Frontiers in Endocrinology

Introduction

Cardiovascular disease (CVD) is the most common and severe diabetes complication, leading to substantial death, and disability among patients with type 2 diabetes mellitus . U pacjentów z T2DM ryzyko wystąpienia CVD jest dwa do trzech razy większe niż u osób bez T2DM (3, 4). W porównaniu z tradycyjnymi czynnikami, takimi jak ciśnienie krwi, lipidy i wskaźnik masy ciała, endogenne związki małocząsteczkowe wykrywane metodami metabolomicznymi z większym prawdopodobieństwem odzwierciedlają stan komórek związany z łącznym wpływem odżywiania komórek, leków, zanieczyszczeń środowiska i innych czynników zewnętrznych (7). Metabolity acylkarnityny to grupa substancji estrowych powstających w wyniku połączenia wolnej karnityny i acylo-koenzymu A (acyl-CoA) produkowanego przez kwasy tłuszczowe (8). W badaniu kohortowym stwierdzono, że stężenie niektórych acylokarnityn w osoczu jest wyższe u chorych na T2DM niż w populacji bez T2DM (9). Ponadto stężenie acylkarnityn i mitochondrialnego 4-hydroksynonenalu w tkance sercowej myszy karmionych fruktozą było wyższe niż w grupie kontrolnej (10). Ponieważ 4-hydroksynonenal jest wytwarzany w procesie peroksydacji lipidów, zwiększona ilość 4-hydroksynonenalu może sugerować wysoki poziom stresu oksydacyjnego (11). Jednak tylko w kilku badaniach klinicznych badano związek między acylkarnitynami a CVD w T2DM. Dlatego też przeprowadziliśmy badanie przekrojowe w szpitalu, aby ocenić związek między metabolitami acylkarnityny a CVD u chińskich pacjentów z T2DM.

Materiały i metody

Metoda badania i populacja

W tym badaniu wykorzystano projekt badania przekrojowego w celu zbadania związku między acylkarnitynami a CVD w T2DM. Pobraliśmy elektroniczną dokumentację medyczną 2 554 pacjentów z dostępnymi danymi dotyczącymi metabolitów z głównej elektronicznej bazy danych Liaoning Medical University First Affiliated Hospital (LMUFAH), Jinzhou, Chiny, którzy zostali przyjęci do szpitala od maja 2015 do sierpnia 2016 roku (12).

Kryteria włączenia określono następująco: (1) wiek ≥ 18 lat; (2) rozpoznano T2DM; oraz (3) dostępne były metabolity acylkarnityny: acetylokarnityna (C2), propionylokarnityna (C3), butyrylokarnityna (C4), hydroksylobutyrylokarnityna (C4-OH), sukcynylokarnityna (C4DC), izowalerylokarnityna (C5), 3-hydroksyizowalerylokarnityna (C5-OH), glutarylokarnityna (C5DC), tiglylokarnityna (C5:1), heksanoilokarnityna (C6), oktanoilokarnityna (C8), dekanoilokarnityna (C10), lauroilokarnityna (C12), mirystyretylokarnityna (C14), 3-hydroksylo-tetradekanoilokarnityna (C14-OH), tetradekanoilokarbityna (C14DC), tetradekenoilokarnityna (C14:1), palmitoilokarnityna (C16), 3-hydroksypalmitoilokarnityna (C16-OH), 3-hydroksypalmitoilokarnityna (C16:1-OH), oktadekanoilokarnityna (C18), karnityna arachidynowa (C20), karnityna behenowa (C22), karnityna tetrakozaniczna (C24), karnityna heksakozaniczna (C26). Kryteriami wyłączenia z badania były: (1) rozpoznanie cukrzycy typu 1; (2) ciąża. Do analizy włączono łącznie 741 chorych na T2DM, którzy spełnili kryteria włączenia i nie mieli kryteriów wyłączenia.

Zgodę na przeprowadzenie badania uzyskano od Komisji Etycznej ds. Badań Klinicznych LMUFAH, a świadoma zgoda została uchylona przez Komisję Etyczną ds. Badań Klinicznych LMUFAH ze względu na retrospektywny charakter badania przekrojowego.

Gromadzenie danych i definicja kliniczna

Dane demograficzne i kliniczne zostały pobrane z głównej elektronicznej bazy danych szpitala, w tym wiek, płeć, czas trwania cukrzycy, powikłania cukrzycy, stosowanie leków (leki przeciwcukrzycowe, leki przeciwcukrzycowe, leki przeciwnadciśnieniowe i leki obniżające stężenie lipidów), BMI, skurczowe ciśnienie krwi (SBP), rozkurczowe ciśnienie krwi (DBP), hemoglobina glikowana (HbA1c), triglicerydy (TG), cholesterol lipoproteinowy o małej gęstości (LDL-C) i cholesterol lipoproteinowy o dużej gęstości (HDL-C).

CVD zdefiniowano jako wcześniejszą chorobę wieńcową (CAD), niewydolność serca (HF) lub udar mózgu. BMI obliczano jako masę ciała w kilogramach podzieloną przez podniesioną do kwadratu wysokość ciała w metrach, wyrażoną w kg/m2. Nadwagę definiowano jako BMI ≥ 24,0 kg/m2, ale <28,0 kg/m2, a otyłość jako BMI ≥ 28,0 kg/m2, zgodnie z zaleceniami Chińskiego Stowarzyszenia Diabetyków dotyczącymi stosowania w Chinach (13). Kalibrowany sfigmomanometr rtęciowy służył do pomiaru SBP i DBP po odpoczynku pacjentów przez 5-10 min. Od pacjentów z T2DM pobierano krew na noc (co najmniej 8 h na czczo). Pomiary HbA1c, TG, HDL-C i LDL-C przeprowadzono w laboratorium biochemicznym LMUFAH. W zależności od liczby atomów węgla w łańcuchu grupy acylowej acylkarnityny podzielono na trzy grupy: acylkarnityny krótkołańcuchowe, w tym C2, C3, C4, C4-OH, C5, C5-OH, C5DC, C5:1, i C6; średniołańcuchowe acylkarnityny, w tym C8, C10, C12, C14, C14-OH, C14DC, i C14:1; długołańcuchowe acylkarnityny, w tym C16, C16-OH, C16:1-OH, C18, C20, C22, C24, i C26 (14).

Kwantyfikacja acylkarnityny

Metabolomiczna metoda oznaczania została opisana w poprzednich badaniach (15). W skrócie, próbki suchej krwi pobrane przez nakłucie palca po 8 h na czczo zostały wykorzystane do badania metabolomicznego. Metabolomika w suchych plamkach krwi była mierzona przy użyciu technologii spektrometrii mas (MS). Analiza metabolomiczna MS została przeprowadzona przy użyciu systemu AB Sciex 4000 QTrap (AB Sciex, Framingham, MA, USA). Źródłem jonizacji było źródło jonizacji Electrospray. Napięcie rozpylania jonów wynosiło 4,5 kV. Do skanowania analitów zastosowano tryb pozytywny. Fazą ruchomą, która przenosiła badany składnik był 80% wodny roztwór acetonitrylu. Do bezwzględnej kwantyfikacji stosowano znakowane izotopami standardy wewnętrzne acylkarnityny z Cambridge Isotope Laboratories (Tewksbury, MA, USA).

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu Statistical Analysis System Release 9.4 (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Wartość P < 0,05 uznawano za istotną statystycznie. Dane kategoryczne między dwiema grupami porównywano testem Chi-kwadrat lub dokładnym testem Fishera, gdzie właściwe, i wyrażono jako ilość i procent. Do badania normalności stosowano wykres P-P lub Q-Q, gdy zmienną analizowaną była zmienna ciągła. Zmienne ciągłe zgodne z rozkładem normalnym zostały przedstawione jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) i porównane testem t-Studenta, lub jako mediana z zakresem międzykwartylowym (IQR) w przeciwnym razie i porównane testem Wilcoxona Signed Rank.

Aby poradzić sobie z wielokrotnymi porównaniami, analiza czynnikowa została użyta do zmniejszenia dużej liczby skorelowanych acylkarnityn do mniejszej liczby nieskorelowanych czynników. Testy sferyczności Kaisera-Meyera-Olkina (KMO) i Bartletta zostały użyte do oceny przydatności do analizy czynnikowej (16). Współczynnik KMO < 0,5 uznano za nieakceptowalny, natomiast wartości w okolicach 0,8 uznano za zasługujące na uznanie. Analiza składowych głównych została wykorzystana do wyodrębnienia czynników i uzyskania odpowiedniej macierzy ładunków czynnikowych. Rotacja Varimax rotowała początkową macierz ładunków czynnikowych w celu uzyskania rozwiązania, które jest bardziej zwięzłe i łatwiejsze do interpretacji niż początkowa ekstrakcja czynnikowa (17). Poszczególne acylkarnityny, które miały maksymalne ładunki dla danego czynnika, zostały użyte jako istotne komponenty czynnika. Wykres Scree jest wykresem liniowym wartości własnych czynników w analizie czynnikowej (18). Oś pozioma wykresu Scree to liczba czynników, a oś pionowa to wartość własna czynników. Liczba czynników acylkarnityny została określona przez eigenvalue, communalities i scree plot: eigenvalue > 1, communalities ≥ 50%, liczba czynników zlokalizowanych na stromym zboczu scree plot.

Multivariable binary logistic regression was used to estimate odds ratios (OR) and their 95% confidence intervals (CI) of the extracted acylcarnitine factors for CVD in T2DM. Zastosowano ustrukturyzowany schemat dopasowania w celu kontroli efektów zakłócających zmiennych demograficznych i klinicznych. W szczególności model 1 był modelem jednozmiennym; model 2 był skorygowany o wszelkie inne czynniki acylkarnitynowe; model 3 był dalej skorygowany o wiek, płeć, BMI, czas trwania cukrzycy, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C, HDL-C; a model 4 dalej skorygowany o stosowanie leków, w tym leków przeciwcukrzycowych, leków przeciwdiabetycznych i leków obniżających stężenie lipidów, oprócz zmiennych skorygowanych w modelu 3.

Wyniki

Opis badanych

Średni wiek badanych pacjentów wynosił 57,9 (SD: 14,1) lat, a mediana czasu trwania cukrzycy wynosiła 5 (IQR: 0-10) lat. Spośród nich 391 (52,8%) było mężczyznami, a 288 (38,9%) miało CVD (87 z samą CAD, 109 z samym udarem, 6 z samą HF, 51 z zarówno CAD, jak i udarem, 53 z zarówno CAD, jak i HF, 18 z zarówno udarem, jak i HF oraz 18 ze wszystkimi) (Tabela 1, Arkusz danych 1).

W porównaniu z grupą bez CVD chorzy na T2DM z CVD częściej byli starsi i mieli dłuższy czas trwania cukrzycy, wyższe SBP, niższe HbA1c i rzadziej stosowali insulinę. Chorzy ci wykazywali tendencję do niższego LDL-C, niższego odsetka stosowania leków przeciwcukrzycowych, wyższego odsetka stosowania leków obniżających stężenie lipidów i leków przeciwnadciśnieniowych. Nie stwierdzono istotnych różnic w zakresie płci, BMI, DBP, HDL-C i TG pomiędzy obiema grupami. Stężenia C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14-OH i C14:1 były wyższe, natomiast C5-OH i C24 niższe u pacjentów z CVD niż u ich odpowiedników bez CVD. Pozostałe acylkarnityny były podobne w obu grupach (Tabela 2).

Extracted Factors of Acylcarnitines

Results of the factor analysis were acceptable as suggested by a high KMO coefficient of 0.898 and a highly significant P-value of Bartlett sphericity test of <0.0001. Czynniki 1-5 miały wartości własne większe niż 1 i znajdowały się na stromym zboczu wykresu piarowego (rysunek 1). Wyodrębniliśmy więc pięć czynników, a ładunki acylkarnityn na pięciu czynnikach po rotacji varimax przedstawiono w tabeli 3. Czynnik 1 obejmował C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8 i C14DC; czynnik 2 obejmował C10, C12, C14, C14-OH, C14:1 i C16-OH; czynnik 3 obejmował C16, C16:1-OH, C18, C20 i C3; czynnik 4 obejmował C22, C24 i C26; czynnik 5 obejmował C4DC, C5, C5-OH i C5:1. Te pięć czynników wyjaśniło 65,9% całkowitej wariancji.

Associations Between Extracted Factors and CVD Risk in T2DM

Factors 1, 2, and 4 were all positively associated with CVD risk in T2DM in univariate analysis. Po skorygowaniu o inne czynniki te pozytywne związki były nadal istotne (model 2). Jednakże tylko czynnik 1 (OR: 1,42, 95% CI: 1,03-1,95) i czynnik 2 (OR: 1,24, 95% CI: 1,03-1,49) były nadal dodatnio związane z ryzykiem CVD po dalszym dostosowaniu do wieku, płci, BMI, czasu trwania cukrzycy, HbA1c, SBP, DBP, TG, LDL-C i HDL-C. Po ostatecznym dostosowaniu do stosowania leków, wielkość efektu czynnika 1 (OR: 1,45, 95% CI: 1,03-2,03) i czynnika 2 (OR: 1,23, 95% CI: 1,02-1,50) były w dużej mierze niezmienione (Tabela 4).

Sensitivity Analysis

Po imputacji średniej i wielokrotnej imputacji brakujących wartości w HbA1c (n = 200), wielkości efektów czynników 1 i 2 dla ryzyka CVD w T2DM pozostały stabilne i istotne w analizach jedno- i wielozmiennowych (Tabela S1).

Dyskusja

W badaniu tym wykazano, że niektóre acylkarnityny, tj, C2, C4, C4-OH, C5DC, C6, C8 i C14DC w czynniku 1 oraz C10, C12, C14:1, C14, C14-OH i C16-OH w czynniku 2, były związane z ryzykiem CVD w T2DM, a asocjacje te były niezależne od innych czynników acylkarnitynowych i tradycyjnych czynników ryzyka CVD. Te metabolity acylkarnityny wyodrębnione w czynniku 1 i 2 były głównie krótko- i średniołańcuchowymi acyl-karnitynami.

Scieżka zaopatrzenia w energię oksydacji długołańcuchowych kwasów tłuszczowych u człowieka jest następująca. W komórkach, długołańcuchowy kwas tłuszczowy (FA) łączy się z koenzymem A (COA) tworząc długołańcuchowy acyl-koenzym A (acyl-COA) (19). Karnityna łączy się z grupą acylową długołańcuchowego acylo-COA tworząc długołańcuchową acylkarnitynę przy udziale palmitoilotransferazy karnitynowej 1 zlokalizowanej w zewnętrznej błonie mitochondrialnej (20). Acylkarnityna jest transportowana do mitochondriów za pośrednictwem translokacji acylkarnityny z karnityną (CATC) (21). Długołańcuchowa acylkarnityna jest rozkładana do długołańcuchowego acylo-CoA i karnityny przez palmitoilotransferazę karnitynową 2 w wewnętrznej błonie mitochondrialnej (22). Długołańcuchowy acyl-COA ulega dehydrogenacji pod wpływem dehydrogenazy bardzo długołańcuchowego acylo-COA, tworząc enoilo-COA (23). Z enoilo-COA powstaje 3-hydroksyacylo-CoA poprzez hydratację pod kontrolą hydratazy enoilo-CoA (23). 3-hydroksyacylo-CoA jest dehydrogenowany przez długołańcuchową dehydrogenazę 3-Hydroksyacylo-CoA do postaci 3-ketoacylo-CoA (24). 3-ketoacylo-CoA ulega tiolizie przez długołańcuchową tiolazę letoacylo-CoA, w wyniku czego powstaje acetylo-CoA i skrócony łańcuch dwuwęglowy acylo-CoA (25). Skrócony COA ponownie wchodzi w ten cykl metaboliczny, aż do momentu wejścia na ścieżkę utleniania krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych. W porównaniu z długołańcuchowymi kwasami tłuszczowymi, średnio- i krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe mogą wchodzić do mitochondriów bezpośrednio, bez udziału CACT. Podobnie jak długołańcuchowe kwasy tłuszczowe, średnio- i krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe produkują skrócony-COA w porównaniu z acetylo-CoA pod połączoną katalizą niektórych podobnych enzymów. Skrócony-COA ponownie wchodzi do cyklu krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych, gdzie jest przekształcany w acetylo-CoA. Wreszcie, acetylo-CoA wytworzony w procesie utleniania kwasu tłuszczowego dostarcza energii poprzez udział w cyklu kwasu trójkarboksylowego (Rysunek 2A).

W kilku badaniach odnotowano zmniejszone tempo utleniania glukozy, zwiększone tempo utleniania FA i zużycie tlenu przez mięsień sercowy u myszy ob/ob i db/db (26, 27). Amerykański zespół badawczy wyciągnął podobny wniosek poprzez wielokrotne pomiary powyższych myszy w różnych tygodniach życia (28). Zespół ten podejrzewał, poprzez dalsze eksperymenty PCR, że ekspresja genów zaangażowanych w wychwyt i utlenianie FA została zaburzona, co doprowadziło do tego, że ilość FA wprowadzonego do kardiomiocytów przekroczyła mitochondrialną zdolność oksydacyjną. Ponadto w niektórych innych badaniach stwierdzono, że w kardiomiocytach szczurów Zucker nie obserwowano istotnie zwiększonego utleniania w porównaniu ze zwiększoną ilością długołańcuchowego FA w kardiomiocytach (29, 30). W jednym z badań określono poziom FA u ludzi i stwierdzono, że chociaż tempo utleniania FA wzrosło, procentowa ilość utlenionych kwasów tłuszczowych była niższa ze względu na zwiększone spożycie (31). Ponadto, acylo-CoA może gromadzić się w cytoplazmie, jeśli dojdzie do przeciążenia FA (32). Konsekwentnie, analiza metabolomiczna wykazała, że w porównaniu z pacjentami bez T2DM, utlenianie długołańcuchowych kwasów tłuszczowych u pacjentów z T2DM było niekompletne, co prowadziło do istotnie zwiększonego poziomu C6, C8, C10, C12 i C14 w osoczu (33). Niektórzy badacze wykazali, że procentowa zawartość tłuszczu w organizmie korelowała pozytywnie z poziomem C2, C3, C4, C5, C6, C8:1 i C16:1 w surowicy (34). Prawdopodobnie większa ilość tkanki tłuszczowej korelowała z niekompletnym utlenianiem beta kwasów tłuszczowych, co w głównej mierze prowadziło do zwiększenia ilości krótko- lub średniołańcuchowej acylkarnityny. Stwierdzili oni również, że poziomy surowicy C2, C6, C8, C10, C12, C14, C14:1 i C14-OH były zwiększone w stanie przedcukrzycowym (34).

Podejrzewamy zatem, że nieznacznie podwyższony wskaźnik utleniania kwasów tłuszczowych w kardiomiocytach u pacjentów z T2DM nie może odpowiednio utlenić długołańcuchowych wolnych FAs, nagromadzonych w kardiomiocytach. Nagromadzone wolne FAs indukują kardiotoksyczność. Z drugiej strony, szlak utleniania średnio- i krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych może być zahamowany z powodu zwiększonej szybkości utleniania długołańcuchowych kwasów tłuszczowych. Z powodu tego zahamowania średnio- i krótkołańcuchowy koenzym A nie jest w wystarczającym stopniu przekształcany do acetylo-CoA. Wreszcie, kumulacja acylo-CoA wiążąca karnitynę prowadzi do wzrostu średnio- i krótkołańcuchowych acylkarnityn (Figura 2B).

Było kilka ograniczeń zauważonych w naszym badaniu. Po pierwsze, nasze badanie było badaniem przekrojowym i nie mogło ustalić związków przyczynowych między acylkarnitynami a CVD w T2DM. Po drugie, nasi uczestnicy byli hospitalizowani. Ich T2DM były cięższe niż u pacjentów z T2DM na wolności. Tak więc, nasze wyniki nie mogą być ekstrapolowane na ogólną populację pacjentów z T2DM. Po trzecie, w naszym badaniu nie zbierano czynników żywieniowych, a nawyk żywieniowy może być jednym z głównych czynników zakłócających w naszej analizie (35). Jednakże, starannie skorygowaliśmy potencjalnie mylące efekty innych metabolitów acylkarnityny oraz czynników demograficznych i klinicznych, w tym, ale nie tylko, wiek, BMI, BP, HbA1c i profil lipidowy. Jako „wyniki” diety, dostosowanie do tych metabolitów acylkarnityny i czynników klinicznych mogło częściowo usunąć zakłócające efekty nawyków żywieniowych. Niemniej jednak uznaliśmy, że pomimo starannej korekty dla tych czynników zakłócających, nie możemy wykluczyć, że istniały nieskorygowane efekty zakłócające. Dlatego nasze wyniki muszą być interpretowane z ostrożnością. Po czwarte, nie określiliśmy poziomów insulinooporności i acylo-CoA. Wreszcie, w 200 przypadkach brakowało HbA1c u naszych badanych. Jednak te stowarzyszenia pozostały stabilne po imputacji średniej i wielokrotnej imputacji, co sugeruje, że główna stronniczość jest mało prawdopodobna.

Nasze badania miały ważne implikacje dla zdrowia publicznego. CVD jest częstym i poważnym powikłaniem w T2DM, które jest istotnie związane z przedwczesnym zgonem w T2DM. Mimo że intensywne leczenie hiperglikemii, nadciśnienia tętniczego i nieprawidłowych lipidów jest w stanie zmniejszyć ryzyko CVD w T2DM, rezydualne ryzyko CVD pozostaje istotnie wysokie (36). Ważne jest, aby lepiej zrozumieć mechanizmy CVD w T2DM. Nasze badanie dostarcza nowego wglądu w szlaki prowadzące od zaburzeń metabolicznych w T2DM do CVD.

W podsumowaniu, w naszym badaniu stwierdzono, że podwyższone poziomy osoczowe niektórych metabolitów acylkarnityny wyodrębnionych w czynnikach 1 i 2, tj. C2, C4, C6, C8, C10, C12, C14, C14OH i C14:1, były związane z ryzykiem CVD u chińskich pacjentów z T2DM. Ze względu na charakter badania przekrojowego, potrzebne są prospektywne badania kohortowe w celu replikacji naszych ustaleń w przyszłości.

Oświadczenie o dostępności danych

Zestawy danych wygenerowane dla tego badania można znaleźć w Metabolights, z unikalnym identyfikatorem MTBLS1427, dostępnym przez http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS1427.

Oświadczenie etyczne

Badania z udziałem ludzi zostały przejrzane i zatwierdzone przez Ethics Committee for Clinical Research of Liaoning Medical University First Affiliated Hospital. Pisemna świadoma zgoda na udział w badaniu nie była wymagana zgodnie z przepisami krajowymi i wymogami instytucjonalnymi.

Wkład autorów

Z-ZF, SZ, i XY zaprojektowali badanie. SZ i X-FF przeanalizowali dane i napisali projekt. H-HL i MG zebrali dane. JL, Y-FC, i X-YS przedstawili krytyczne uwagi i przyczynili się do napisania tego manuskryptu. SZ, TH, J-XC, JZ, i DS uczestniczyli w rewizji tego manuskryptu.

Funding

Ta praca była wspierana przez projekt dla Narodowego Kluczowego Programu Badań i Rozwoju (2019YFA0802300), Liaoning Province Natural Science Foundation (20170540364), Ogólny projekt naukowo-badawczy Departamentu Edukacji Prowincji Liaoning (L2015326), Kluczowy Program Badań i Rozwoju Prowincji Liaoning (2019JH8/10300036), trzynasty plan 5-letni i projekt talentów TMU (11601501/2016KJ0313), zindywidualizowana diagnostyka i leczenie raka jelita grubego (LNCCC-B05-2015), Fundacja Komitetu Nauki i Technologii Tianjin (15JCYBJC54700), China Postdoctoral Science Foundation (2016M590210), Tianjin Health Bureau Science Foundation Key Project (16KG154) i Tianjin Project of Thousand Youth Talents.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują wszystkim lekarzom, pielęgniarkom i personelowi badawczemu w LMUFAH w Jinzhou, za udział w tym badaniu.

Materiały uzupełniające

Materiały uzupełniające do tego artykułu można znaleźć online pod adresem: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2020.00212/full#supplementary-material

.