Isolation, characterization and toxicological potential of Alternaria-mycotoxins (TeA, AOH i AME) w różnych gatunkach Alternaria z różnych regionów Indii

Zbieranie i izolacja gatunków Alternaria

Zainfekowane części, takie jak liście, owoce i łodygi chorych roślin z różnych regionów Indii, zostały zebrane i przywiezione do laboratorium. Próbki liści sterylizowano powierzchniowo 0,5% roztworem podchlorynu sodu, przemywano kilkakrotnie sterylną wodą destylowaną (SDW) i umieszczano na podłożu agarowym z dekstrozy ziemniaczanej (PDA) w szalkach Petriego na 3-4 dni. Płytki PDA zawierające zainfekowane fragmenty liści inkubowano w temperaturze 28°C w fotoperiodzie 12 h światło/ciemność przez 6-10 dni57. Aby uniknąć kontaminacji bakteryjnej, do pożywki dodawano streptomycynę. Konidia wytwarzano pojedynczo w celu uzyskania czystych kolonii, które umieszczano na wysterylizowanej bibule filtracyjnej.

Test patogeniczności

W celu określenia form specjalnych, przeprowadzono analizę wirulencji izolatów na odmianach pomidora wrażliwych na Alternaria. W sumie 60 izolatów Alternaria zostało przebadanych pod kątem patogeniczności. Nasiona pomidora spulchniano w podchlorynie sodu, płukano w wodzie wodociągowej, a następnie suszono na powietrzu. Rośliny uprawiano oddzielnie w doniczkach. Warunki fizjologiczne, takie jak temperatura i wilgotność powietrza dla wzrostu roślin, utrzymywano odpowiednio na poziomie 28-32°C i 40-60% wilgotności względnej. Utrzymywano optymalne stężenie inokulów (2 × 106 zarodników/ml) i opryskiwano nimi powierzchnię liści. Rośliny doświadczalne utrzymywano w komorach rosy przez 8 h w temperaturze 25 °C. Rośliny te były regularnie monitorowane przez 2-3 dni pod kątem nasilenia infekcji i rozwoju choroby w stosunku do liścia kontrolnego, który nie był inokulowany. Symptomy zaczęły być widoczne 1 dzień po opryskaniu inokulacją zarodników. Nasilenie choroby oceniano od 1 dnia po inokulacji do 6 dni. Dane poddano analizie statystycznej za pomocą analizy wariancji (ANOVA) i testu Duncana (P ≤ 0,05).

Ekstrakcja DNA i identyfikacja patogenu

Patogen został wstępnie zidentyfikowany na podstawie cech morfologicznych, w tym wielkości i kształtu, i strukturę konidiów, a następnie potwierdzono amplifikacją ITS przy użyciu uniwersalnych starterów ITS1 (5′-TCCGTAGTGAACCTGCGG-3′) i ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATGATGC-3′) amplifikujących regiony ITS i 5.8S kodujących geny gatunków grzybów. Ekstrakcję DNA przeprowadzono zgodnie z metodą zaproponowaną przez Doyle’a i Doyle’a58. Liofilizowaną matę grzybni o masie 0,5 g rozcierano w moździerzu i tłuczku z użyciem 10 ml buforu ekstrakcyjnego CTAB, a następnie inkubowano w temperaturze 65°C w łaźni wodnej przez 30 min. Następnie próbkę zmieszano z równą objętością schłodzonego chloroformu/alkoholu izoamylowego i delikatnie wymieszano, po czym wirowano przy 10 000 obr/min przez 10 min w 4 °C. Otrzymany w ten sposób supernatant mieszano z równą objętością izopropanolu i pozostawiano na 2 h w temperaturze 4 °C. Próbkę ponownie odwirowano przy 10000 obr/min przez 10 min w temp. 4 °C. Następnie osad płukano 70% etanolem i suszono na powietrzu przez 4 h w celu usunięcia śladów alkoholu. Reakcję amplifikacji ITS rDNA przeprowadzono w 25 μl mieszaniny reakcyjnej zawierającej 2,5 μl 10X buforu reakcyjnego, 5 μl każdego trifosforanu deoksyrybonukleotydu (dNTP), po 1,0 μl uniwersalnego primera forward ITS i regionu 5,8 S (ITS1) oraz primera reverse (ITS4), 0,3 μl polimerazy Taq DNA, 10-100 ng DNA i 2,5 μl MgCl2. Optymalny profil termiczny PCR obejmował wstępną denaturację w temp. 95 °C przez 3 min, denaturację w temp. 95 °C przez 30 sek, annealizację w temp. 70 °C przez 30 sek i końcowe przedłużenie w temp. 72 °C przez 1 min z dodatkowymi 40 cyklami. Amplifikację potwierdzano na 1% żelach agarozowych w 0,5X buforze TBE, prowadzono równolegle ze standardowym markerem masy cząsteczkowej DNA i wizualizowano w transiluminatorze UV.

Analiza sekwencji ITS

Uzyskane regiony ITS rDNA wybranych izolatów poddawano dalszemu cięciu i oczyszczaniu przy użyciu zestawu QIAquick PCR purification kit (QIAGEN, Niemcy), zgodnie z instrukcjami producenta. Oczyszczone produkty zostały wysłane do SciGenome Cochin, Kerala, Indie w celu sekwencjonowania. Sekwencje zostały porównane z sekwencjami w GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) przy użyciu NCBI BLAST. Analizę BLAST przeprowadzono z sekwencjami ITS o pełnej długości jako zapytaniami w celu wykrycia związków z opublikowanymi sekwencjami. Najwyższy stopień homologii i sumaryczny wynik były brane pod uwagę w dalszej analizie. Sekwencje uzyskane w niniejszej pracy zostały przesłane do GenBank. Sekwencje ITS szczepów Alternaria z innych formae speciale pobrano z bazy NCBI GenBank i wykorzystano w analizach filogenetycznych jako sekwencje referencyjne. Wszystkie sekwencje DNA zostały wyrównane za pomocą programu Clustal W zawartego w edytorze wyrównywania sekwencji BioEdit59, 60. Uzyskany plik wielokrotnego wyrównania wykorzystano do analiz filogenetycznych, które przeprowadzono przy użyciu programu MEGA 5.0 z metodą Neighbor-Joining pozwalającą na 500 powtórzeń bootstrapowych61.

Ekstrakcja toksyn z gatunków Alternaria

Ekstrakcje toksycznych metabolitów przeprowadzono według metody Andersena i wsp.62 z pewnymi modyfikacjami. Ekstrakcje tych fitotoksyn przeprowadzono na podłożu Potato Dextrose Broth (PDB) przy użyciu 20-dniowych kultur. Ze środka każdej kolonii Alternaria wycinano trzy korki agarowe (3 mm) i inokulowano je w 200 ml pożywki PDB. Kolonie patogenu wycinano za pomocą wiertła korkowego (5 mm), a następnie kolonie inokulowano do pożywki PDB. Dwudziestodniowe hodowle przefiltrowano przez bibułę filtracyjną przy użyciu próżniowej maszyny filtracyjnej. Do filtratów z hodowli dodano równą objętość metanolu, dokładnie wymieszano i przechowywano w temperaturze 4 °C przez 24 h. Następnie wytrącano przesącz i odparowywano metanol do sucha w obrotowym koncentratorze próżniowym (IKA® RV 10) w temperaturze 43 °C. Do wyekstrahowanego przesączu dodano równą objętość octanu etylu i dokładnie wymieszano w rozdzielaczu. Otrzymano dwie fazy, jedną z nich stanowiła faza organiczna, a drugą faza wodna. Warstwę wodną oddzielono i ekstrahowano octanem etylu. Ekstrakt octanu etylu zatężono w temperaturze 44°C w wyparce próżniowej i rozpuszczono w metanolu.

Purification and separation of Alternaria phytotoxin via column chromatography

Purification and separation of compounds were performed using methodology of Devi et al.63 with slight modifications. Chromatografia kolumnowa (CC) została przeprowadzona na szklanej kolumnie (700 mm × 30 mm), a jako fazę stacjonarną wybrano żel krzemionkowy (100-120 mesh o rozmiarze Merk). Faza ruchoma składała się z czystego rozpuszczalnika lub różnych rozpuszczalników w zależności od wymagań warunków. Kolumnę obciążano surowym kompleksem wyekstrahowanym z izolatów grzybów z rodzaju Alternaria. Do rozdzielenia toksycznych metabolitów zastosowano fazę ruchomą składającą się z chloroformu: metanolu (80:20 i 95:05), benzenu: acetonu: kwasu octowego (60:35:05) oraz gradientu elucji. Różne frakcje eluowane z CC zostały rozdzielone metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC) i potwierdzone analizą HPLC.

Analiza fitotoksyn metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC)

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) została wykorzystana do identyfikacji różnych fitotoksyn produkowanych przez duże i małe zarodniki zidentyfikowanych gatunków Alternaria. TLC została przeprowadzona przy użyciu metody Andersena i wsp.64. W metodzie tej 4,5 g żelu krzemionkowego G254 (13% CaSO4 ½ H2O jako spoiwo) dodawano do 25 ml wody podwójnie destylowanej i mieszano szklaną bagietką aż do uzyskania zawiesiny żelu krzemionkowego. Następnie zawiesinę delikatnie nanoszono na płytkę szklaną i umieszczano w bezpiecznym miejscu do wysuszenia na powietrzu. Do rozdziału różnych fitotoksyn zastosowano różne fazy ruchome w stosunku: chloroform: metanol (80:20; v/v), benzen: aceton: kwas octowy (60:35:5; v/v), chloroform: metanol (95:5; v/v), octan etylu: benzen (95:5; v/v). Wymienione mieszaniny rozpuszczalników umieszczano następnie w eksykatorach i pozostawiano na 30 min w celu nasycenia środowiska w ich wnętrzu. Przed wykonaniem TLC płytki szklane pokryte żelem krzemionkowym naładowano, umieszczając je w piecu w temperaturze 60 °C na 10 min. Po naładowaniu, 5 µl próbek nanoszono punktowo w różnych miejscach w odległości 2 cm od podłoża. Po naniesieniu próbek, płytki TLC suszono w eksykatorze przez kilka minut. Powstałe plamy były wywoływane przez naświetlanie płytek TLC 0,2% etanolowym chlorkiem żelazowym lub wizualizowane w świetle UV przy 365 nm. Następnie płytki TLC suszono na powietrzu przez noc, po czym obliczano wartości Rf. Plamki różnych metabolitów, których wartości Rf okazały się podobne do wartości Rf wzorców, wydrapano, rozpuszczono w metanolu klasy HPLC i wykorzystano do analizy HPLC.

Analiza HPLC-UV

Przygotowanie wzorca

TeA (nr kat.: T1952), AOH (nr kat.: A4675) i AME (nr kat.: A4678) zakupiono w firmie Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indie) i użyto w postaci skrystalizowanej do przygotowania wzorca. Roztwór podstawowy (1000 µg ml-1) i oddzielny roztwór roboczy (10 µg ml-1) toksyn przygotowano w metanolu klasy HPLC i przechowywano w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. Toksyny te wykorzystano jako wzorce do kalibracji HPLC oraz do innych dodatkowych eksperymentów poprzez rozcieńczenie przygotowanych roztworów roboczych.

Warunki analizy HPLC-UV

Do analizy HPLC próbki rozdzielono chromatograficznie przy użyciu dezaktywowanej bazy (250 mm długości × 4.6 mm, wielkość cząstek 5,0 µm) kolumny C18 Waters Spherisorb, ODS2 (nr produktu: PSS831915, USA), która była połączona z kolumną ochronną, systemu serii Waters (Waters, Waters Corporation, Milford, USA) wyposażonego w detektor UV-VIS (2998 PDA) i sterownik systemu Waters 600E. Detektor 2998 PDA ustawiono na 254 nm jako długość fali całkującej. Próbki wstrzykiwano za pomocą 10 μl pętli autosamplera Waters 717plus (Waters Corporation, Milford, USA). Kolumna i kolumna ochronna były kontrolowane termostatycznie w temperaturze 28 °C. Szybkość przepływu wynosiła 0,70 ml/min, a faza ruchoma składała się z 75% metanolu klasy HPLC (rozpuszczalnik A), 25% wodnego roztworu (rozpuszczalnik B) 0,1 M buforu fosforanowego dodanego 900 ml DW na 1 litr i pH 5,8 utrzymywanego kwasem fosforowym. Urządzenie pracowało w liniowym trybie izokratycznym, a detekcja była monitorowana w zakresie 200-400 nm. Wiarygodność metody HPLC do analizy AME, TeA i AOH zwalidowano za pomocą granicy wykrywalności (LOD) i granicy oznaczalności (LOQ).

Analiza LC-MS/MS

W celu dalszego potwierdzenia toksyn Alternaria (AME, AOH i TeA) przeprowadzono metodę chromatografii – tandemowej spektrometrii mas (LC-MS/MS) z niewielkimi modyfikacjami Tölgyesi i wsp.65. Metoda ta polega na ekstrakcji ciało stałe-ciecz metanolem, a następnie derywatyzacji do TeA, AOH i AME. Następnie próbki oczyszczano za pomocą ekstrakcji do fazy stałej na wkładach polimerowych, a na koniec rozdzielano toksyny metodą LC-MS/MS. Do analizy LC-MS/MS próbki przygotowywano w procesie etapowym.

Odczynniki, rozpuszczalniki i przygotowanie wzorca

Suszone kalibratory analityczne AME, AOH i TeA zakupiono w firmie Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indie). Standardy rekonstytuowano w 1,0 ml metanolu, aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniu 0,1 mg ml-1. Wszystkie roztwory podstawowe przechowywano w temperaturze 4 °C. 2,4-dinitrofenylohydrazyna (DNPH) i undekanal zostały zakupione w firmie Sigma-Aldrich. Odczynnik derywatyzacyjny (0,58% DNPH w roztworze HCl) przygotowano zgodnie z opisem Siegel i wsp.7. Odczynnikiem zatrzymującym był 5% (v/v) undekanal w metanolu. Derywatyzowane roztwory wzorcowe TeA, AOH i AME (odpowiednio 1,91 μg/ml, 2,54 μg/ml i 2,71 μg/ml metanolu) przygotowano poprzez zmieszanie 1 ml 10 μg/ml metanolowych roztworów TeA, AOH i AME z 1 ml roztworu DNPH. Mieszaninę pozostawiono na noc i przetwarzano zgodnie z opisem w sekcjach dotyczących ekstrakcji próbki i oczyszczania SPE. Ostateczną objętość dostosowano do 10 ml za pomocą metanolu. Roztwory te wykorzystano do optymalizacji warunków LC-MS/MS dla analizy. Przygotowano 50 mM bufor mrówczanu amonu w wodzie, a jego pH dostosowano do 3,0 za pomocą kwasu mrówkowego. Metanol i acetonitryl były LC-MS grade uzyskane z Sigma-Aldrich. Octan etylu, n-heksan, dichlorometan, kwas mrówkowy i mrówczan amonu były klasy HPLC i zostały zakupione od firmy Merck (Darmstadt, Niemcy). Kolumnę Kinetex C-18 UPLC LG 500 (3 × 100 mm, 2,6 μm), wkłady Strata SPE (6 ml, 200 mg) oraz filtry strzykawkowe z regenerowanej celulozy (RC) (15 mm, 0,45 μm) otrzymano z firmy Phenomenex (Utrecht, Holandia). Kolumny HPLC Supelco Ascentis Express C-18, cyjanowe (ES-CN) i fenyloheksylowe (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) zakupiono w firmie Sigma Aldrich. Próbki toksyn wzorcowych, użyte do opracowania metody, zostały zakupione od Biogenuix (LKT laboratories, Inc., New Delhi, Indie). Próbki przechowywano w temperaturze -20 °C do momentu poddania ich analizie.

Ekstrakcja próbek

Próbki surowych metabolitów oczyszczano metodą chromatografii kolumnowej, a frakcje eluowano i rozpuszczano w metanolu. 50 ml próbki z każdej frakcji wymieszano w 50 ml polipropylenowych (PP) probówkach wirówkowych, które następnie szczelnie zamknięto. Próbki mieszano worteksem przez 5 s i wytrząsano poziomo na wytrząsarce CAT S50 z prędkością 600 min-1 przez 45 min w temperaturze otoczenia. Następnie probówki wirowano przy 5000 rpm przez 10 min w temp. 20 °C, a górną warstwę zbierano do nowej 50 ml probówki wirówkowej z PP. Do próbki dodawano 100 μl odczynnika derywatyzacyjnego (0,596% DNPH w 2 mol/l HCl) i mieszano vorteksem przez 5 sek. Próbkę pozostawiono do derywatyzacji na 1 h w temperaturze otoczenia. Następnie dodano 500 μl odczynnika zatrzymującego 5% (v/v) undecanal w metanolu i mieszano vorteksem przez 5 s. Próbkę odstawiono na 30 min. Próbkę pozostawiono na 30 min, a następnie rozcieńczono w probówce PP do 35 ml 50 mM buforem mrówczanu amonu (pH 4, skorygowane kwasem mrówkowym). Próbkę odwirowano przy 5000 obr/min przez 10 min w temperaturze 20 °C i poddano oczyszczaniu metodą ekstrakcji do fazy stałej.

Oczyszczanie metodą ekstrakcji do fazy stałej (SPE)

Kartridże Strata-XL (200 mg, 6 ml, 100 μm) kondycjonowano 6 ml metanolu, a następnie 6 ml wody i 6 ml 50 mM buforu mrówczanowego. Do wkładów podłączono zbiorniki o pojemności 75 ml i załadowano do nich próbki. Następnie, próbki były przepuszczane kroplami. Następnie kolumny SPE przemywano 6 ml metanolu-wody (15/85, v/v), a potem 6 ml n-heksanu. Wkłady były suszone próżniowo przez 5 minut przed eluowaniem próbek do szklanych probówek za pomocą 5 ml metanolu. Próbki odparowano do sucha w temperaturze 45 °C pod łagodnym strumieniem azotu i ponownie rozpuszczono w 250 μl metanolu, mieszając je mieszadłem Vortex przez 20 sekund. W ostatnim etapie próbki filtrowano przez filtry z regenerowanej celulozy do fiolek HPLC.

Instrumenty i sprzęt

Opracowanie metody przeprowadzono przy użyciu systemu Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2.7 μm) systemu UPLC LG 500 nm (Accucore RP-MS 100 × 3,0 MM, 2,6UM, ACQ-TQD-QBB1152, detektor Waters acuity PDA, Waters Corporation, Milford, MA, USA) sprzężonego z detektorem MassLynx triple quadrupole MS (Waters, Milford, MA, USA). Akwizycję i ocenę danych przeprowadzono za pomocą programu MassLynx w wersji 4.0. Ostateczna metoda została również przeniesiona do systemu Thermo ACQ-TQD Quantum Ultra LC-MS/MS (Thermo Finnigan, San Jose, CA, USA), który obejmował pompę binarną Waters acquity QSM (SN- L10QSM943A), autosampler Waters acquity fin (SN-M10SDI443M), termostat kolumnowy oraz detektor TQD Quantum Ultra triple quadrupole MS. Docelowa temperatura kolumny i docelowa temperatura próbki wynosiły odpowiednio 30 °C i 10 °C. Akwizycję i ocenę danych przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Xcalibur 2.0.7. SP1. Oba systemy wyposażone były w interfejs elektrospray (ESI), w którym podczas akwizycji wykorzystywano wyłącznie jonizację ujemną. Jako gazu suszącego i kolizyjnego użyto azotu. Parametry źródła jonów są podsumowane w Tabeli Dodatkowej S2. Ponadto przenośność metody została zbadana przy użyciu systemu LC-MS/MS, który składał się z Agilent 1100 HPLC sprzężonego z AB Sciex 4000 triple quadrupole MS (Framingham, MA, USA).

Warunki instrumentu

Toksyny Alternaria są rozdzielane na kolumnie Ascentis Express C-18 (2,1 × 100 mm, 2,7 μm) UPLC wyposażonej w kolumnę wstępną C-18 o średnicy 2,1 mm z zastosowaniem liniowej elucji gradientowej. Cztery rozpuszczalniki (rozpuszczalniki A, B, C i D) były mieszane przez pompę binarną. Rozpuszczalnik A zawierał; acetonitryl (ACN) + wodę (5:95), rozpuszczalnik B zawierał; ACN: 5% alkohol izopropylowy (IPA), rozpuszczalnik C zawierał; 100% metanol, a rozpuszczalnik D zawierał; czysty octan amonu. Szybkość przepływu wynosiła 0,5 ml/min. Faza ruchoma rozpuszczalników w czasie początkowym wynosiła 0,0% A, 30% B, 30% C i 40% D. W czasie końcowym (5 min) rozpuszczalniki wynosiły 0,0% A, 30% B, 30% C i 40% D. W celu usunięcia nagromadzonych lipofilowych rozpuszczalników matrycy konieczny był wystarczający etap przemywania w programie gradientowym. Całkowity czas analizy wynosił 5 min. Termostat kolumny utrzymywał temperaturę na poziomie 30 °C, a objętość nastrzyku wynosiła 1,0 μl. Autosampler pracował w temperaturze 20 °C.

System UPLC LG 500 nm był sprzężony z detektorem MS/MS (Micromass Quattro Ultima PT) poprzez interfejs elektrorozpylania (ESI), który pracuje w trybie ujemnym. Zoptymalizowane ustawienia ESI były następujące: temperatura źródła 120 °C, temperatura desolwatacji 350 °C, przepływ gazu suszącego 650 L/Hr, przepływ gazu stożkowego 30 L/Hr i napięcie kapilary 3.50 kV. Jako gazu suszącego i gazu zderzeniowego użyto azotu (2,67 × 10-6 bar). Podczas detekcji w MS zastosowano tryb wielokrotnego monitorowania reakcji (MRM), a dla każdej docelowej toksyny skanowano dwa przejścia jonowe. Tryb MRM zastosowano w detektorze MS/MS i rejestrowano dwa przejścia jonowe (kwantyfikator i kwalifikator) dla każdego związku docelowego. Wybrane przejścia jonowe wraz ze zoptymalizowanymi napięciami (soczewka stożkowa lub rurowa), energiami kolizji (CE) i czasami przebywania są podsumowane w tabeli (Supplementary Table S2).

Ocena potencjału toksykologicznego różnych mikotoksyn Alternaria (TeA, AOH i AME)

Pomiar zakresu śmierci komórek indukowanej przez różne mikotoksyny został określony metodą inokulacji oderwanych liści. W tym celu próbki świeżych liści zostały oderwane od roślin uprawianych w szklarni i odpowiednio umyte przez 3-4 minuty w bieżącej wodzie z kranu, wysterylizowane w 1,0% (0,01 g/ml) podchlorynie sodu przez około 1 minutę, a następnie powierzchniowo przetarte 70% etanolem, a na koniec aseptycznie dokładnie spłukane sterylną wodą destylowaną. Na koniec liście umieszczano na zwilżonej bibule filtracyjnej i nakłuwano sterylną igłą na dolnej powierzchni. Toksyny rozpuszczano w sterylnej wodzie dejonizowanej w stężeniu 100 μg/ml. Krople (100 µl) każdej z trzech toksyn wstrzykiwano do zranionych liści za pomocą cienkiej igły (Dispovan, 1 ml). Próbka kontrolna została dostosowana poprzez wstrzyknięcie sterylnej wody destylowanej. Traktowane próbki liści utrzymywano w komorze wilgotnej (27 ± 0,5°C i 60% wilgotności względnej) w warunkach cieplarnianych (14 h cykl świetlny i 10 h cykl ciemny w temperaturze 27°C). Prowadzono regularną obserwację (co 24 h przez 6 dni) w celu wykrycia jakichkolwiek zmian istotnych dla efektów toksykologicznych, które rozwinęły się w próbkach iniekcyjnych w odniesieniu do próbek kontrolnych. Zestaw doświadczalny był utrzymywany w trzech powtórzeniach, a procentowa powierzchnia liścia dotknięta skutkami toksycznej śmierci komórek była mierzona przez (Systronic leaf area meter 211) i obliczana według wzoru podanego poniżej.

Określanie śmierci komórek za pomocą testu absorpcji błękitu Evansa

Utrata żywotności komórek (śmierć komórek) została oceniona za pomocą metody barwienia błękitem Evansa (Baker i Mock, 1994). Liście pomidora traktowano tym samym stężeniem (250 μg/ml) wszystkich trzech toksyn. Potraktowane liście barwiono 0,25% (v/v) wodnym roztworem błękitu Evansa przez 15 min. Po przepłukaniu wodą destylowaną przez 30 min, liście wycięto i nasączano 500 µl N, N-dimetyloformamidu przez 1 h w temperaturze pokojowej. Gęstość optyczną uwolnionego błękitu Evansa mierzono spektrofotometrycznie przy długości fali 600 nm.

Analiza statystyczna

Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu oprogramowania IBM SPSS Statistics ver. 20 poprzez analizę wariancji (one-way ANOVA), a następnie test wielokrotnych zakresów Duncana na poziomie istotności P ≤ 0,05. Dane zostały wyrażone jako średnia ± odchylenie standardowe (SD) z co najmniej trzech powtórzeń każdego metabolitu. Analizie statystycznej poddano wybrane 48 izolatów gatunków Alternaria o charakterze patogenicznym.

.