Inhibitor of Apoptosis Proteins: Translating Basic Knowledge into Clinical Practice
- The Inhibitor of Apoptosis Protein Family of Caspase Inhibitors
- Rodzina białek inhibitora apoptozy
- Klasa 1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
- Class 2 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
- Class 3 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
- Inhibitor białek apoptozy hamuje aktywne kaspazy
- Structural Basis of Caspase Inhibition by X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein. Domena BIR2 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
- Domena BIR3 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
- Survivin.
- Beyond Caspase Inhibition
- Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Division.
- Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.
- Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Signaling.
- Regulacja funkcji białka inhibitora apoptozy przez endogenne białka hamujące
- SMAC i HTRA2.
- Badania strukturalne.
- SMAC β.
- XAF1.
The Inhibitor of Apoptosis Protein Family of Caspase Inhibitors
IAPs są rodziną inhibitorów kaspaz, które specyficznie hamują kaspazy 3, 7 i 9 i w ten sposób zapobiegają apoptozie. Crook et al. (17) zidentyfikowali pierwszego członka rodziny IAP przypadkowo podczas badania apoptozy wywołanej przez vAcAnh w komórkach bakulowirusa SF21. Podczas badania genów bakulowirusowych, które naśladowały działanie p35 i hamowały apoptozę indukowaną przez vAcAnh, zidentyfikowali oni nowy 1,6-kb gen kodujący 31-kDa białko antyapoptotyczne z motywem podobnym do palca cynkowego (17). Późniejsze badania zidentyfikowały IAP u różnych gatunków i odkryły, że IAP hamują apoptozę poprzez blokowanie kaspaz (przegląd w ref. 18).
Rodzina białek inhibitora apoptozy
Do tej pory zidentyfikowano ośmiu członków rodziny IAP u ludzi (ryc. 2)⇓, a homologi IAP zostały również opisane u owadów i drożdży. Białka IAP są zaliczane do tej rodziny na podstawie obecności od jednej do trzech domen BIR (Baculovirus IAP repeat), regionu wiążącego cynk, składającego się z ∼70 aminokwasów. Chociaż domena BIR jest wymagana do członkostwa w rodzinie IAP, nie wszystkie białka zawierające BIR wydają się pełnić funkcje antyapoptotyczne (19, 20, 21, 22), więc obecność domeny BIR jest konieczna, ale niewystarczająca do włączenia do tej rodziny białek. Białka IAP mogą również zawierać domenę RING lub domenę CARD (ang. caspase activation recruitment) (przegląd w pracy 18). Białka IAP zostały podzielone na trzy klasy (klasy 1, 2 i 3) w oparciu o obecność lub brak palca RING oraz homologię ich domen BIR (23).
Rodzina białek IAP. Do tej pory zidentyfikowano ośmiu ludzkich członków rodziny IAP, w oparciu o wspólne domeny BIR. Członkowie IAP mogą również zawierać domenę CARD i motyw palca RING. BRUCE posiada motyw enzymu ubikwitynacyjnego E2 (Ubc), a NAIP posiada domenę wiążącą nukleotydy (NB). Aby pogrupować białka IAP, podzielono je na trzy klasy (klasy 1-3), w oparciu o obecność lub brak palca RING i homologię ich domen BIR.
Klasa 1 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
Klasa 1 IAP zawiera homologiczne domeny BIR i motyw palca RING. X-linked IAP ma trzy domeny BIR i palec RING. Był to pierwszy zidentyfikowany IAP w tej klasie i pozostaje najlepiej scharakteryzowany. Duckett i wsp. (24) zidentyfikowali XIAP w 1996 roku podczas poszukiwania genów ssaków homologicznych do IAP bakulowirusów. Wiąże i hamuje kaspazę 3, 7 i 9 z powinowactwem nanomolarnym, ale nie wiąże i nie hamuje kaspazy 8 (25, 26). cIAP1 (znany również jako MIHB, hiap2 i BIRC2) i cIAP2 (znany również jako MIHC, hiap2 i BIRC3) są strukturalnie spokrewnione z XIAP z trzema domenami BIR i palcem RING. Te IAPs zostały zidentyfikowane poprzez biochemiczne oczyszczanie białek związanych z receptorem śmierci TNF-R2, ale ich rola przy tym receptorze pozostaje niejasna (27). cIAP1 i cIAP2 ulegają ekspresji w większości ludzkich tkanek, ale ekspresja cIAP1 jest największa w grasicy, jądrze i jajniku, a ekspresja cIAP2 jest największa w śledzionie i grasicy (27). cIAP1 i cIAP2 wiążą i hamują kaspazę 3 i 7, aczkolwiek mniej silnie niż XIAP (25). Nie hamują kaspaz 1, 6 i 8. ML-IAP (znany również jako liwina, KIAP i BIRC7) i ILP-2 mają palec RING i tylko jedną domenę BIR, ale ich domena BIR jest najbardziej homologiczna do domeny BIR3 XIAP, cIAP1 i cIAP2 (stąd ich włączenie do tej klasy). ML-IAP ulega ekspresji w prawidłowej wątrobie płodowej, nerkach, jądrach i grasicy dorosłych, a także w liniach komórkowych czerniaka i chłoniaka. ML-IAP hamuje kaspazy 3 i 9 z powinowactwem podobnym do cIAP1, ale nie wiąże się ani nie hamuje kaspaz 1, 2, 6 lub 8 (28). Ekspresja ILP-2 jest zwykle ograniczona do dorosłych jąder, ale została również udokumentowana w limfoblastoidalnej linii komórkowej. ILP-2 hamuje kaspazę 9, ale nie kaspazę 3, 7 lub 8 (29). Pozostaje do ustalenia, czy różnice w powinowactwie do kaspaz wśród różnych IAP odnoszą się do ich endogennych funkcji wewnątrzkomórkowych.
Class 2 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
Członek rodziny IAP klasy 2, NAIP, ma trzy domeny BIR, ale nie ma motywu palca RING. Jego domeny BIR są bardziej oddalone od domen BIR klasy 1 IAPs. NAIP został zidentyfikowany w 1995 r. przez Roya i wsp. (30), podczas gdy poszukiwali oni genu na 5q13 odpowiedzialnego za dziecięce rdzeniowe zaniki mięśniowe. NAIP ulega ekspresji w wątrobie dorosłych, łożysku i ośrodkowym układzie nerwowym. Hamuje kaspazy 3 i 7, ale nie kaspazy 1, 4, 5 lub 8 (31).
Class 3 Inhibitor of Apoptosis Proteins.
Class 3 IAP members, such as survivin, contain only a single BIR domain and no RING finger. Surwiwina ulega ekspresji w wątrobie płodowej, nerkach, płucach i przewodzie pokarmowym, ale nie ulega ekspresji w większości prawidłowych tkanek u dorosłych (32). Preferencyjna ekspresja surwiwiny w tkankach płodowych sugeruje, że odgrywa ona rolę w rozwoju. Surwiwina ulega częstej nadekspresji w różnych nowotworach złośliwych, w tym gruczolakorakach płuc, trzustki, okrężnicy, piersi i prostaty (32, 33, 34, 35, 36).
Różnicowa ekspresja między komórkami prawidłowymi i złośliwymi może być wykorzystana do celów terapeutycznych. Na przykład, promotor survivin może być wykorzystany jako specyficzny dla guza promotor, w którym gen zainteresowania jest włączony w złośliwych komórkach, ale nie w normalnych komórkach. Takie ukierunkowanie transkrypcyjne może być wartościowe w terapii genowej nowotworów (37). Alternatywnie, ekspresja surviviny może być wykorzystana jako marker nowotworowy do wczesnej identyfikacji złośliwości, jak szczegółowo omówiono poniżej.
Inhibitor białek apoptozy hamuje aktywne kaspazy
Hamowanie kaspaz jest najlepiej poznanym mechanizmem, przez który IAP zapobiegają apoptozie. W reakcjach enzymatycznych, rekombinowany XIAP hamuje kaspazę 3, 7 i 9, ale nie kaspazę 8. In vitro, nadekspresja XIAP w komórkach 293T zapobiega indukowanemu przez BAX i FAS rozszczepieniu prokaspazy 3 i apoptozie (38). Wpływ XIAP na aktywację kaspaz został przypisany do jego domen BIR, z domeną BIR2 hamującą kaspazy 3 i 7 oraz domeną BIR3 RING hamującą kaspazę 9.
Structural Basis of Caspase Inhibition by X-Linked Inhibitor of Apoptosis Protein.
Domena BIR2 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
Zaproponowano model „haczyka, linii i ciężarka”, aby wyjaśnić, w jaki sposób XIAP hamuje kaspazę 3 (ryc. 3)⇓. Hak” (reszty 138-146 terminusa NH2) hamuje kapazę 3, leżąc w poprzek miejsca aktywnego kaspazy, blokując w ten sposób kieszeń wiążącą substraty aktywnej kaspazy 3. Linia” przedstawia dwa wiązania peptydowe na Val147, które łączą hook z sinker. Zatapiacz” (reszty 148-150) stabilizuje interakcję pomiędzy XIAP i kaspazą 3 (40). W tym modelu, XIAP hamuje kaspazę 3 poprzez przeszkodę steryczną. Jako taki, hamuje kaspazę 3 i 7 poprzez mechanizm odmienny od peptydowych inhibitorów kaspaz, takich jak benzyloxycarbonyl-VAD-fluoromethyl keton, które konkurują z substratem kaspazy o kieszeń wiążącą.
Rys. 3.
Model hook, line, and sinker dla inhibicji kaspaz przez XIAP. Model haka, linii i ciężarka może wyjaśnić, jak XIAP hamuje kaspazę 3 przez przeszkodę steryczną. Haczyk w NH2-końcowym przedłużeniu domeny BIR2 XIAP hamuje kaspazę 3, leżąc w poprzek miejsca aktywnego kaspazy, blokując w ten sposób kieszeń wiążącą substraty aktywnej kaspazy 3. Linię tworzą dwa wiązania peptydowe, które łączą hak z ciężarem. Zapadacz stabilizuje interakcję między XIAP i kaspazą 3.
Domena BIR3 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
Wcześniejsze badania wykazały, że domena BIR3 XIAP może hamować kaspazę 9 (26, 41), ale dopiero niedawno mechanizm został wyjaśniony. Domena BIR3 XIAP tworzy heterodimer z monomeryczną kaspazą 9, zapobiegając w ten sposób dimeryzacji i aktywacji kaspazy 9. Poza tym, że zatrzymuje kaspazę 9 w formie monomerycznej, utrzymuje również miejsce aktywne kaspazy 9 w nieaktywnej konformacji (42). Tak więc interesujące jest to, że XIAP hamuje kaspazę 9 bez fizycznego dotykania miejsca aktywnego.
W rozszerzeniu badań strukturalnych zbadano wpływ mutacji w domenach BIR na antyapoptotyczne działanie XIAP. Mutacje wpływające na NH2-końcowe przedłużenie BIR2 (np. D148A) znoszą ochronną rolę XIAP w zapobieganiu apoptozie wywołanej przez ligand Fas (bodziec zewnątrzpochodnej ścieżki aktywacji kaspaz) lub Bax (bodziec wewnątrzpochodnej ścieżki aktywacji kaspaz). Z kolei mutacje wpływające na domenę BIR3 (np. W310A) zmniejszają hamowanie apoptozy przez XIAP indukowanej przez BAX, ale nie przez CD95 (43). Tak więc, mutacje te wspierają badania strukturalne wykazujące, że domena BIR2 jest wymagana do hamowania kaspazy 3 i że domena BIR3 hamuje kaspazę 9.
Survivin.
Whereas XIAP inhibits caspases 3, 7, and 9 through direct interactions, the mechanism by which survivin inhibits caspases is less clear. Według niektórych badań (44, 45), survivin wiąże się i hamuje aktywne kaspazy 3 i 7, ale nie kaspazę 8. Z kolei inne (46) nie wykrywają interakcji surviviny z kaspazą 3. W badaniu Marusawy i wsp. (47) stwierdzono, że survivin nie hamuje rekombinowanych kaspaz 3, 7 lub 9 w reakcjach enzymatycznych lub w ekstraktach cytozolowych uprzednio stymulowanych cytochromem c i dATP. Jednakże, gdy survivin jest dodawany do ekstraktów cytozolowych przed aktywacją kaspazy 9 przez dodanie cytochromu c i dATP, zapobiega on aktywacji kaspazy 3/7. Wyniki te sugerują więc, że survivina hamuje aktywną kaspazę 9, ale nie aktywną kaspazę 3 i 7, oraz że hamowanie kaspazy 9 wymaga kofaktora. W celu zidentyfikowania takiego kofaktora, Marusawa i wsp. (47) zastosowali ekran dwuhybrydowy do identyfikacji białek wiążących się z surviviną i zidentyfikowali HBXIP. W reakcjach enzymatycznych, survivina i HBXIP w połączeniu (ale żadne z tych białek osobno) hamowały aktywność kaspazy 9. Konieczne będą dodatkowe badania w celu rozstrzygnięcia tych rozbieżnych badań i rozszyfrowania mechanizmu, za pomocą którego survivin hamuje kaspazy. Ponadto, aby uogólnić znaczenie HBXIP jako niezbędnego kofaktora dla surviviny, konieczne będzie przeprowadzenie badań w innych układach komórkowych. Taka praca będzie ważnym krokiem w kierunku opracowania chemicznych inhibitorów surviviny.
Beyond Caspase Inhibition
Większość uwagi skupiła się na IAPs jako inhibitorach kaspaz, ale wiele linii dowodów wskazuje, że IAPs mogą hamować apoptozę poprzez wpływ na progresję cyklu komórkowego, podział komórek i transdukcję sygnału.
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Division.
Białka IAP prawdopodobnie odgrywają rolę w podziale komórek. Na przykład, drożdże nie mają kaspaz, ale mają homologi IAP, które zawierają jedną domenę BIR. Delecja drożdżowego IAP prowadzi do nieefektywnego tworzenia zarodników, co wskazuje, że przynajmniej u drożdży IAP odgrywa rolę w mejozie (20, 21, 22). W komórkach ssaków, survivina kolokalizuje z aparatem mitotycznym, w tym z tubuliną B, mikrotubulami, centrosomami i kinetochorami (48, 49, 50). Inhibicja survivin z przeciwciałem anty-survivin powoduje opóźnienie metafazy i produkuje komórki mitotyczne z krótszymi i mniej gęstymi wrzecionami mitotycznymi (48, 50).
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.
Dowody również implikują IAPs jako regulatory cyklu komórkowego. Na przykład, nadekspresja XIAP zatrzymuje komórki w fazie G0-G1 cyklu komórkowego, a to zatrzymanie wzrostu jest związane z obniżeniem regulacji cykliny A i D1 oraz indukcją inhibitorów kinaz zależnych od cykliny p21 i p27 (51). Ponadto, XIAP wiąże regulatory cyklu komórkowego MAGE-D1 i NRAGE, ale znaczenie tej interakcji jest niejasne (52). Surwiwina jest również zaangażowana w regulację cyklu komórkowego. W komórkach HeLa, surwiwina jest praktycznie niewykrywalna w komórkach G1 i wzrasta ∼5- i 40-krotnie odpowiednio w komórkach fazy S i G2-M (50). Zmiany w poziomach mRNA surwiwiny korelują również ze wzrostem aktywności białka i promotora surwiwiny.
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Signaling.
Rodzina białek IAP odgrywa również rolę w sygnalizacji komórkowej poprzez aktywację czynnika jądrowego (NF)-κB. XIAP i NAIP, na przykład, tworzą kompleks z kinazą TAK1 i jej kofaktorem, TAB1, który prowadzi do aktywacji c-Jun-NH2-końcowej kinazy 1 (53). Aktywowana kinaza c-Jun-NH2-końcowa 1 aktywuje następnie NF-κB poprzez kaskadę fosforylacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (54). Ponadto XIAP promuje translokację podjednostki NF-κB p65 do jądra, co jest warunkiem wstępnym dla aktywności NF-κB (55). Wreszcie, XIAP promuje degradację inhibitora NF-κB Iκβ (51).
As the role of IAPs in regulating cell division, cell cycle, and signal transduction is clarified, it will be important to identify the IAP domains responsible for these activities. Jeśli będzie możliwe zidentyfikowanie oddzielnych domen białek, które hamują kaspazy, cykl komórkowy i transdukcję sygnału, wówczas będzie można stworzyć zmutowane IAP, które rozłączą te funkcje. Ta praca mogłaby doprowadzić do rozwoju inhibitorów IAP, które specyficznie blokują hamowanie kaspaz przez IAP, podczas gdy IAP zachowują swoją rolę jako regulatory cyklu komórkowego i transdukcji sygnału.
Regulacja funkcji białka inhibitora apoptozy przez endogenne białka hamujące
Członkowie rodziny IAP są regulowani na poziomie genu, wiadomości i białka, ale szczegóły tej regulacji wykraczają poza zakres tego przeglądu. Raczej, ten przegląd będzie koncentrować się na regulacji IAPs przez endogennych białek hamujących, ponieważ służą one jako prototypy dla terapeutycznych chemicznych inhibitorów IAP.
Regulacyjne białka wiążące IAP zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w Drosophila. Wykazano, że białka Reaper, Hid, Grim (56) i Sickle (57) wiążą i hamują Drosophila IAP, DIAP1. Później zidentyfikowano ludzkie wersje Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) i Sickle (Skl), które nazwano SMAC/DIABLO i HTRA2. Te inhibitory IAP dzielą homologiczną sekwencję w ich terminusie NH2, która jest odpowiedzialna za wiązanie i hamowanie IAP (ryc. 4)⇓.
Ryc. 4.
Rodzina SMAC inhibitorów IAP. Członkowie rodziny SMAC inhibitorów IAP dzielą się homologicznym regionem NH2-końcowym. Termin NH2 jest wystarczający do wiązania domeny BIR3 XIAP.
SMAC i HTRA2.
Człowiecze SMAC i HTRA2 są białkami mitochondrialnymi, które są uwalniane wraz z cytochromem c podczas rozpadu mitochondriów. Po uwolnieniu, są one rozszczepiane do aktywnej formy. W stanie aktywnym SMAC i HTRA2 wiążą IAP, zapobiegając w ten sposób ich asocjacji z kaspazami (58, 59, 60, 61). Funkcje hamujące IAP białek z rodziny SMAC są zakodowane w ich terminusie NH2. Peptydy odpowiadające siedmiu NH2-końcowym aminokwasom są zdolne do wiązania XIAP (62). Mutacja NH2-końcowej alaniny na glicynę znosi zdolność peptydu SMAC do wiązania IAP i pełnienia funkcji proapoptotycznej (63). Po internalizacji do komórek, peptydy odpowiadające siedmiu NH2-końcowym aminokwasom SMAC są zdolne do uwrażliwienia komórek raka płuc H460 na cisplatynę i Taxol (64) oraz komórek neuroblastoma na ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworów. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku HTRA2 i inhibitorów IAP u Drosophila. Właściwości przeciwnowotworowe peptydów SMAC zostały rozszerzone na ksenograftach, gdzie przepuszczalne dla komórek wersje tych peptydów zmniejszają guzy w połączeniu z cisplatyną (64) lub TRAIL (65) odpowiednio w ksenograftach raka płuc i glejaka. Tak więc, te peptydy SMAC służą jako prototypy dla małych cząsteczek, które naśladują działania SMAC i hamują IAP i byłyby użyteczne terapeutycznie w różnych nowotworach złośliwych.
Badania strukturalne.
Zważywszy na potencjalną użyteczność kliniczną cząsteczek podobnych do SMAC, podjęto wysiłki w celu zrozumienia fizycznych interakcji pomiędzy SMAC i IAP. Badania strukturalne wykazały, że SMAC wiąże się z XIAP w dwóch różnych miejscach. NH2 terminus aktywnego SMAC (reszty 56-59) wiąże się z kieszenią BIR3 XIAP i kompetycyjnie hamuje domenę BIR3 przed wiązaniem kaspazy 9. Mutacje w domenie BIR3, które uniemożliwiają wiązanie kaspazy 9 (np. W310), uniemożliwiają również wiązanie SMAC przez domenę BIR3, co sugeruje, że miejsca wiązania SMAC i kaspazy 9 nakładają się na siebie. Jednakże miejsca wiązania nie są identyczne, ponieważ niektóre mutacje w BIR3 (np. H343A) znoszą wiązanie BIR3 do kaspazy 9, ale nie do SMAC (63, 66).
Białko SMAC o pełnej długości i NH2-końcowe peptydy wiążą również domenę BIR2 XIAP, ale z powinowactwem ∼5- do 10-krotnie niższym niż dla BIR3. Mechanizm, przez który SMAC zakłóca asocjację BIR2 z kaspazą 3 jest niejasny, ale może być związany bardziej z przeszkodą steryczną niż konkurencyjnym wiązaniem (63).
HTRA2 wiąże się z domeną BIR3 XIAP, ale ze słabszym powinowactwem niż SMAC (67). W swoim aktywnym stanie, HTRA2 istnieje jako trimer, a mutacje, które zapobiegają tworzeniu trimeru renderować HTRA2 nieaktywne. Oprócz hamowania IAP poprzez wiązanie kieszeni BIR3, HTRA2 może również rozszczepiać i inaktywować wiele IAP, w tym XIAP, cIAP1, i cIAP2, ale nie survivin (68).
SMAC β.
SMAC i HTRA2 mogą również wywierać swoją aktywność proapoptotyczną poprzez efekty niezależne od wiązania IAP. Badanie przeprowadzone przez Roberts i wsp. (69) opisało naturalnie występującą alternatywną formę splicingową SMAC, określaną jako SMAC β, w której brakowało sekwencji skierowanej do mitochondriów. SMAC β nie oddziaływał z XIAP, cIAP1 lub cIAP2, prawdopodobnie z powodu utraty jego NH2-końca. Chociaż nie jest w stanie wiązać IAP, SMAC β nasilał apoptozę indukowaną TRAIL- i VP-16 w komórkach 293. Podobnie, zmutowane wersje HTRA2 (67), które nie są w stanie wiązać IAPs, nadal są w stanie indukować apoptozę, gdy są nadekspresjonowane w komórkach raka piersi MCF7. To jest niejasne z tego badania, jak te alternatywne formy splice mogą nadal indukować apoptozę. Być może zachowują one zdolność do ubikwitynacji IAP, promując w ten sposób niszczenie IAP. Alternatywnie, SMAC i HTRA2 mogą mieć dodatkowych partnerów wiążących niezwiązanych z IAP, poprzez których wywierają wpływ proapoptotyczny. W przypadku HTRA2, ma on aktywność proteazową niezależną od jego roli w wiązaniu IAPs, a ta aktywność proteazowa może regulować apoptozę w niektórych systemach (68).
XAF1.
XAF1 jest kolejnym inhibitorem IAP. XAF1 jest białkiem jądrowym, które wiąże i sekwestruje XIAP w jądrze. W reakcjach biochemicznych, XAF1 wiąże i hamuje XIAP. W komórkach, nadekspresja XAF1 blokuje hamowanie apoptozy przez XIAP. Nie jest jednak jasne, czy sekwestracja XIAP w jądrze po prostu oddziela XIAP od kaspaz cytozolowych, czy też istnieją dodatkowe efekty związane z XIAP zlokalizowanym w jądrze (70). Cząsteczki naśladujące XAF1 prawdopodobnie działałyby inaczej niż SMAC i byłyby alternatywną strategią dla rozwoju inhibitora XIAP.
.
Domena BIR2 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
Zaproponowano model „haczyka, linii i ciężarka”, aby wyjaśnić, w jaki sposób XIAP hamuje kaspazę 3 (ryc. 3)⇓. Hak” (reszty 138-146 terminusa NH2) hamuje kapazę 3, leżąc w poprzek miejsca aktywnego kaspazy, blokując w ten sposób kieszeń wiążącą substraty aktywnej kaspazy 3. Linia” przedstawia dwa wiązania peptydowe na Val147, które łączą hook z sinker. Zatapiacz” (reszty 148-150) stabilizuje interakcję pomiędzy XIAP i kaspazą 3 (40). W tym modelu, XIAP hamuje kaspazę 3 poprzez przeszkodę steryczną. Jako taki, hamuje kaspazę 3 i 7 poprzez mechanizm odmienny od peptydowych inhibitorów kaspaz, takich jak benzyloxycarbonyl-VAD-fluoromethyl keton, które konkurują z substratem kaspazy o kieszeń wiążącą.
Model hook, line, and sinker dla inhibicji kaspaz przez XIAP. Model haka, linii i ciężarka może wyjaśnić, jak XIAP hamuje kaspazę 3 przez przeszkodę steryczną. Haczyk w NH2-końcowym przedłużeniu domeny BIR2 XIAP hamuje kaspazę 3, leżąc w poprzek miejsca aktywnego kaspazy, blokując w ten sposób kieszeń wiążącą substraty aktywnej kaspazy 3. Linię tworzą dwa wiązania peptydowe, które łączą hak z ciężarem. Zapadacz stabilizuje interakcję między XIAP i kaspazą 3.
Domena BIR3 hamuje białko X-Linked Inhibitor of Apoptosis.
Wcześniejsze badania wykazały, że domena BIR3 XIAP może hamować kaspazę 9 (26, 41), ale dopiero niedawno mechanizm został wyjaśniony. Domena BIR3 XIAP tworzy heterodimer z monomeryczną kaspazą 9, zapobiegając w ten sposób dimeryzacji i aktywacji kaspazy 9. Poza tym, że zatrzymuje kaspazę 9 w formie monomerycznej, utrzymuje również miejsce aktywne kaspazy 9 w nieaktywnej konformacji (42). Tak więc interesujące jest to, że XIAP hamuje kaspazę 9 bez fizycznego dotykania miejsca aktywnego.
W rozszerzeniu badań strukturalnych zbadano wpływ mutacji w domenach BIR na antyapoptotyczne działanie XIAP. Mutacje wpływające na NH2-końcowe przedłużenie BIR2 (np. D148A) znoszą ochronną rolę XIAP w zapobieganiu apoptozie wywołanej przez ligand Fas (bodziec zewnątrzpochodnej ścieżki aktywacji kaspaz) lub Bax (bodziec wewnątrzpochodnej ścieżki aktywacji kaspaz). Z kolei mutacje wpływające na domenę BIR3 (np. W310A) zmniejszają hamowanie apoptozy przez XIAP indukowanej przez BAX, ale nie przez CD95 (43). Tak więc, mutacje te wspierają badania strukturalne wykazujące, że domena BIR2 jest wymagana do hamowania kaspazy 3 i że domena BIR3 hamuje kaspazę 9.
Survivin.
Whereas XIAP inhibits caspases 3, 7, and 9 through direct interactions, the mechanism by which survivin inhibits caspases is less clear. Według niektórych badań (44, 45), survivin wiąże się i hamuje aktywne kaspazy 3 i 7, ale nie kaspazę 8. Z kolei inne (46) nie wykrywają interakcji surviviny z kaspazą 3. W badaniu Marusawy i wsp. (47) stwierdzono, że survivin nie hamuje rekombinowanych kaspaz 3, 7 lub 9 w reakcjach enzymatycznych lub w ekstraktach cytozolowych uprzednio stymulowanych cytochromem c i dATP. Jednakże, gdy survivin jest dodawany do ekstraktów cytozolowych przed aktywacją kaspazy 9 przez dodanie cytochromu c i dATP, zapobiega on aktywacji kaspazy 3/7. Wyniki te sugerują więc, że survivina hamuje aktywną kaspazę 9, ale nie aktywną kaspazę 3 i 7, oraz że hamowanie kaspazy 9 wymaga kofaktora. W celu zidentyfikowania takiego kofaktora, Marusawa i wsp. (47) zastosowali ekran dwuhybrydowy do identyfikacji białek wiążących się z surviviną i zidentyfikowali HBXIP. W reakcjach enzymatycznych, survivina i HBXIP w połączeniu (ale żadne z tych białek osobno) hamowały aktywność kaspazy 9. Konieczne będą dodatkowe badania w celu rozstrzygnięcia tych rozbieżnych badań i rozszyfrowania mechanizmu, za pomocą którego survivin hamuje kaspazy. Ponadto, aby uogólnić znaczenie HBXIP jako niezbędnego kofaktora dla surviviny, konieczne będzie przeprowadzenie badań w innych układach komórkowych. Taka praca będzie ważnym krokiem w kierunku opracowania chemicznych inhibitorów surviviny.
Beyond Caspase Inhibition
Większość uwagi skupiła się na IAPs jako inhibitorach kaspaz, ale wiele linii dowodów wskazuje, że IAPs mogą hamować apoptozę poprzez wpływ na progresję cyklu komórkowego, podział komórek i transdukcję sygnału.
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Division.
Białka IAP prawdopodobnie odgrywają rolę w podziale komórek. Na przykład, drożdże nie mają kaspaz, ale mają homologi IAP, które zawierają jedną domenę BIR. Delecja drożdżowego IAP prowadzi do nieefektywnego tworzenia zarodników, co wskazuje, że przynajmniej u drożdży IAP odgrywa rolę w mejozie (20, 21, 22). W komórkach ssaków, survivina kolokalizuje z aparatem mitotycznym, w tym z tubuliną B, mikrotubulami, centrosomami i kinetochorami (48, 49, 50). Inhibicja survivin z przeciwciałem anty-survivin powoduje opóźnienie metafazy i produkuje komórki mitotyczne z krótszymi i mniej gęstymi wrzecionami mitotycznymi (48, 50).
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Cycle Progression.
Dowody również implikują IAPs jako regulatory cyklu komórkowego. Na przykład, nadekspresja XIAP zatrzymuje komórki w fazie G0-G1 cyklu komórkowego, a to zatrzymanie wzrostu jest związane z obniżeniem regulacji cykliny A i D1 oraz indukcją inhibitorów kinaz zależnych od cykliny p21 i p27 (51). Ponadto, XIAP wiąże regulatory cyklu komórkowego MAGE-D1 i NRAGE, ale znaczenie tej interakcji jest niejasne (52). Surwiwina jest również zaangażowana w regulację cyklu komórkowego. W komórkach HeLa, surwiwina jest praktycznie niewykrywalna w komórkach G1 i wzrasta ∼5- i 40-krotnie odpowiednio w komórkach fazy S i G2-M (50). Zmiany w poziomach mRNA surwiwiny korelują również ze wzrostem aktywności białka i promotora surwiwiny.
Inhibitor of Apoptosis Proteins Regulate Cell Signaling.
Rodzina białek IAP odgrywa również rolę w sygnalizacji komórkowej poprzez aktywację czynnika jądrowego (NF)-κB. XIAP i NAIP, na przykład, tworzą kompleks z kinazą TAK1 i jej kofaktorem, TAB1, który prowadzi do aktywacji c-Jun-NH2-końcowej kinazy 1 (53). Aktywowana kinaza c-Jun-NH2-końcowa 1 aktywuje następnie NF-κB poprzez kaskadę fosforylacji kinazy białkowej aktywowanej mitogenami (54). Ponadto XIAP promuje translokację podjednostki NF-κB p65 do jądra, co jest warunkiem wstępnym dla aktywności NF-κB (55). Wreszcie, XIAP promuje degradację inhibitora NF-κB Iκβ (51).
As the role of IAPs in regulating cell division, cell cycle, and signal transduction is clarified, it will be important to identify the IAP domains responsible for these activities. Jeśli będzie możliwe zidentyfikowanie oddzielnych domen białek, które hamują kaspazy, cykl komórkowy i transdukcję sygnału, wówczas będzie można stworzyć zmutowane IAP, które rozłączą te funkcje. Ta praca mogłaby doprowadzić do rozwoju inhibitorów IAP, które specyficznie blokują hamowanie kaspaz przez IAP, podczas gdy IAP zachowują swoją rolę jako regulatory cyklu komórkowego i transdukcji sygnału.
Regulacja funkcji białka inhibitora apoptozy przez endogenne białka hamujące
Członkowie rodziny IAP są regulowani na poziomie genu, wiadomości i białka, ale szczegóły tej regulacji wykraczają poza zakres tego przeglądu. Raczej, ten przegląd będzie koncentrować się na regulacji IAPs przez endogennych białek hamujących, ponieważ służą one jako prototypy dla terapeutycznych chemicznych inhibitorów IAP.
Regulacyjne białka wiążące IAP zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w Drosophila. Wykazano, że białka Reaper, Hid, Grim (56) i Sickle (57) wiążą i hamują Drosophila IAP, DIAP1. Później zidentyfikowano ludzkie wersje Reaper (Rpr), Hid, Grim (Grm) i Sickle (Skl), które nazwano SMAC/DIABLO i HTRA2. Te inhibitory IAP dzielą homologiczną sekwencję w ich terminusie NH2, która jest odpowiedzialna za wiązanie i hamowanie IAP (ryc. 4)⇓.
Rodzina SMAC inhibitorów IAP. Członkowie rodziny SMAC inhibitorów IAP dzielą się homologicznym regionem NH2-końcowym. Termin NH2 jest wystarczający do wiązania domeny BIR3 XIAP.
SMAC i HTRA2.
Człowiecze SMAC i HTRA2 są białkami mitochondrialnymi, które są uwalniane wraz z cytochromem c podczas rozpadu mitochondriów. Po uwolnieniu, są one rozszczepiane do aktywnej formy. W stanie aktywnym SMAC i HTRA2 wiążą IAP, zapobiegając w ten sposób ich asocjacji z kaspazami (58, 59, 60, 61). Funkcje hamujące IAP białek z rodziny SMAC są zakodowane w ich terminusie NH2. Peptydy odpowiadające siedmiu NH2-końcowym aminokwasom są zdolne do wiązania XIAP (62). Mutacja NH2-końcowej alaniny na glicynę znosi zdolność peptydu SMAC do wiązania IAP i pełnienia funkcji proapoptotycznej (63). Po internalizacji do komórek, peptydy odpowiadające siedmiu NH2-końcowym aminokwasom SMAC są zdolne do uwrażliwienia komórek raka płuc H460 na cisplatynę i Taxol (64) oraz komórek neuroblastoma na ligand indukujący apoptozę związany z czynnikiem martwicy nowotworów. Podobne wyniki zaobserwowano w przypadku HTRA2 i inhibitorów IAP u Drosophila. Właściwości przeciwnowotworowe peptydów SMAC zostały rozszerzone na ksenograftach, gdzie przepuszczalne dla komórek wersje tych peptydów zmniejszają guzy w połączeniu z cisplatyną (64) lub TRAIL (65) odpowiednio w ksenograftach raka płuc i glejaka. Tak więc, te peptydy SMAC służą jako prototypy dla małych cząsteczek, które naśladują działania SMAC i hamują IAP i byłyby użyteczne terapeutycznie w różnych nowotworach złośliwych.
Badania strukturalne.
Zważywszy na potencjalną użyteczność kliniczną cząsteczek podobnych do SMAC, podjęto wysiłki w celu zrozumienia fizycznych interakcji pomiędzy SMAC i IAP. Badania strukturalne wykazały, że SMAC wiąże się z XIAP w dwóch różnych miejscach. NH2 terminus aktywnego SMAC (reszty 56-59) wiąże się z kieszenią BIR3 XIAP i kompetycyjnie hamuje domenę BIR3 przed wiązaniem kaspazy 9. Mutacje w domenie BIR3, które uniemożliwiają wiązanie kaspazy 9 (np. W310), uniemożliwiają również wiązanie SMAC przez domenę BIR3, co sugeruje, że miejsca wiązania SMAC i kaspazy 9 nakładają się na siebie. Jednakże miejsca wiązania nie są identyczne, ponieważ niektóre mutacje w BIR3 (np. H343A) znoszą wiązanie BIR3 do kaspazy 9, ale nie do SMAC (63, 66).
Białko SMAC o pełnej długości i NH2-końcowe peptydy wiążą również domenę BIR2 XIAP, ale z powinowactwem ∼5- do 10-krotnie niższym niż dla BIR3. Mechanizm, przez który SMAC zakłóca asocjację BIR2 z kaspazą 3 jest niejasny, ale może być związany bardziej z przeszkodą steryczną niż konkurencyjnym wiązaniem (63).
HTRA2 wiąże się z domeną BIR3 XIAP, ale ze słabszym powinowactwem niż SMAC (67). W swoim aktywnym stanie, HTRA2 istnieje jako trimer, a mutacje, które zapobiegają tworzeniu trimeru renderować HTRA2 nieaktywne. Oprócz hamowania IAP poprzez wiązanie kieszeni BIR3, HTRA2 może również rozszczepiać i inaktywować wiele IAP, w tym XIAP, cIAP1, i cIAP2, ale nie survivin (68).
SMAC β.
SMAC i HTRA2 mogą również wywierać swoją aktywność proapoptotyczną poprzez efekty niezależne od wiązania IAP. Badanie przeprowadzone przez Roberts i wsp. (69) opisało naturalnie występującą alternatywną formę splicingową SMAC, określaną jako SMAC β, w której brakowało sekwencji skierowanej do mitochondriów. SMAC β nie oddziaływał z XIAP, cIAP1 lub cIAP2, prawdopodobnie z powodu utraty jego NH2-końca. Chociaż nie jest w stanie wiązać IAP, SMAC β nasilał apoptozę indukowaną TRAIL- i VP-16 w komórkach 293. Podobnie, zmutowane wersje HTRA2 (67), które nie są w stanie wiązać IAPs, nadal są w stanie indukować apoptozę, gdy są nadekspresjonowane w komórkach raka piersi MCF7. To jest niejasne z tego badania, jak te alternatywne formy splice mogą nadal indukować apoptozę. Być może zachowują one zdolność do ubikwitynacji IAP, promując w ten sposób niszczenie IAP. Alternatywnie, SMAC i HTRA2 mogą mieć dodatkowych partnerów wiążących niezwiązanych z IAP, poprzez których wywierają wpływ proapoptotyczny. W przypadku HTRA2, ma on aktywność proteazową niezależną od jego roli w wiązaniu IAPs, a ta aktywność proteazowa może regulować apoptozę w niektórych systemach (68).
XAF1.
XAF1 jest kolejnym inhibitorem IAP. XAF1 jest białkiem jądrowym, które wiąże i sekwestruje XIAP w jądrze. W reakcjach biochemicznych, XAF1 wiąże i hamuje XIAP. W komórkach, nadekspresja XAF1 blokuje hamowanie apoptozy przez XIAP. Nie jest jednak jasne, czy sekwestracja XIAP w jądrze po prostu oddziela XIAP od kaspaz cytozolowych, czy też istnieją dodatkowe efekty związane z XIAP zlokalizowanym w jądrze (70). Cząsteczki naśladujące XAF1 prawdopodobnie działałyby inaczej niż SMAC i byłyby alternatywną strategią dla rozwoju inhibitora XIAP.
.