Improvement of L-Arabinose Fermentation by Modifying the Metabolic Pathway and Transport in Saccharomyces cerevisiae

Abstract

Scieżka utylizacji L-arabinozy została ustanowiona w Saccharomyces cerevisiae, poprzez ekspresję zoptymalizowanych kodonowo genów araA, araB, i araD z Lactobacillus plantarum. Po nadekspresji genów TAL1, TKL1, RPE1, RKI1 i GAL2 oraz ewolucji adaptacyjnej, wykorzystanie L-arabinozy przez zrekombinowany szczep stało się wydajne. Powstały szczep wykazywał maksymalne specyficzne tempo wzrostu 0,075 h-1, maksymalne specyficzne tempo zużycia L-arabinozy 0,61 g h-1 g-1 suchej masy komórek oraz obiecującą wydajność etanolu 0,43 g-1 z fermentacji L-arabinozy.

1. Wstęp

W celu zmniejszenia zależności od paliw kopalnych, światowa produkcja bioetanolu została zwiększona z ~45 milionów litrów w 2005 roku do ~113 miliardów litrów w 2012 roku . Przyszła wielkoskalowa produkcja paliwowego etanolu będzie najprawdopodobniej oparta na obficie występujących materiałach lignocelulozowych zamiast na cukrze i zbożu, które są pokarmem dla ludzi i zwierząt. Opłacalna produkcja etanolu paliwowego z materiałów lignocelulozowych wymaga pełnego wykorzystania surowców. Jednym z celów produkcji bioetanolu jest wyposażenie mikroorganizmów fermentacyjnych w zdolność do przetwarzania wszystkich cukrów zawartych w materiałach lignocelulozowych. Z materiałów lignocelulozowych można odzyskać około 3-15% składnika L-arabinozy. Dlatego konieczne jest skonstruowanie mikroorganizmu fermentującego L-arabinozę w celu zwiększenia wykorzystania tego cukru .

Dwa typy szlaków metabolicznych L-arabinozy istnieją u grzybów i bakterii. Reduktaza aldozy (AR), L-arabitol-4-dehydrogenaza (LAD), reduktaza L-ksylulozy (LXR) i dehydrogenaza D-ksylitolu (XDH) stanowią grzybowy szlak metaboliczny L-arabinozy. Reakcja katalizowana przez AR i LXR jest sprzężona z utlenianiem NADPH do NADP+, a LAD i XDH wykorzystują NAD+ jako kofaktor. Powstała ksyluloza jest fosforylowana i wchodzi w skład szlaku pentozofosforanowego (PPP). Bakteryjny szlak metaboliczny L-arabinozy jest niezależny od kofaktora i składa się z izomerazy L-arabinozy (AraA), L-rybulokinazy (AraB) i 4-epimerazy L-rybulozo-5-fosforanu (AraD). Powstały D-ksylulozo-5-fosforan wchodzi do PPP . Oba szlaki metaboliczne L-arabinozy zostały ustanowione w Saccharomyces cerevisiae, który jest tradycyjnym mikroorganizmem produkującym etanol, z doskonałą zdolnością fermentacji cukrów i tolerancją na trudne warunki środowiskowe, ale nie może fermentować L-arabinozy. Nic dziwnego, że w rekombinowanym szczepie S. cerevisiae zawierającym grzybowy szlak metaboliczny L-arabinozy dochodzi do zaburzenia równowagi redoks. Wydajność produktu ubocznego L-arabitolu była tak wysoka, jak 0,48 g g-1 cukru pentozowego zużytego w kofermentacji D-ksylozy i L-arabinozy, chociaż szczep wyrażający NADH preferował AR i LXR w celu zmniejszenia nierównowagi redoks .

W porównaniu z grzybowym szlakiem metabolicznym L-arabinozy, szlak bakteryjny jest prostszy i niezależny od kofaktora. Jednakże, z powodu braku skutecznych testów aktywności enzymów zaangażowanych w bakteryjny szlak metabolizmu L-arabinozy, optymalizacja tego szlaku w S. cerevisiae nie była prosta. Szczep S. cerevisiae wykazujący ekspresję genów araA, araB i araD Escherichia coli nie mógł wykorzystywać L-arabinozy. Jednakże, po zastąpieniu genu izomerazy L-arabinozy E. coli genem araA sklonowanym z Bacillus subtilis, szczep ten mógł rosnąć i produkować etanol na L-arabinozie po kilku kręgach wzrostu adaptacyjnego. Ponadto, wykorzystanie L-arabinozy zostało jeszcze bardziej poprawione poprzez zmianę kodonów bakteryjnych genów araA, araB i araD na preferowane kodony drożdżowe. Geny metabolizmu L-arabinozy z Lactobacillus plantarum bardziej pasowały do kodonów S. cerevisiae niż geny wcześniej opisane. Wisselink i wsp. wprowadzili wiele kopii araA i araD oraz jedną kopię araB z L. plantarum do S. cerevisiae. Po nadekspresji genów kodujących enzymy nieoksydacyjnego PPP i szeroko zakrojonej ewolucji adaptacyjnej, otrzymany szczep wykazywał wysoką wydajność etanolu do 0,43 g g-1 podczas wzrostu beztlenowego na L-arabinozie, z wysokim wskaźnikiem zużycia arabinozy (0,70 g h-1 g-1 suchej masy komórki (DCW)). Analiza metabolomu, transkryptomu i strumienia metabolicznego bardziej rozwiniętego szczepu ujawniła, że wyższe poziomy ekspresji izoenzymów transportera galaktozy, transketolazy i transaldolazy korzystnie wpływają na wzrost S. cerevisiae na L-arabinozie.

W obecnej pracy, unikalne, zoptymalizowane kodonowo geny araA, araB i araD L. plantarum uległy ekspresji w szczepie S. cerevisiae CEN.PK102-3A na różnych poziomach. Następnie w tym rekombinowanym szczepie dokonano nadekspresji genów TAL1, TKL1, RPE1 i RKI1 zaangażowanych w PPP. Otrzymany szczep poddano sekwencyjnej selekcji na L-arabinozę w warunkach tlenowych oraz w warunkach ograniczonego dostępu tlenu. Uzyskano szczep o znacząco zwiększonej zdolności do utylizacji L-arabinozy. Zbadano zdolności metaboliczne L-arabinozy szczepów wyewoluowanych oraz szczepu, który dodatkowo nadekspresjonował gen transportera GAL2. Omówiono czynniki wpływające na wydajność metabolizmu L-arabinozy.

2. Materiały i Metody

2.1. Media i warunki hodowli

Do hodowli drożdży użyto syntetycznej pożywki kompletnej (SC) zawierającej 1,7 g L-1 drożdżowej bazy azotowej (YNB, Sangon, Chiny) i 5 g L-1 siarczanu amonu (Sangon, Chiny), z dodatkowymi źródłami węgla glukozy (Sangon, Chiny) lub L-arabinozy (Sinopharm, Chiny). Pełna mieszanina suplementów, 0,77 g L-1 CSM-URA lub 0,67 g L-1 CSM-LEU-URA (MP Biomedicals, Solon, OH), była dodawana w celu utrzymania wymaganych plazmidów z selekcją auksotroficzną w razie potrzeby. Dla szczepów z markerem KanMX4 do podłoża dodawano 200 g mL-1 antybiotyku siarczanu G418 (Promega, Madison, WI, USA). Wszystkie drożdże hodowano w temperaturze 30°C.

2.2. Analiza indeksu adaptacji kodonów

Wskaźnik adaptacji kodonów (CAI) jest używany do zilustrowania preferencji użycia kodonów u poszczególnych gatunków. Do analizy CAI użyto programu CODONW (http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/MobylePortal/portal.py?form=codonw).

2.3. Konstrukcja plazmidu i szczepu

E. coli DH5 został użyty do subklonowania. Szczepy S. cerevisiae i plazmidy użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 1. Startery użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 2.

Unikalne, zoptymalizowane kodonowo geny araA, araB i araD kodujące izomerazę L-arabinozy (GenBank: CCC80517.1), L-rybulokinazę (GenBank: CCC80519.1) i 4-epimerazę L-rybulozy-5-fosforanu (GenBank: CCC80518.1) L. Plantarum były sztucznie syntetyzowane i ligowane pomiędzy promotorem HXT7 i sekwencjami terminatora PGK1 plazmidu pHX, który został skonstruowany przez zastąpienie PGK1p z plazmidu YEp24-PGKp przez HXT7p, zawierającego miejsca dla enzymów restrykcyjnych Kpn I i Sma I. Fragment HXT7p-araD-PGK1t amplifikowano metodą PCR z miejscami końcowymi dla enzymów restrykcyjnych Hind III i Bln I, a następnie wstawiono do miejsc Hind III i Nhe I plazmidu YIp5, uzyskując plazmid YIp5-araD. Fragment HXT7p-araA-PGK1t zawierający końcowe miejsca Bgl II i Sal I wstawiono do miejsc BamH I i Sal I plazmidu YIp5-araD, w wyniku czego powstał plazmid YIp5-araAD. Fragment HXT7p-araB-PGK1t z miejscami Eag I i Stu I wstawiono do miejsc Eag I i Stu I plazmidu YIp5-araAD, w wyniku czego powstał plazmid YIp5-ara (Rysunek 1(a)). Fragment promotora TEF1 (z miejscami końcowymi dla Hind III i Sal I) oraz fragment terminatora PGK1 (z miejscami końcowymi dla BamH I i Hind III) zostały sklonowane odpowiednio z plazmidów pJFE3 i pYMIKP . Te dwa fragmenty zostały zlinkowane i wstawione do plazmidu pYX242 w celu skonstruowania wektora pYX242-WS z dwoma miejscami, które mogą być wykorzystane do ekspresji genów. Następnie, gen araA został wstawiony pomiędzy miejsca Sal I i Sac I tego wektora pod kontrolą promotora TEF1 i terminatora PloyA w celu jego ekspresji, a powstały plazmid nazwano pYX2422-TEF1araA (Rysunek 1(b)). Plazmid pYX2422-HXT7araA (Rysunek 1(b)) został skonstruowany przy użyciu fragmentu HXT7p w celu wyparcia fragmentu TEF1p z plazmidu pYX2422-TEF1araA; złączami były sekwencje rozpoznawania BamH I i Sal I. Gen GAL2 został sklonowany z chromosomalnego DNA CEN.PK102-3A, a następnie wstawiony do miejsc Xba I i Sal I plazmidu pJFE3, w wyniku czego powstał plazmid pJFE3-GAL2. Fragment URA3 plazmidu pJFE3-GAL2 pomiędzy miejscami Nde I i Apa I został zastąpiony genem KanMX4 sklonowanym z pUG6 , w wyniku czego powstał plazmid pJFE318-GAL2 (Rysunek 1(c)).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Rysunek 1

Mapy fizyczne plazmidów (a) YIp5-.ara, (b) pYX2422-TEF1araA/HXT7araA, i (c) pJFE318-GAL2.

Transformację drożdży przeprowadzono metodą transformacji octanem litu . Plazmid YIp5-ara linearyzowano w miejscu Stu I, a następnie transformowano do CEN.PK102-3A. Transformanty z genami araA, araB i araD zintegrowanymi z chromosomalnym genem URA3 selekcjonowano w podłożu SC zawierającym CSM-URA, a po potwierdzeniu sekwencjonowaniem pożądany transformant nazwano BSW1A1. Plazmidy pYX242, pYX2422-HXT7araA i pYX2422-TEF1araA transformowano do BSW1A1, uzyskując odpowiednio BSW1AY, BSW1A7 i BSW1AT. Linearyzowany pJPPP3, który zawiera ramki ekspresyjne genów TAL1, TKL1, RPE1 i RKI1 , zintegrowano z chromosomem BSW1AT w locus genu GRE3, otrzymując szczep BSW2AP. Szczep BSW2AP adaptowano na 20 g L-1 L-arabinozy w warunkach tlenowych, a następnie w warunkach ograniczonych tlenem. Po osiągnięciu fazy stacjonarnej, nowy wsad inicjowano poprzez przeniesienie hodowli na świeże podłoże o początkowej biomasie 0,15 g DCW L-1. Gdy czas podwajania szczepu ustabilizował się, spośród zaadaptowanych mutantów wybrano mutanta BSW3AP na podstawie jego doskonałego wzrostu na L-arabinozie. Plazmid pJFE318-GAL2 został następnie transformowany do szczepu BSW3AP, w wyniku czego powstał szczep BSW3AG.

2.4. Real-Time Quantitative PCR

Komórki hodowano w podłożu SC zawierającym 20 g L-1 glukozy i zbierano, gdy OD600 hodowli osiągnęła wartość 1. Całkowite RNA ekstrahowano przy użyciu odczynnika TRIzol (Sangon, Chiny). Pierwszą nić cDNA poddano odwrotnej transkrypcji z 1 g całkowitego RNA przy użyciu zestawów odczynników PrimeScript RT z gDNA Eraser (Takara, Japonia). Rozcieńczone produkty cDNA wykorzystano do ilościowego PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO, Japonia) i LightCycle PCR System (Roche Molecular Biochemicals, Niemcy). Gen kodujący aktynę ACT1 został użyty jako gen referencyjny do normalizacji. Dane z real-time PCR obliczono zgodnie z metodą . Startery dla tych PCR wymieniono w tabeli 2.

2.5. Fermentacja

Pojedynczą kolonię hodowano przez noc w podłożu SC zawierającym 20 g L-1 glukozy. Próbkę z całonocnej hodowli rozcieńczono do początkowej OD600 równej 0,5 w podłożu SC zawierającym 10 g L-1 glukozy i 10 g L-1 L-arabinozy. Po 10 h hodowli, komórki były zbierane i wykorzystywane do fermentacji. Wszystkie fermentacje prowadzono w temperaturze 30°C, 200 r min-1, w kolbach wstrząsarkowych o pojemności 200 mL zawierających 40 mL podłoża. Warunki ograniczonego dostępu tlenu były utrzymywane za pomocą gumowego korka. Fermentacje wsadowe w warunkach beztlenowych prowadzono w fermentorach 1,4 L (Infors AG, Szwajcaria) o objętości roboczej 900 mL. Warunki beztlenowe utrzymywano przez sparging azotem (0,1 L min-1); szybkość mieszania wynosiła 500 r min-1. pH utrzymywano na poziomie 5,0 poprzez automatyczne pompowanie 1 mol L-1 NaOH i 1 mol L-1 H3PO4. Początkowa biomasa wynosiła 0,2 g DCW L-1. Źródłem węgla w podłożu SC plus CSM-LEU-URA było 20 g L-1 L-arabinozy; w fermentacji szczepu BSW3AG podawano 200 g mL-1 G418. Suchą masę komórek szczepów wyewoluowanych i nieewoluowanych obliczono według wzoru: sucha masa (mg mL-1) = 0,266 × OD600 – 0,0762 i sucha masa (mg mL-1) = 0,2365 × OD600 + 0,1149, odpowiednio.

2.6. Analiza produktów fermentacji

Do oznaczenia stężeń cukrów i metabolitów zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) Prominence LC-20A (Shimadzu, Japonia) wyposażoną w detektor współczynnika załamania światła RID-10A (Shimadzu, Japonia). Kolumnę jonowymienną Aminex HPX-87P (Bio-Rad, USA) zastosowano do analizy L-arabinozy, arabitolu i etanolu w temperaturze 80°C z fazą ruchomą wodną przy przepływie 0,6 mL min-1. Kolumna jonowymienna Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Hercules, USA) została użyta do analizy glicerolu i octanu w temperaturze 45°C przy użyciu 5 mmol L-1 H2SO4 jako fazy ruchomej .

3. Wyniki

3.1. Expression of the Codon-Optimized Genes Involved in the L-Arabinose Pathway in S. cerevisiae

Based on the amino acid sequence of L-arabinose isomerase (GenBank accession no. CCC80517.1), L-ribulokinase (GenBank accession no. CCC80519.1), i 4-epimerazy L-rybulozo-5-fosforanu (GenBank accession no. CCC80518.1) zarejestrowanych w National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), geny araA, araB i araD L. plantarum zostały sztucznie zsyntetyzowane przy użyciu preferowanych kodonów S. cerevisiae. CAI zoptymalizowanych kodonowo genów araA, araB i araD wynosiły odpowiednio 0,599, 0,580 i 0,646, i były wyższe niż sekwencji natywnych (0,324, 0,223 i 0,243, resp.).

Kasety ekspresyjne kodonów zoptymalizowanych araA, araB i araD zintegrowano z chromosomem szczepu CEN.PK102-3A, uzyskując szczep BSW1A1. Jednakże BSW1A1 nie mógł rosnąć na L-arabinozie, chociaż transkrybowane mRNA tych genów było wykrywalne. Następnie do BSW1A1 wprowadzono więcej kopii araA, przeniesionych przez plazmid episomalny pYX242 i ulegających ekspresji pod kontrolą promotorów HXT7 i TEF1. Poziom transkrypcji araA w powstałych szczepach BSW1A7 i BSW1AT był -krotnie i -krotnie wyższy niż w szczepie referencyjnym BSW1AY niosącym tylko zintegrowaną, ulegającą ekspresji araA. Szczepy BSW1A7 i BSW1AT inkubowano tlenowo na L-arabinozie, a wzrost szczepu BSW1AT obserwowano po ~150 h, podczas gdy BSW1A7 nie mógł rosnąć nawet przy dłuższej hodowli.

3.2. Improvement of the L-Arabinose Utilization in S. cerevisiae by Engineering and Evolution

Geny TAL1, TKL1, RPE1 i RKI1 zaangażowane w nieutleniający szlak fosforanu pentozy zostały poddane nadekspresji w pojedynczej kolonii wyizolowanej z hodowli BSW1AT po 150 h przez integrację linearyzowanego plazmidu pJPPP3 do chromosomu. Powstały szczep, BSW2AP, ewoluował na L-arabinozie. Po 9 transferach w warunkach tlenowych i 12 transferach w warunkach ograniczonego dostępu tlenu, czas podwojenia hodowli zmniejszył się z 22 h do 4,5 h. Mutanty badano na płytkach z L-arabinozą, wyselekcjonowano dużą kolonię, której nadano nazwę BSW3AP.

Poziomy transkrypcji genów w rekombinowanych szczepach BSW1AT, BSW2AP, i BSW3AP określono metodą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (Rysunek 2). Poziom ekspresji araA w BSW2AP był 2-krotnie wyższy niż w BSW1AT, podczas gdy poziomy ekspresji araB i araD w BSW2AP były niższe. Zmiany te mog± być spowodowane mutacjami, które zaszły podczas hodowli BSW1AT na L-arabinozie. W wyewoluowanym szczepie BSW3AP wszystkie trzy geny ulegały ekspresji na wysokim poziomie. Poziomy ekspresji araA, araB i araD w BSW3AP były odpowiednio 4,1-krotnie, 1,6-krotnie i 2,5-krotnie wyższe niż w szczepie BSW1AT.

Rycina 2

Ekspresja araA (czarne słupki), araB (szare słupki) i araD (puste słupki) szczepów BSW2AP i BSW3AP w porównaniu do szczepu BSW1AT. Fałdowe zmiany poziomów mRNA tych genów znormalizowano do ekspresji ACT1. Badane szczepy hodowano na 20 g L-1 glukozy. Podane wartości uzyskano z trzech niezależnych pomiarów.

Porównywano wykorzystanie L-arabinozy przez szczepy BSW1AT, BSW2AP i BSW3AP w wytrząsarkach w warunkach ograniczonego dostępu tlenu (Rysunek 3); początkowa OD600 wynosiła 0,5. W ciągu 120 h nie obserwowano wzrostu BSW1AT. Szczep BSW2AP rósł na L-arabinozie z maksymalną specyficzną szybkością wzrostu () wynoszącą 0,011 h-1; zużyto 4,4 g L-1 L-arabinozy i wyprodukowano 1,2 g L-1 etanolu w ciągu 120 h fermentacji. Natomiast ewolucja szczepu BSW3AP wzrosła do 0,23 h-1. Po 120 h fermentacji zużyto 18,6 g L-1 L-arabinozy przy maksymalnej specyficznej szybkości zużycia 0,7 g h-1 g-1 DCW; wyprodukowano 6,9 g L-1 etanolu, a wydajność etanolu wynosiła 0,43 g-1; zgromadzono tylko 0,13 g L-1 L-arabitolu.

(a)

(b)

(c)

(d)

(d)

.

(a)
(b)
(c)
(d)

Rysunek 3

Fermentacja L-.arabinoza fermentacja szczepów w kolbach wstrząsarkowych. Zdolność wzrostu (a), zużycie L-arabinozy (b), tworzenie arabitolu (c) i tworzenie etanolu (d) przez BSW1AT (▲), BSW2AP (■) i BSW3AP (). Szczepy hodowano w 40 mL podłoża SC z 20 g L-1 L-arabinozą w 30°C, 200 r min-1 przy początkowej OD600 równej 0,5. Dane są średnimi z trzech niezależnych eksperymentów.

3.3. Overexpression of GAL2 Improved the L-Arabinose Anaerobic Fermentation of the Evolved Strain

Gen permeazy galaktozy GAL2 został nadekspresjonowany w BSW3AP, w wyniku czego powstał szczep BSW3AG. Zbadano właściwości beztlenowej fermentacji L-arabinozy szczepów BSW3AP i BSW3AG (Rysunek 4 i Tabela 3) w bioreaktorach. Szczep BSW3AP wzrastał na L-arabinozie z maksymalną specyficzną szybkością wzrostu wynoszącą 0,067 h-1. Maksymalne specyficzne zużycie L-arabinozy wynosiło 0,49 g h-1 g-1 DCW. Etanol był produkowany przy maksymalnej specyficznej szybkości 0,20 g h-1 g-1 DCW z wydajnością 0,42 g-1. Nadekspresja GAL2 znacząco poprawiła zdolność fermentacji L-arabinozy. Maksymalna specyficzna szybkość wzrostu BSW3AG wynosiła 0,075 h-1, co było o 12% szybsze niż BSW3AP. Wskaźnik specyficznego zużycia L-arabinozy przez BSW3AG wynosił 0,61 g h-1 g-1 DCW, co było o 24% szybsze niż w przypadku BSW3AP. Szybkość produkcji etanolu wynosiła 0,27 g h-1 g-1 DCW, a wydajność etanolu 0,43 g-1. Ponadto, zarówno BSW3AP jak i BSW3AG produkowały niewielkie ilości glicerolu (1,4 g L-1 dla obu szczepów) oraz prawie niewykrywalne ilości arabitolu i octanu.

(a)

(b)

(a)
(b)

4. Dyskusja

Całkowita konwersja cukrów jest ważna dla wydajnej i opłacalnej produkcji etanolu paliwowego z materiałów lignocelulozowych. Nawet niewielka poprawa w wykorzystaniu substratów może znacząco obniżyć koszty całego procesu. L-arabinoza jest ważnym składnikiem materiałów lignocelulozowych. Ekspresja szlaku L-arabinozy L. plantarum okazała się skuteczna w konstruowaniu S. cerevisiae wykorzystującego L-arabinozę. Biorąc pod uwagę, że geny zoptymalizowane pod względem kodonów mogą prowadzić do zwiększonej ekspresji białek, w niniejszej pracy oryginalne geny araA, araB i araD L. plantarum zostały zmodyfikowane tak, aby pasowały do użycia kodonów S. cerevisiae, a następnie zintegrowane z chromosomem szczepu CEN.PK102-3A. Jednakże ten zrekombinowany szczep nie mógł rosnąć na L-arabinozie. Następnie do zrekombinowanego szczepu wprowadzono więcej kopii genu araA pod kontrolą promotorów HXT7 i TEF1. Kiedy dwa powstałe w ten sposób szczepy hodowano na L-arabinozie, wzrost obserwowano jedynie w hodowlach szczepu wyrażającego araA pod kontrolą promotora TEF1, w których poziom transkrypcji araA był 1,4-krotnie wyższy niż w szczepie wyrażającym araA pod kontrolą promotora HXT7. Sugerujemy, że wzrost na L-arabinozie może zachodzić tylko wtedy, gdy poziom transkrypcji araA jest wyższy od pewnego poziomu. W przeciwieństwie do tego, tylko jedna kopia araB i araD została wprowadzona do tego rekombinowanego szczepu, a poziomy transkrypcji tych genów były niższe niż w szczepie rodzicielskim. Zjawiska te wskazywały, że araB i araD były mniej ważne dla wzrostu na L-arabinozie, ponieważ tylko jedna kopia tych genów umożliwiała rekombinowanemu szczepowi wzrost na L-arabinozie.

Ewolucja adaptacyjna okazała się być skuteczną metodą zwiększania wydajności metabolicznej szczepów. W obecnym badaniu, wyewoluowany szczep BSW3AP wykazuje znacząco poprawioną zdolność metabolizowania L-arabinozy. Zwiększony poziom transkrypcji wszystkich trzech genów (araA, araB i araD) może przyczynić się do tego wzrostu. W porównaniu do araA i araD, poziom ekspresji araB był niższy. Becker i Boles podali, że mutant na L-arabinozę obniżył aktywność L-rybulokinazy ekspresjonowanej przez araB. Stosunkowo niższa ekspresja araB pozwala uniknąć nadmiernego zużycia ATP, co korzystnie wpłynęłoby na wzrost szczepu na L-arabinozie.

L-arabinoza jest nowym źródłem węgla dla S. cerevisiae. Pobór L-arabinozy w S. cerevisiae zależy głównie od niespecyficznego transportu przez transporter heksozy Gal2p. Transportery Hxt9p i Hxt10p również mogą transportować L-arabinozę, ale ich wydajność jest bardzo niska. Stwierdzono, że nadekspresja GAL2 poprawia wykorzystanie L-arabinozy. W tym badaniu, nadekspresja GAL2 znacząco zwiększyła tempo wzrostu i zużycie L-arabinozy przez nasz wyewoluowany szczep BSW3AP. Wynik ten sugeruje, że teoretyczny strumień metaboliczny L-arabinozy był wyższy niż ten, który wykryliśmy w BSW3AP. Wykorzystanie L-arabinozy przez BSW3AP było ograniczone szybkością jej absorpcji. Kiedy GAL2 był nadekspresjonowany, więcej Gal2p w błonie plazmatycznej prowadziło do zwiększonego wychwytu L-arabinozy, a następnie promowało wykorzystanie L-arabinozy. Nasze wyniki dodatkowo potwierdziły znaczenie transporterów dla utylizacji L-arabinozy; jednakże powinowactwo Gal2p do L-arabinozy jest niskie, a glukoza kompetycyjnie hamowała jej wiązanie do L-arabinozy. Poprawa wydajności transportera specyficznego dla L-arabinozy pozostaje do przeprowadzenia.

5. Wnioski

W wyniku wieloetapowej inżynierii genetycznej i ewolucji adaptacyjnej uzyskaliśmy szczep BSW3AG, który rośnie na L-arabinozie z wydajnością 0,075 h-1. Maksymalna specyficzna szybkość zużycia L-arabinozy wynosi 0,27 g h-1 g-1 DCW, a maksymalna wydajność etanolu wynosi 0,43 g-1 L-arabinozy, co stanowi 84,3% ilości teoretycznej. Wysoki poziom ekspresji araA jest szczególnie ważny w ustanowieniu wydajnego szlaku L-arabinozy w S. cerevisiae, a bardziej wydajne transportery są niezbędne do poprawy zdolności absorpcji L-arabinozy przez wyewoluowane szczepy.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Key Basic Research Program (2011CB707405), National High-Technology Research and Development Program of China under Grant (2012AA022106), National Natural Science Foundation of China (30970091, 31070096, and 31270151), and the International S&T Cooperation Program of China (2010DFA32560). Autorzy dziękują dr Peterowi Kötterowi z Johann Wolfgang Goethe-University we Frankfurcie za szczep CEN.PK102-3A.

.