Integrative genomic analyses of APOBEC-mutational signature, expression and germline deletion of APOBEC3 genes, and immunogenicity in multiple cancer types

Distinct patterns of the APOBEC3 genes, związane z sygnaturą mutacyjną APOBEC w wielu typach raka

Podążając za poprzednią analizą sygnatury mutacyjnej APOBEC, zmierzyliśmy mutacje za pomocą liczby deaminaz C, które znajdowały się w obrębie motywu trinukleotydowego TCW zmiany na T lub G mutacji na każdą próbkę w 10 typach raka (patrz Metody). Przeprowadziliśmy analizy jednoczynnikowe, aby ocenić asocjacje sygnatury mutacji APOBEC z ogólnym poziomem ekspresji genów APOBEC3A i APOBEC3B. Zaobserwowaliśmy, że poziom ekspresji APOBEC3A był pozytywnie związany z sygnaturą APOBEC-mutacji w sześciu typach raka – pęcherza moczowego, piersi, szyjki macicy, gruczolakoraka płuc, głowy i szyi oraz tarczycy. W pozostałych typach nowotworów nie zaobserwowano znaczących asocjacji, chociaż obserwowano te same kierunki asocjacji (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że poziom ekspresji APOBEC3B był pozytywnie związany z sygnaturą APOBEC-mutacyjną we wszystkich typach nowotworów, z wyjątkiem raka płaskonabłonkowego płuc (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). W porównaniu ze skojarzeniami z APOBEC3A, APOBEC3B był szczególnie związany z sygnaturą APOBEC-mutacji w rakach żołądka, trzustki i nerki, z P = 5,2 × 10- 11, P = 2,0 × 10- 3 i P = 1,1 × 10- 4, odpowiednio (Dodatkowy plik 1: Tabela S1). Wyniki te były zgodne z wcześniejszymi badaniami . Ponadto ocenialiśmy również skojarzenia sygnatury mutacji APOBEC z ekspresją genów innych genów APOBEC3: APOBEC3C, APOBEC3D, APOBEC3F, APOBEC3G i APOBEC3H. Nasze wyniki wykazały, że ekspresja tych genów związana z sygnaturą mutacyjną APOBEC była różna w różnych typach nowotworów (Dodatkowy plik 1: Tabela S2). Na przykład, ekspresja APOBEC3C była związana z podwyższoną sygnaturą mutacyjną APOBEC w raku szyjki macicy oraz głowy i szyi, podczas gdy jego ekspresja była związana z obniżoną sygnaturą mutacyjną APOBEC w raku żołądka. Nasze wyniki wykazały również, że ekspresja APOBEC3D, APOBEC3F i APOBEC3G była związana ze zwiększoną sygnaturą mutacji APOBEC, podczas gdy wynik stowarzyszenia APOBEC3G był zgodny z wcześniejszymi ustaleniami. Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że ekspresja APOBEC3H była związana ze zwiększoną sygnaturą mutacji APOBEC w raku szyjki macicy, ale nie zaobserwowano jej w raku piersi.

Distinct patterns of the isoforms of APOBEC3A and APOBEC3B, associated with APOBEC-mutational signature in multiple cancer types

We further evaluated associations between APOBEC-mutational signature and expression levels of each of the isoforms transcribed from APOBEC3A and APOBEC3B. Przeanalizowano w sumie sześć izoform, w tym uc003awn i uc011aob transkrybowane z APOBEC3A, uc003awo, uc003awp i uc003awq transkrybowane z APOBEC3B, oraz kolejną izoformę, uc011aoc, pochodzącą z wydarzenia fuzyjnego zaangażowanego w region obejmujący ostatni intron APOBEC3A do ostatniego eksonu APOBEC3B (ryc. 1a, b). Potwierdziliśmy, że izoformy uc003awn i uc003awo były pierwotnie transkrybowane odpowiednio z APOBEC3A i APOBEC3B (plik dodatkowy 1: Figura S1) . Zgodnie z oczekiwaniami, kierunek asocjacji zarówno poziomów ekspresji uc003awn i uc003awo, jak i sygnatury mutacji APOBEC był zgodny z obserwacjami ogólnych poziomów ekspresji genów we wszystkich typach nowotworów (ryc. 1c, d; Dodatkowy plik 1: Tabela S3). Zaskakująco, poziom ekspresji uc011aoc (APOBEC3A/B) był pozytywnie związany z sygnaturą APOBEC-mutacji tylko w raku piersi (P = 5,0 × 10- 10) (ryc. 1e; plik dodatkowy 1: tabela S3). Nie zaobserwowano natomiast żadnych asocjacji dla pozostałych izoform w żadnym typie nowotworu, z wyjątkiem słabej asocjacji zaobserwowanej dla uc011aob (APOBEC3A) z rakiem głowy i szyi (P = 0,02; plik dodatkowy 1: Tabela S3).

Stosując analizy regresji wielokrotnej, które obejmowały wszystkie izoformy zarówno APOBEC3A, jak i APOBEC3B, stwierdziliśmy, że poziomy ekspresji uc003awn (APOBEC3A) i uc003awo (APOBEC3B) były niezależnie i powszechnie związane z ocenianą sygnaturą mutacji APOBEC w wielu typach nowotworów: pęcherza moczowego (marginalna asocjacja dla uc003awn), piersi, szyjki macicy, gruczolakoraka płuc oraz głowy i szyi (Tabela 1). Podobnie, dodatkową asocjację dla uc011awn (APOBEC3A) zaobserwowano w tarczycy, a asocjację dla uc003awo (APOBEC3B) w raku żołądka, trzustki i nerki. Zgodnie z analizą jednoczynnikową, uderzającą asocjację dla uc011aoc (APOBEC3A/B) z sygnaturą mutacji APOBEC zaobserwowano w raku piersi (P = 5,3 × 10- 11), a dodatkową asocjację zaobserwowano również w gruczolakoraku płuc (P = 0,01) (Tabela 1). Wyniki te sugerują, że uc011aoc odgrywa specyficzną tkankowo rolę w oddziaływaniu na sygnaturę mutacyjną APOBEC głównie w raku piersi, podczas gdy uc003awn i uc003awo odgrywają wszechobecną, ale odrębną rolę w całym spektrum ludzkich nowotworów. Co ważne, nasza dodatkowa analiza wykazała pozytywną korelację ekspresji między izoformą uc011aoc i APOBEC3A w wielu typach nowotworów, zwłaszcza w raku piersi (plik dodatkowy 1: Tabela S4).

W dodatku przeprowadziliśmy analizę asocjacji stratyfikowaną według podtypów klinicznych w raku piersi. Zaobserwowaliśmy, że asocjacje izoform uc003awn (APOBEC3A) i uc011aoc (APOBEC3A/B) z sygnaturą mutacyjną APOBEC różniły się w różnych podtypach klinicznych, przy czym najbardziej znaczącą asocjację zaobserwowano w podtypie LumA (plik dodatkowy 1: Tabela S5).

Germline APOBEC3A/B deletion affecting expression levels of isoforms of the APOBEC3A and APOBEC3B genes

Aby zbadać, jak germline APOBEC3A/B deletion affects expression of the isoforms of APOBEC3A and APOBEC3B, najpierw zidentyfikowaliśmy 30 próbek przewidywanych jako nosiciele homozygotycznej delecji, 239 próbek przewidywanych jako nosiciele heterozygotycznej delecji i 2287 próbek przewidywanych jako nieposiadające delecji (plik dodatkowy 1: Tabela S6, patrz Metody). Następnie oceniliśmy związki między germinalną delecją APOBEC3A/B a poziomem ekspresji każdej izoformy za pomocą analizy jednoczynnikowej (patrz Metody). Zgodnie z oczekiwaniami zaobserwowaliśmy, że delecja germline APOBEC3A/B była znacząco związana z obniżonym poziomem ekspresji izoformy uc003awo (APOBEC3B) we wszystkich typach nowotworów przy P < 0,05, z wyjątkiem raka trzustki z P = 0,14. Istotne związki z obniżonym poziomem ekspresji uc003awn (APOBEC3A) zaobserwowano również w trzech typach nowotworów – pęcherza moczowego, piersi i tarczycy (ryc. 2; tabela 2). Natomiast nasze wyniki wykazały, że delecja germinalna APOBEC3A/B była istotnie związana z podwyższonym poziomem ekspresji uc011aoc (APOBEC3A/B) we wszystkich typach nowotworów, z wyjątkiem raka żołądka, trzustki i nerki. W ich przypadku nie było istotności statystycznej, ale miały te same kierunki asocjacji (ryc. 2; tab. 2). W szczególności, rak głowy i szyi wykazał najbardziej znaczące skojarzenie z P = 3,8 × 10- 65, a raki piersi i pęcherza moczowego wykazały znaczące skojarzenie z P = 3,0 × 10- 8 i P = 2,9 × 10- 7, odpowiednio. Dodatkowo przeprowadziliśmy tę samą analizę, stratyfikowaną według populacji, i podobną tendencję zaobserwowano w tych typach nowotworów (dane nie pokazane). Nasze wyniki sugerują, że w prawie wszystkich badanych typach nowotworów, germinalna delecja APOBEC3A/B była znacząco związana z obniżonym poziomem ekspresji uc003awn i uc003awo, ale występował zwiększony poziom ekspresji uc011aoc.

Delecja germline APOBEC3A/B wpływająca na APOBEC-mutational signature, Poprzednie badania wykazały, że delecja germinalna APOBEC3A/B jest związana z podwyższoną sygnaturą mutacji APOBEC w raku piersi, podczas gdy podobny wzorzec, ale bez istotności statystycznej, zaobserwowano w wielu innych typach nowotworów, takich jak pęcherz moczowy. Stosując analizę jednoczynnikową, aby ocenić ogólny wpływ germinalnej delecji APOBEC3A/B na sygnaturę mutacji APOBEC, stwierdziliśmy, że delecja była istotnie związana ze zwiększoną sygnaturą mutacji APOBEC tylko w raku piersi (P = 5,6 × 10- 3; Tabela 3; Ryc. 3a). Jednak przeciwny trend zaobserwowano w większości innych typów nowotworów, chociaż większość skojarzeń nie była statystycznie istotna (Tabela 3). W szczególności w raku pęcherza moczowego zaobserwowaliśmy, że delecja germinalna APOBEC3A/B była istotnie związana z obniżoną sygnaturą mutacyjną APOBEC (P = 1,7 × 10- 3; Tabela 3). Aby dokładniej wyjaśnić, czy wpływ germinalnej delecji APOBEC3A/B na sygnaturę mutacji APOBEC jest spowodowany jej wpływem na ekspresję genów, dalej ocenialiśmy związki między sygnaturą mutacji APOBEC a delecją z dostosowaniem do ekspresji izoform (patrz Metody). Podobnie, nasze wyniki wykazały, że delecja germline APOBEC3A/B była istotnie związana ze zwiększoną sygnaturą mutacji APOBEC tylko w raku piersi (P = 2,8 × 10- 6; Tabela 3; Ryc. 3b). Zaobserwowano większą wielkość efektu (Beta = – 0,620) delecji z dostosowaną ekspresją izoform w porównaniu z początkową obserwacją ogólnego efektu (Beta = – 0,281; Tabela 3). Aby ocenić, czy delecja germinalna może przyczynić się do proporcji sygnatury APOBEC-mutacji, przeanalizowaliśmy również proporcję sygnatury APOBEC-mutacji w stosunku do całkowitej liczby mutacji dla każdej próbki (patrz Metody). Zgodnie z początkową obserwacją sygnatury APOBEC-mutacji, zaobserwowaliśmy, że delecja germinalna była znacząco związana ze zwiększoną proporcją sygnatury APOBEC-mutacji tylko w raku piersi (Beta = – 0,287, P = 4,8 × 10- 3 i Beta = – 0,5, P = 1,4 × 10- 4 dla ogólnego efektu i efektów z dostosowaną ekspresją genów; patrz Tabela 3). Wyniki te wskazują, że germinalna delecja APOBEC3A/B, która prowadzi do zwiększonej sygnatury mutacyjnej APOBEC, jest prawdopodobnie spowodowana odrębną funkcją uc011aoc transkrybowaną z delecji, oprócz jej wpływu na zwiększoną ekspresję uc011aoc. Zanotowano, że haplotyp I APOBEC3H (APOBEC3H-I) może w znacznym stopniu przyczyniać się do sygnatury mutacyjnej APOBEC w próbkach niosących germinalne delecje APOBEC3A/B w raku piersi. Dalej analizowaliśmy haplotyp APOBEC3H-I dla łącznie 76 próbek, w których przewidywano występowanie germinalnych delecji APOBEC3A/B (patrz Metody). Nasze wyniki wykazały, że sygnatura mutacji APOBEC nie była znacząco skorelowana z haplotypem APOBEC3H-I, niezależnie od próbek, w których przewidywano homozygotyczne lub heterozygotyczne delecje germinalne APOBEC3A/B (Dane nie pokazane). Jednak nasze odkrycia są zgodne z wcześniejszymi ustaleniami, że białko APOBEC3A/B, generowane przez delecję, ma wyższy poziom ekspresji niż białko APOBEC3A w oparciu o badania z testów funkcjonalnych in vitro.

Germline APOBEC3A/B deletion associated with APOBEC-mutational signature, neoantigen loads and relative composition of T cells (CD8+) in breast cancer. Znamiennie wyższa bezwzględna (a) i względna (b) sygnatura mutacji APOBEC, ładunki neoantygenów (c) i względny skład komórek T (CD8+) (d) w próbkach przewidywanych jako niosące homozygotyczną i heterozygotyczną delecję w porównaniu z próbkami przewidywanymi jako nieposiadające delecji w raku piersi

Aby dalej zbadać odrębną funkcję i potencjalne szlaki, w które może być zaangażowana ekspresja izoformy uc011aoc (transkrybowanej z delecji APOBEC3A/B), przeanalizowaliśmy geny, które były współekspresjonowane z izoformą uc011aoc w próbkach przewidywanych jako nosiciele germinalnych delecji APOBEC3A/B (patrz Metody). Analiza wzbogacenia w kanoniczne szlaki sygnałowe przy użyciu IPA ujawniła, że te współekspresjonowane geny były znacząco wzbogacone w różne kanoniczne szlaki zróżnicowane w różnych typach nowotworów. W szczególności, zaobserwowaliśmy, że najlepiej wzbogacone ścieżki to sygnalizacja HIPPO dla pęcherza moczowego, sygnalizacja PTEN dla piersi, sygnalizacja iNOS i Interferonu dla gruczolakoraka płuc, hydroliza Acylo-CoA dla żołądka, naprawa podwójnej nici DNA i α-oksydacja kwasów tłuszczowych dla trzustki, sygnalizacja EIF2 dla tarczycy i integracja GPCR-Mediated dla nerki (P < 0,01 dla wszystkich; Dodatkowy plik 1: Tabela S7). Dodatkowo, funkcjonalne wzbogacenie w Śmierć komórki i przeżycie było powszechnie obserwowane w wielu typach raka, w tym pęcherza moczowego, piersi, szyjki macicy, gruczolakoraka płuc i raka płuc (P < 0,05 dla wszystkich).

Dalej ocenialiśmy związek między germline APOBEC3A/B delecją a ładunkami neoantygenów. Zgodnie z obserwacją sygnatury mutacyjnej APOBEC, nasze wyniki wykazały, że delecja germline APOBEC3A/B była istotnie związana ze zwiększonym ładunkiem neoantygenów tylko w raku piersi (P = 6,5 × 10- 3; ryc. 3c), podczas gdy przeciwny trend zaobserwowano w wielu innych typach nowotworów (plik dodatkowy 1: tabela S8). Podobnie stwierdziliśmy, że delecja germinalna była marginalnie związana ze względną obfitością składu komórek T (CD8+) w TILs, ale tylko w raku piersi (P = 0,08; Figura 3d). Znaczące stowarzyszenie wykryto, gdy przeczesaliśmy próbki zarówno z homozygotycznymi, jak i heterozygotycznymi delecjami i porównaliśmy je z próbkami z nienośnymi delecjami (test Wilcoxon signed-rank, P < 0,05). Nie zaobserwowano jednak związku z innymi komórkami immunologicznymi. Nasze wyniki wykazały, że germinalna delecja APOBEC3A/B odgrywa specyficzną tkankowo rolę w oddziaływaniu na sygnaturę mutacyjną APOBEC i immunogenność w raku piersi, prawdopodobnie wzmacniając ustalenia poprzednich badań asocjacyjnych obejmujących cały genom, dotyczących potencjalnych mechanizmów ich powiązania ze zwiększonym ryzykiem raka piersi.

Podpis mutacyjny APOBEC znacząco przyczyniający się do neoantygenów

Aby zbadać, w jakim stopniu sygnatura mutacyjna APOBEC przyczynia się do neoantygenów, przeanalizowaliśmy przewidywane ładunki neoantygenów dla każdej próbki zebranej z poprzedniego badania (patrz Metody). Używając analizy jednoczynnikowej, oceniliśmy asocjacje pomiędzy sygnaturą mutacji APOBEC a ładunkiem neoantygenów dla każdego typu nowotworu. Zgodnie z oczekiwaniami, sygnatura mutacji APOBEC była pozytywnie związana z ładunkiem neoantygenów we wszystkich typach raka (P < 1,0 × 10- 4 dla wszystkich porównań), podczas gdy najlepsze znaczące asocjacje zaobserwowano w typach piersi i pęcherza moczowego, odpowiednio z P = 5,1 × 10- 125 i P = 1,5 × 10- 90 (Dodatkowy plik 1: Tabela S9). Podobnie zaobserwowano ogólny pozytywny trend asocjacyjny między przewidywanymi ładunkami neoantygenów a proporcją sygnatury mutacyjnej APOBEC, z wyjątkiem raka żołądka (ryc. 4; plik dodatkowy 1: tabela S10). W szczególności, znaczące asocjacje obserwowano w wielu typach nowotworów, w tym pęcherza moczowego, piersi, szyjki macicy, gruczolakoraka płuc, głowy i szyi oraz tarczycy. W szczególności rak piersi i pęcherza moczowego wykazały najlepsze asocjacje z P = 8,9 × 10- 29 i P = 2,8 × 10- 27, odpowiednio (plik dodatkowy 1: Tabela S10). Nasze wyniki sugerują, że sygnatura mutacyjna APOBEC odgrywa znaczącą rolę w przyczynianiu się do biogenezy neoantygenów w raku człowieka.

Associations between relative abundance of immune cell compositions in TILs with neoantigen load and APOBEC-mutational signature

Associations between relative abundance of neoantigen load and TILs, użyliśmy danych ekspresji genów w tkankach guza, aby zmierzyć obfitość względnych kompozycji komórkowych każdego typu komórek odpornościowych, w tym komórek B naiwnych, komórek B pamięci, komórek T CD8 i komórek T CD4 aktywowanych pamięcią w TILs (patrz Metody). Używając analizy jednoczynnikowej, oceniliśmy związek między obciążeniem neoantygenem a względną obfitością kompozycji komórek odpornościowych dla każdego typu nowotworu. Zaobserwowaliśmy, że istniał pozytywny trend asocjacyjny między ładunkiem neoantygenów a typami aktywowanymi pamięcią zarówno komórek T CD8+, jak i CD4+ we wszystkich typach raka, z wyjątkiem tarczycy i nerki (test dwumianowy P = 0,11 i P = 0,02 odpowiednio dla typów aktywowanych pamięcią komórek T CD8+ i CD4+). Przeciwny wzór zaobserwowano zarówno dla typów komórek B naiwnych, jak i pamięci we wszystkich typach nowotworów, z wyjątkiem gruczolakoraka płuc (test dwumianowy P = 0,02 i P = 2,2 × 10- 16 odpowiednio dla typów komórek B naiwnych i pamięci). W szczególności nasze wyniki wykazały, że ładunki neoantygenów miały związek ze względną liczebnością zarówno komórek T CD8+ i CD4+ aktywowanych pamięcią, jak i typów komórek B naiwnych i pamięci w raku pęcherza moczowego. W raku piersi stwierdzono asocjację dla typów komórek B naiwnych i pamięci, a typów komórek T CD4 aktywowanych pamięcią w gruczolakoraku płuc, raku głowy i szyi oraz raku trzustki (Dodatkowy plik 1: Tabela S11). Ponieważ sygnatura mutacyjna APOBEC istotnie przyczyniała się do powstawania neoantygenów, dodatkowo oceniliśmy asocjację pomiędzy względną liczebnością składów komórek odpornościowych w TILs a sygnaturą mutacyjną APOBEC. Zgodnie z obserwacjami z analizy asocjacyjnej ładunku naeoantygenu, podobny wzór został znaleziony również dla sygnatury mutacyjnej APOBEC (Dodatkowy plik 1: Tabela S12). Nasze wyniki sugerują, że sygnatura mutacji APOBEC ma wpływ na zdolności immunogenne raka, takie jak przyciąganie określonych komórek odpornościowych w TILs, prawdopodobnie pośredniczone przez zwiększony ładunek neoantygenów.