oraz dla konstruowania nowych urządzeń biodiagnostycznych i wytrzymałych czujników.

Oświadczenie o dostępności danych

Surowe dane potwierdzające wnioski zawarte w tym artykule zostaną udostępnione przez autorów, bez zbędnych zastrzeżeń, każdemu wykwalifikowanemu badaczowi.

Wkład autorów

VR, CB i BY przeprowadzili eksperymenty. VR i GG przeprowadzili analizę danych i napisali manuskrypt.

Funding

Ta praca była wspierana przez Australian Research Council (ARC), Australian paper, Norske Skog, Orora i Visy poprzez grant Industry Transformation Research Hub IH170100020.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Materiały uzupełniające

.