Miniaturowe bioreaktory: obecne praktyki i przyszłe możliwości

Wprowadzenie

Powstanie biologii molekularnej i technologii manipulacji genetycznej w ciągu ostatniego ćwierćwiecza miało dramatyczny wpływ na przemysł farmaceutyczny/opiekę zdrowotną, z dużą liczbą wielu zastosowań tej technologii opartych na zdolności do tworzenia rekombinowanych linii komórkowych dla korzyści terapeutycznych u ludzi . Oprócz rozwoju tych genetycznie zmodyfikowanych organizmów, istnieje potrzeba poprawy wydajności dzikich organizmów, przyspieszenia badań przesiewowych nowo odkrytych mikrobów i kontynuowania postępu w zakresie powiązanych zadań, takich jak ulepszanie pożywek i optymalizacja procesów. Tradycyjnie, rozwój procesu hodowli komórkowej wymagał badań przesiewowych dużej liczby linii komórkowych w hodowlach wstrząsanych, a następnie dalszych testów udanych kandydatów w bioreaktorach stacjonarnych przed badaniami w skali pilotażowej. Potrzeba przeprowadzenia ogromnej liczby hodowli rozwojowych spowodowała postęp i coraz szersze zastosowanie systemów bioreaktorów małej skali, które oferują zminiaturyzowane rozwiązanie HT do rozwoju procesu.

Głównymi typami komórek stosowanymi do wytwarzania produktów terapeutycznych są komórki bakteryjne i ssaków, z których każdy posiada unikalne korzyści i ograniczenia, które wpływają na typ bioreaktora stosowanego do rozwoju procesu. Komórki bakteryjne są generalnie wytrzymałe i nie są podatne na uszkodzenia przy ścinaniu, co oznacza, że można w nich stosować systemy wirników promieniowych o wysokim współczynniku ścinania (np. turbiny Rushtona) i wysokie szybkości mieszania. Dzięki temu takie bioreaktory charakteryzują się wysoką zdolnością przenoszenia masy, co pozwala na wspieranie hodowli szybko metabolizujących komórek drobnoustrojów o dużej gęstości komórkowej i zwiększa ilość produktu, jaki można uzyskać w takich bioprocesach. Chociaż komórki ssaków nie posiadają ochronnej ściany komórkowej i dlatego są zazwyczaj bardziej podatne na ścinanie i wymagają łagodniejszego traktowania niż ich bakteryjne odpowiedniki, większość komercyjnie stosowanych linii komórkowych może być hodowana w bioreaktorach ze zbiornikiem mieszadłowym, aczkolwiek z modyfikacjami konstrukcyjnymi. Na przykład, nisko-ścinowe, morskie wirniki osiowe mogą być stosowane zamiast turbin Rushtona, aby delikatnie cyrkulować komórki i składniki odżywcze w środowisku bez przegród; a środki chroniące przed ścinaniem, takie jak surowica lub Pluronic F-68 mogą być dodawane do pożywek do hodowli komórek.

Oprócz opracowywania leków terapeutycznych, MBR mogą być stosowane do opracowywania pożywek wzrostowych; ulepszania szczepów poprzez inżynierię metaboliczną lub ukierunkowaną ewolucję; oraz tzw. bio-poszukiwania produktów naturalnych – wszystkie te procesy niosą ze sobą duże obciążenie bioreaktora, które może być złagodzone przez zastosowanie miniaturowych urządzeń HT. W szczególności MBR mogą zmniejszyć pracochłonność i koszty materiałowe ogromnej liczby hodowli komórkowych niezbędnych w rozwoju bioprocesów, zwiększając poziom równoległości i osiągalnej przepustowości, i jako takie cieszą się rosnącym zainteresowaniem. Ważne jest, aby takie urządzenia stosowane do opracowywania procesów mogły dokładnie naśladować bioreaktory w skali laboratoryjnej i pilotażowej, tak aby kinetyka wzrostu i ekspresja produktu – zoptymalizowane w skali miniaturowej – mogły być wykorzystane w skali ilościowej.

Pomimo, że MBR są niewątpliwie bardziej zdolne do pracy w trybie HT niż konwencjonalne bioreaktory w skali laboratoryjnej, są one obecnie mniej oprzyrządowane i mają również ograniczone możliwości pobierania próbek off-line ze względu na małe objętości (od ok. 0,1 ml do ok. 100 ml); oznacza to, że obecnie istnieje kompromis pomiędzy zawartością informacji w kategoriach jakości i ilości danych dostępnych z bioreaktora, uzyskanych zarówno poprzez pomiary on-line i off-line, a wydajnością eksperymentalną, zilustrowaną na rysunku 1. Ponieważ żadne urządzenie nie rozwiązało jeszcze wszystkich wyzwań związanych z miniaturyzacją, tj. dokładnym naśladowaniem warunków procesowych w dużej skali, a jednocześnie zachowaniem pełnej funkcjonalności konwencjonalnych bioreaktorów, zamiarem autorów jest dokonanie przeglądu aktualnych osiągnięć, a następnie wskazanie obszarów, w których technologia prawdopodobnie rozwinie się w przyszłości, tak aby można było rozszerzyć obecne korzyści HT i zmniejszyć lukę informacyjną, która obecnie istnieje między platformami bioreaktorów miniaturowych i laboratoryjnych. W niniejszym przeglądzie pogrupowano różne MBR opisane na podstawie ich metody mieszania (tj. wytrząsanie, mieszanie lub rozpylanie gazu) w odniesieniu do typu konwencjonalnego bioreaktora, który naśladują lub z którego pochodzą; kluczowe specyfikacje i właściwości prototypowych i komercyjnych miniaturowych urządzeń do hodowli komórek zdolnych do pracy równoległej podsumowano w tabeli 1.

Miniaturowe systemy bioreaktorów wstrząsanych

Systemy wstrząsane były stosowane w bioprocesach od pierwszych prób hodowli kultur bakterii produkujących antybiotyki w latach 40-tych XX wieku. Są one nadal szeroko stosowane w przemyśle i środowisku akademickim jako narzędzie do odkrywania leków, optymalizacji mediów, szczepów i produktów oraz rozwoju procesów. Mają wiele różnych konstrukcji i objętości, od kolb wstrząsanych o pojemności setek mililitrów do płytek mikrotitrowych (MTP) o objętości kilku mikrolitrów.

Kolby wstrząsane

Przez ostatnie pięćdziesiąt lat naukowcy wykorzystywali hodowlę komórek w kolbach wstrząsanych jako środek do rozwoju procesów na małą skalę, o objętości od około 10 ml do 500 ml. Kolby wstrząsane są dostępne w różnych formach, mogą być wykonane ze szkła lub plastiku, a niektóre z nich mają przegrody wspomagające napowietrzanie i mieszanie. Można je mieszać za pomocą wytrząsania orbitalnego lub liniowego i mogą być umieszczone w szafie z kontrolowaną temperaturą. Czynniki, które wpływają na kultywację w kolbach wstrząsanych to wielkość naczynia, objętość wypełnienia, materiał konstrukcyjny, geometria przegród, częstotliwość wytrząsania i rodzaj korka użytego do uszczelnienia naczynia. Büchs twierdzi, że kolby wstrząsane są wykorzystywane w ponad 90% wszystkich eksperymentów hodowlanych w przemyśle i środowisku akademickim, do hodowli szerokiej gamy mikroorganizmów, np. bakterii, grzybów i drożdży, jak również komórek ssaków. Łatwo jest zrozumieć dlaczego są one tak szeroko stosowane: są one niedrogim i skutecznym sposobem na odtwarzalne prowadzenie wielu typów hodowli komórek istotnych dla przemysłu w celu rozwoju procesu. Ponadto są one łatwe w obsłudze i w dużym stopniu odporne na komplikacje mechaniczne. Przez większość długiego okresu ich stosowania nie wprowadzono znaczących modyfikacji w technologii, bez monitorowania hodowli on-line oraz ręcznego dodawania i pobierania próbek. Dopiero niedawno wprowadzono oprzyrządowane kolby wstrząsowe, zaprojektowane do pomiaru i potencjalnej kontroli pH i poziomu DOT w trybie online. pH i rozpuszczony tlen mogą być mierzone przy użyciu barwnika tlenku rutenu, który kwantyfikowalnie fluoryzuje w obecności odpowiednio jonów wodoru lub tlenu po wzbudzeniu lampą LED. Barwnik ten może być albo włączony do plastra i przyklejony wewnątrz kolby, albo nałożony na końcówkę sondy połączonej światłowodem i zanurzony w interesującej nas hodowli. Inne parametry, które mogą być obecnie mierzone online to szybkość przenoszenia tlenu (OTR) i szybkość wydzielania dwutlenku węgla (CER) – a na ich podstawie można wyprowadzić iloraz oddechowy (RQ). Monitorowanie takich parametrów w trybie online umożliwiłoby prowadzenie bardziej wyrafinowanych strategii hodowli komórek, takich jak podawanie substratów w oparciu o zmiany pH bulionu hodowlanego wynikające z metabolizmu komórek. Ponadto, Akgün et al. opracowali ostatnio nowatorski system kolb wstrząsanych, który jest zdolny do pracy ciągłej i tym samym zwiększa zakres równoległego rozwoju bioprocesów z wykorzystaniem systemów wstrząsanych.

Jednakże, głównym ograniczeniem kolb wstrząsanych jest ich zależność od napowietrzania powierzchniowego, co prowadzi do zmniejszonego transferu tlenu w stosunku do reaktorów ze zbiornikiem mieszadłowym (STR). Wittmann i wsp. podali wartości całkowitego objętościowego współczynnika przenoszenia masy (kLa) do 150 h-1 w kolbach wstrząsanych. Wartości kLa od 151 h-1 (600 ml, 200 rpm) do 277 h-1 (100 ml, 200 rpm) zostały zarejestrowane w nowatorskim, pudełkowym systemie kolb wstrząsanych opracowanym przez Kato i Tanaka, które są wystarczająco wysokie, aby przeprowadzić większość wsadowych hodowli komórek bez hamowania wzrostu mikroorganizmów. Badacze ci wbudowali membrany gazoprzepuszczalne w górne rogi swoich prototypowych kolb, co pozwoliło na bardziej efektywny przepływ gazu do naczynia podczas wytrząsania, przezwyciężając problem występujący w konwencjonalnych kolbach wstrząsanych, polegający na wprowadzeniu większej ilości powietrza do systemu w sposób sterylny. Dla celów hodowli, w których zapotrzebowanie na tlen jest wysokie, wprowadzenie przegród może zwiększyć OTR przy niższych częstotliwościach wytrząsania; jednakże wysokie prędkości mogą prowadzić do nadmiernego rozpryskiwania, co może spowodować zablokowanie korka przepuszczającego gaz (często wykonanego z waty) na szczycie kolby poprzez nasycenie cieczą. Wykazano, że taka przeszkoda poważnie ogranicza zdolność systemu do przenoszenia tlenu, co może powodować problemy w przypadku hodowli szybko reagujących aerobów. Głód tlenowy mógłby spowolnić tempo wzrostu, zmienić szybkość tworzenia produkcji i/lub generować niepożądane toksyczne produkty uboczne, np. tworzenie octanu przez Escherichia coli.

Płytki mikrotitrowe

Płytki mikrotitrowe (zwane również płytkami mikrowellowymi) zostały po raz pierwszy wprowadzone w 1951 r. jako platforma dla testów diagnostycznych i są nadal szeroko stosowane w naukach przyrodniczych. Służą one do przeprowadzania testów diagnostycznych, takich jak testy immunoenzymatyczne, które wykorzystują możliwość przeprowadzania wielu identycznych reakcji równolegle i w bardzo małej skali. To właśnie ta zaleta sprawiła, że MTP są wykorzystywane jako miniaturowe bioreaktory wstrząsane na etapie badań przesiewowych w procesie rozwoju procesu do oceny linii komórkowych. Płytki są zwykle wykonane z tworzywa sztucznego, choć istnieją również wersje szklane i metalowe. Mieszanie może być osiągnięte przy użyciu pipety lub mieszadeł magnetycznych, jednakże najbardziej powszechną metodą jest wytrząsanie orbitalne całej płytki na podgrzewanym bloku, który może kontrolować temperaturę hodowli. Liczba studzienek zawartych w MTP wynosi zazwyczaj 6, 12, 24, 96 i 384, przy czym obecnie dostępne są nawet 1536 i 3456 studzienek do badań przesiewowych o bardzo wysokiej wydajności (UHTS). Studzienki mogą być prostokątne lub cylindryczne, z kwadratowymi geometriami wspomagającymi mieszanie i przenoszenie tlenu poprzez naśladowanie działania przegród. Płyty z kwadratowym dnem działają w podobny sposób, ograniczając wirowanie cieczy wewnątrz studni, a tym samym zwiększając turbulencję układu. Ze względu na wzrost powierzchni spowodowany większym rozproszeniem płynu po bokach każdej mikrostudzienki i zwiększoną siłę napędową dla tlenu spowodowaną lepszym mieszaniem, OTR jest proporcjonalna do amplitudy i częstotliwości wytrząsania, dlatego zwiększenie tych parametrów może być korzystne. Ponadto, Hermann et al. zgłosili, że OTR jest odwrotnie proporcjonalna do objętości wypełnienia, szczególnie przy wyższych częstotliwościach wytrząsania. Jednakże, istnieje punkt, po przekroczeniu którego każde zwiększenie mieszania powoduje rozlanie cieczy procesowej (chyba, że studnia jest zamknięta – co ma swoje własne problemy, z ograniczonym transferem tlenu do studni). Podobnie jak w przypadku kolb wstrząsanych, stosunkowo niska zdolność przenoszenia tlenu w MTP (wartości kLa do 200 h-1 w płytkach 96 dołkowych) wynika z faktu, że są to systemy wstrząsane i polegają na napowietrzaniu powierzchni w celu przeniesienia masy. W przeciwieństwie do tego, Kensey i wsp. podali wartości kLa przy użyciu metody utleniania siarczynowego do 1600 h-1 w 48-dołkowej płytce MTP o standardowej geometrii z 3 mm wyrzutem orbitalnym przy 1400 rpm, stosując objętość wypełnienia 300 μl, co jest porównywalne z konwencjonalnymi STR. Dzięki zastosowaniu obliczonej stałej proporcjonalności, zespół ten był w stanie odnieść zdolność przenoszenia tlenu uzyskaną metodą chemiczną do mediów biologicznych.

Dostępne są również metody oznaczania kLa w małej skali, które dostarczają danych bezpośrednio porównywalnych z wartościami uzyskanymi w warunkach procesowych. Na przykład Duetz et al. i Doig et al. oszacowali kLa poprzez bilans masowy w warunkach ograniczenia tlenowego z liniowego wzrostu Pseudomonas putida w MTP i Bacillus subtilis w prototypowym reaktorze z miniaturową kolumną bąbelkową (MBCR). Ponadto, metoda dynamicznego odgazowania jest często preferowana w stosunku do metody utleniania siarczynowego w celu określenia wartości kLa, ponieważ jest ona zazwyczaj przeprowadzana w wodzie. W związku z tym system ten jest koalescencyjny i chociaż nie jest identyczny z podłożem biologicznym, jest bardziej reprezentatywny dla warunków hodowli komórek niż całkowicie niekoalescencyjne warunki metody siarczynu sodu. Jednakże technika ta jest trudna do zastosowania w MTP, ponieważ często przed pomiarem DOT należy zatrzymać wytrząsanie w celu uzyskania dokładnych odczytów, zmieniając w ten sposób środowisko przenoszenia masy w krytycznym momencie. Ze względu na problemy związane ze stosowaniem ustalonych metod oznaczania kLa w MTP opracowaliśmy ostatnio nową metodę, która opiera się na biooksydacji katecholu przez enzym katechol-2,3-dioksygenazę. Metoda ta dała podobne wartości kLa w porównaniu do metody dynamicznego gazowania, a ponieważ jest szybka i nie wymaga żadnych założeń dotyczących kinetyki, uważamy, że ta metoda jest dobrze dostosowana do oceny kLa w MTP i innych urządzeniach na małą skalę.

MTP cierpią również do pewnego stopnia z powodu tej samej cechy, która czyni je atrakcyjnymi jako urządzenia o wysokiej wydajności – małych objętości – ponieważ parowanie może usunąć znaczną część płynu w studni. Oddychające membrany mogą być umieszczone na wierzchu płytek, aby ograniczyć to parowanie, ale wtedy możliwości transferu tlenu są ograniczone. Zimmermann et al. opisali membranę, która osiągnęła umiarkowany stopień retencji wody i transferu tlenu; jednakże, wartości kLa zostały zredukowane o czynnik pięciokrotny, co jeszcze bardziej zaostrzyło problem niskiej zdolności transferu tlenu właściwej dla systemów wstrząsanych. Chociaż parowanie jest potencjalnym problemem we wszystkich MBR, MTP wydają się być bardziej podatne na ten problem z powodu typowego użycia najmniejszych objętości procesowych. MTP z 3456 dołkami oferują najwyższą przepustowość spośród wszystkich dostępnych miniaturowych urządzeń do hodowli komórek i wykazano, że ilościowo podtrzymują wzrost komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), chociaż tak mała objętość procesu (1 – 2,2 μl) oznacza, że urządzenie to prawdopodobnie nie byłoby w stanie naśladować mechanizmów, dzięki którym działają większe wstrząsane naczynia; na przykład efekty napięcia powierzchniowego objęłyby cały dołek, poważnie ograniczając zdolność mieszania. Ponadto, nie byłoby możliwe usunięcie medium do próbkowania off-line.

Mimo, że MTP są szeroko stosowane w badaniach nad odkryciami, cierpiały z powodu braku oprzyrządowania w podobny sposób jak kolby wstrząsane, ograniczając zakres danych, które mogą być zbierane. Jednakże, ostatnio zostały opracowane techniki pomiaru pH i DOT w takich systemach. Na przykład Lye i współpracownicy badali wpływ kontroli pH na wydajność biomasy i kinetykę wzrostu bakterii nitkowatych w MTP . Pomimo pewnych nieodłącznych ograniczeń MTP przy prowadzeniu hodowli komórek, poczyniono postępy w charakterystyce mieszania, transferu masy i oprzyrządowania tych naczyń, co oznacza, że unikalne zalety tych urządzeń w zakresie potencjału automatyzacji i wewnętrznej zdolności HT prowadzą do ich rosnącego wykorzystania jako wczesnych etapów MBR.

Rurki spinowe

Rozwój procesów hodowli komórek ssaków na wczesnym etapie w małej skali był tradycyjnie prowadzony w kolbach T i bioreaktorach na małą skalę (często kolbach spinowych, zwykle o pojemności 500 ml) . Chociaż początkowo były to urządzenia w dużej mierze niezdefiniowane, wykonano prace mające na celu scharakteryzowanie środowiska inżynieryjnego w kolbach obrotowych, co ułatwiło ich wykorzystanie jako naczyń do zmniejszania skali. Niemniej jednak, faktem pozostaje, że ich stosunkowo duża objętość czyni je nieopłacalnymi jako technologia HT, co oznacza, że istnieje rzeczywiste zapotrzebowanie na miniaturowe bioreaktory, które będą używane w połączeniu z komórkami ssaków do równoległej hodowli komórek. Ostatnio opracowano i zastosowano rurki wirowe jako narzędzie rozwoju procesu na małą skalę do hodowli komórek ssaków. Rurki wirowe opisane po raz pierwszy przez De Jesus et al. wydają się oferować kilka zalet w porównaniu z kolbami wirującymi, takich jak mniejsza objętość procesu. Od tego czasu zostały one wprowadzone na rynek przez ExcellGene SA (Valais, Szwajcaria) pod nazwą TubeSpin Satellites. Te naczynia hodowlane składają się ze zmodyfikowanych probówek wirówkowych o pojemności 50 ml zamontowanych na obrotowej wytrząsarce orbitalnej umieszczonej w inkubatorze. Objętości hodowli wynoszą od 5 ml do 35 ml na reaktor, a analiza off-line jest przeprowadzana z wykorzystaniem całych probówek na zasadzie ofiary. System ten nie posiada oprzyrządowania niezbędnego do prowadzenia w pełni scharakteryzowanych hodowli komórek ssaków; jest jednak użytecznym narzędziem do optymalizacji pożywek i zwiększania wydajności oraz nadaje rozwojowi hodowli komórkowych aspekt wysokiej wydajności, przy czym twórcy tego systemu zgłosili zdolność do przetwarzania 1000 różnych hodowli tygodniowo. Stosunkowo duża objętość i niski współczynnik parowania znalezione w tym urządzeniu są zaletami, gdy mamy do czynienia z wolno rosnącymi komórkami ssaków, gdzie hodowle mogą trwać wiele dni, jednak należy podkreślić, że w tym systemie nie przeprowadzono żadnej inżynieryjnej charakterystyki mieszania i przenoszenia masy, a zatem rurki wirowe są w dużej mierze wykorzystywane do zastosowań przesiewowych.

Miniaturowe systemy bioreaktorów z mieszaniem

Miniaturowe bioreaktory z mieszaniem (MSBR) oparte na konwencjonalnych STR zostały opracowane jako alternatywa dla wstrząsanych systemów MBR dla wczesnego etapu rozwoju procesu i charakterystyki komórek. Zazwyczaj urządzenia te są ściśle wzorowane na bioreaktorach w skali laboratoryjnej i dlatego umożliwiają większe możliwości monitorowania i kontroli niż inne miniaturowe platformy bioreaktorów. Zwykle ich objętość procesowa jest pośrednia między MTP a kolbami wstrząsowymi, a materiały konstrukcyjne są bardzo zróżnicowane – stosuje się Perspex, Pyrex, polimetakrylan metylu (PMMA) i stal nierdzewną. Rysunek 2 ilustruje nasz prototyp MSBR o pojemności roboczej 18 ml, który jest zbudowany ze stali nierdzewnej i Pyrexu i wyposażony w sondy optyczne do pomiaru pH i DOT online. Zbiornik ten został scharakteryzowany pod względem wydajności mieszania i zdolności przenoszenia tlenu. Wykazano, że jest ono zdolne do naśladowania konwencjonalnych STR w hodowli komórek o różnej reologii, wrażliwości na ścinanie i zapotrzebowaniu na tlen (tj. bakterii nitkowatej Saccharopolyspora erythraea wytwarzającej erytromycynę i rekombinowanej E. coli wytwarzającej odpowiednio plazmidowe DNA i fragment przeciwciała). Urządzenie mogło z powodzeniem hodować szereg organizmów dzięki stosunkowo wysokim wartościom kLa (480 h-1 przy 7000 obr/min metodą dynamicznego odgazowania) i krótkim czasom mieszania (4,8 s przy 7000 obr/min – ponad dwukrotnie szybciej niż naczynie o pojemności 7 L przy takim samym nakładzie mocy specyficznej). Wysokie prędkości transferu tlenu wspomagały wzrost szybko oddychających organizmów (E. coli), natomiast efektywne mieszanie pozwalało na utrzymanie jednorodnych warunków w naczyniu w przypadku lepkich bulionów fermentacyjnych – często spotykanych przy hodowli organizmów nitkowatych. Szybkość mieszania mogła być również bardzo ściśle kontrolowana, co pomogło zapobiec uszkodzeniu wrażliwych na ścinanie organizmów grzybniowych przez nadmierny pobór mocy. Ponadto, zmierzono gazowy pobór mocy w zbiorniku, co pozwoliło na obliczenie liczby mocy wirnika w szerokim zakresie warunków pracy i tym samym umożliwiło wiarygodne skalowanie hodowli komórek na podstawie równego specyficznego poboru mocy. Chociaż ten MSBR jest prototypem, możliwe byłoby multipleksowanie takiego urządzenia w celu uzyskania wyższej przepustowości.

Dzięki zapewnieniu mieszania i aktywnego napowietrzania zbiornika, współczynniki przenoszenia masy zbliżone do konwencjonalnego, laboratoryjnego STR zostały zgłoszone w literaturze dla innych MSBR. Na przykład Lamping et al. podali wartości kLa wynoszące 360 h-1 przy 1 VVM i 3000 rpm, stosując metodę dynamicznego odgazowania w prototypowym MSBR o konstrukcji podobnej do tej przedstawionej na Rysunku 2. Ponadto ten sam zespół z powodzeniem modelował przenoszenie tlenu w prototypowym miniaturowym bioreaktorze przy użyciu analizy obliczeniowej dynamiki płynów (CFD), która opierała się na odpowiednich parametrach inżynieryjnych pola prędkości, wielkości pęcherzyków, zatrzymania gazu i szybkości rozpraszania energii wewnątrz MBR .

Puskeiler i wsp. podali ostatnio wartości kLa wynoszące ponad 700 h-1 (objętość 12 ml) i aż 1600 h-1 (objętość 8 ml) dla MSBR mieszanego z prędkością 2300 obr/min. W systemie tym zastosowano nowatorski wirnik indukujący gaz, który zapewnia bardzo wysoką zdolność przenoszenia tlenu. W tym badaniu do pomiaru kLa zastosowano metodę dynamicznego odgazowywania, choć wykorzystano warunki bez koalescencji, co utrudnia bezpośrednie porównanie z wartościami uzyskanymi z mediów do hodowli komórek lub cieczy koalescencyjnych. W tej samej pracy opisano zdolność systemu do podtrzymywania hodowli komórek w trybie wsadowym, co ilustruje potencjał technologii miniaturowych bioreaktorów do wspierania takich ważnych dla przemysłu strategii. Ponadto, wykazano możliwość monitorowania i kontroli on-line. Urządzenie opisane w tym raporcie, zaprojektowane we współpracy z H+P Labortechnik AG (Oberschleissheim, Niemcy) jest zintegrowaną jednostką („Bioreactor Block”) zdolną do obsługi do 48 hodowli komórkowych jednocześnie. Zintegrowany system obsługi cieczy umożliwił pomiar pH w linii z częstotliwością jednej godziny poprzez dozowanie próbek o objętości 20 μl do dostępnych w handlu MTP zawierających przymocowane łatki pH. Osiem minut później ten sam system pobierania próbek cieczy dostosował pH przy użyciu 4 M NaOH. Podczas gdy użycie zautomatyzowanej obsługi cieczy do kontroli pH jest dobrym rozwiązaniem, autorzy przyznali, że może to być niepraktyczne, jeśli jest używane z wrażliwymi organizmami, które wymagają bardziej czułej regulacji pH. Jednakże, raport stwierdza, że ulepszony system monitorowania jest opracowywany z partnerami przemysłowymi w celu zapewnienia częstszego monitorowania, co może zwiększyć liczbę jednoczesnych fermentacji, które mogą być skutecznie monitorowane. DOT był mierzony w systemie przy użyciu prototypowego bloku czujników z sondami optycznymi, chociaż tylko 8 reaktorów z 48 zbiorników hodowlanych było monitorowanych jednocześnie. Takie urządzenie może być również zintegrowane ze standardowym sprzętem zrobotyzowanym do wykonywania zadań związanych z obsługą cieczy, takich jak inokulacja, karmienie i pobieranie próbek .

Stosując inne podejście Fluorometrix Corporation (Stow, Massachusetts, USA) opracowała konstrukcję wielonaczyniowego MSBR o nazwie Cellstation®. Ten MBR wykorzystuje technologię optyczną, aby umożliwić monitorowanie on-line in situ do 12 równoległych hodowli dla pH, DOT i gęstości optycznej (OD), a mieszanie jest zapewnione przez podwójne wirniki łopatkowe. Każdy zbiornik ma objętość roboczą do 35 ml i jest przymocowany do karuzeli, która obraca się, umożliwiając pobieranie próbek ze wszystkich zbiorników i monitorowanie ich sekwencyjnie. System czujników optycznych został zwalidowany poprzez wykazanie spójności czujników pH i DO przez okres 70 godzin w procesie hodowli komórek ssaków. Ponadto, grupa badawcza Rao na Uniwersytecie w Maryland, która ma bliskie powiązania z firmą, opublikowała ostatnio szczegóły dotyczące dwóch prototypów 24-dołkowych systemów MSBR, które jeszcze bardziej poprawiają wydajność tej technologii.

Wraz z rozwojem MSBR firma Dasgip AG (Jülich, Niemcy) wprowadziła kolbę Stirrer-Pro, część ich serii do hodowli komórek Fedbatch-Pro®, która obejmuje do 16 naczyń hodowlanych (objętość robocza 200-275 ml) i oferuje zdolność transferu tlenu napędzanego mieszaniem oraz możliwość podawania wsadu. pH i DOT mogą być monitorowane przy użyciu standardowych sond nadających się do sterylizacji i kontrolowane niezależnie dla każdego naczynia przez automatyczne dodawanie kwasu/zasady w płynie i odpowiednio szybkość przepływu powietrza/zmianę mieszania. Dodawanie substratów może być powiązane z punktami wyzwalającymi DOT lub pH, co umożliwia w pełni zautomatyzowaną pracę w trybie wsadowym. Połączenie mechanicznego mieszania (pomiędzy 10 – 1000 obr/min) i spargingu gazu wskazuje, że system ten jest zdolny do podtrzymywania szybko rosnących kultur bakterii do wysokiej gęstości komórek i dlatego mógłby być użyteczny w rozwoju takich bioprocesów. Jednakże, stosowana objętość robocza jest stosunkowo duża w porównaniu z większością innych omawianych systemów, a ustawienie jest skomplikowane przez obecność dużej liczby rurek i przewodów do dodawania i pomiarów. Wariant tego systemu zawierający do 16 kolb wstrząsowych wyposażonych w sondy pH został również opracowany, umożliwiając przerywane podawanie i równoległą kontrolę pH .

Jako mniejsza alternatywa dla laboratoryjnych STR zdolnych do pracy równoległej, takich jak system Sixfors® opracowany przez Infors AG (Bottmingen, Szwajcaria), naukowcy z University College London, we współpracy z HEL Group’s BioXplore bioreactor business (Barnet, Wielka Brytania) opracowali i scharakteryzowali 4 – 16 komorowy system MBR z w pełni zintegrowaną i zautomatyzowaną kontrolą DOT i pH. Chociaż każdy zbiornik ma maksymalną objętość roboczą 100 ml, co stanowi górną granicę technologii MSBR, opracowanie samodzielnego oprogramowania do monitorowania takich bioreaktorów jest krokiem w kierunku wyposażenia MBR w taki sam stopień kontroli i automatyzacji, jaki istnieje w przypadku konwencjonalnych bioreaktorów.

Miniaturowe reaktory z kolumną bąbelkową

Kolumny bąbelkowe wykorzystują rozpylanie gazu zamiast mieszania jako sposób promowania mieszania i przenoszenia masy tlenowej do hodowli komórek. Jako alternatywę dla urządzeń mieszanych lub wstrząsanych, opracowaliśmy miniaturowy reaktor z kolumną bąbelkową (MBCR), który jest oparty na MTP z porowatymi membranami (frits) działającymi jako cała podstawa każdej indywidualnej studni. Powietrze przenika przez frytę i przepływa w górę przez każdą studzienkę, dostarczając tlen do każdej rosnącej kultury. Zakładając, że każda fryta jest wykonana zgodnie z wysoką specyfikacją i ma identyczny stopień porowatości, natężenie przepływu do każdej kolumny jest równe i może być obliczone. Zapobiega to sztucznemu wpływowi wariancji natężenia przepływu powietrza na wyniki.

Doig et al. opisują szczegółowo budowę i charakterystykę prototypu 12-studzienkowego MBCR, który jest w stanie wspomagać aerobową hodowlę kultur Bacillus subtilis, przy czym każda kolumna ma objętość roboczą 2 ml. Wartości kLa odnotowano do 220 h-1 przy zastosowaniu metody dynamicznego odgazowania przy powierzchniowej prędkości gazu 0,02 ms-1. Jedną z zalet tego typu urządzenia jest to, że w przeciwieństwie do MTP, napowietrzanie odbywa się poprzez bezpośrednie sparging. Ma to wpływ na zwiększenie zdolności systemu do przenoszenia masy tlenu w stosunku do MTP, ponieważ sparging zwiększa powierzchnię dostępną dla przenoszenia masy gaz-ciecz w stosunku do samego napowietrzania powierzchniowego. Chociaż niektóre dane kLa dla MTP wyszczególnione w niniejszym przeglądzie są znacznie wyższe niż zmierzone wartości MBCR, należy podkreślić, że wiele wartości MTP uzyskano w raczej sztucznych warunkach zaprojektowanych w celu maksymalizacji przenoszenia tlenu, podczas gdy wartości kLa dla MBCR przedstawione powyżej byłyby odtwarzalne w warunkach hodowli komórek.

Oprócz dużej powierzchni dostępnej dla przenoszenia tlenu, brak mieszania w MBCR oznacza, że pobór mocy, a zatem przenoszenie tlenu jest łatwiejsze do modelowania niż w STR, ponieważ istnieje mniej parametrów do rozważenia, z powierzchowną prędkością gazu i rozkładem wielkości pęcherzyków będących kluczowymi parametrami w skalowaniu/obniżaniu skali kolumn pęcherzykowych. Ponadto urządzenie jest stacjonarne, w przeciwieństwie do wstrząsanego, co pozwala na łatwiejsze oprzyrządowanie, ponieważ w większości systemów MTP mieszanie musi zostać zatrzymane przed dokonaniem pomiaru w czytniku płytek. Prostota mechaniczna w połączeniu z potencjalnie wysokim transferem tlenu i łatwością pobierania próbek sprawia, że MBCR są odpowiednie do równoległej hodowli komórek. Może to służyć między innymi do ulepszania pożywek lub szczepów oraz do rozwoju procesów we wczesnych fazach. MBCRs mogą być również wykorzystywane do naśladowania i przewidywania wydajności reaktorów wielkoskalowych. W tym zakresie wykazaliśmy ostatnio dobrą korelację szybkości transferu tlenu z objętościowym zużyciem energii (P/V) dla miniaturowych (2 ml) i laboratoryjnych (100 ml) kolumn pęcherzykowych wykorzystujących dyfuzory gazu o tej samej wielkości porów, co pozwala na przewidywanie kLa jako funkcji P/V . W tej samej pracy wykazaliśmy również porównywalną wydajność hodowli komórek przy użyciu MBCR w stosunku do STR w skali laboratoryjnej w oparciu o równe wartości kLa. Wyniki te wskazują na potencjał MBCR jako urządzenia skalowalnego. To prototypowe urządzenie MBCR nie było oprzyrządowane, chociaż w kolejnych pracach wyposażyliśmy je w optyczne łaty fluorescencyjne i wykorzystaliśmy do pomiaru DOT podczas hodowli komórek. Temperaturę można było kontrolować poprzez podłączenie urządzenia do łaźni wodnej i cyrkulację wody o kontrolowanej temperaturze przez zamkniętą przestrzeń między kolumnami (patrz rysunek 3). Podobne reaktory MBCR zostały wcześniej opracowane przez innych; jednakże, naczynia te wykorzystują objętości około 200 ml i są zatem o dwa rzędy wielkości większe niż urządzenie opisane przez Doig et al. , ograniczając stopień osiągalnej pracy równoległej.

Inne miniaturowe urządzenia

Używając koncepcji zintegrowanej płytki z czujnikami, firma MicroReactor Technologies (Mountain View, CA, USA) opracowała hybrydowy system hodowli komórek oparty na wstrząsanej, przegrodowej 24-dołkowej płytce MTP z konfiguracją dołków, która umożliwia równomierny transfer ciepła na całej płytce. Sugerowana objętość robocza każdej studzienki wynosi od 3 do 5 ml, a powietrze jest wprowadzane do fazy ciekłej poprzez sparging przez zatoki umieszczone w podstawie każdej studzienki, co zwiększa zdolność przenoszenia tlenu w porównaniu do podobnie zaprojektowanych systemów wstrząsanych. To niedawno skomercjalizowane urządzenie do hodowli (licencjonowane w Europie przez Applikon Biotechnology AB, Holandia) jest oprzyrządowane przy użyciu sond światłowodowych do monitorowania DOT i pH online we wszystkich studzienkach jednocześnie. Urządzenie umożliwia również niezależną kontrolę temperatury, DOT, pH (poprzez sparging gazowy) i natężenia przepływu powietrza dla wszystkich 24 studzienek. Urządzenie pokonuje jeden z podstawowych problemów związanych z urządzeniami HT opartymi na MTP – a mianowicie jak dopasować oprzyrządowanie do wszystkich studzienek zawartych na płytce – poprzez przymocowanie wszystkich plastrów czujników do podstawy każdej studzienki, a następnie umieszczenie całej płytki na platformie inkubatora z wytrząsaniem, która posiada zintegrowane obwody oprzyrządowania, umożliwiając w ten sposób niezależne monitorowanie każdej studzienki. Główne zastosowanie będzie prawdopodobnie dotyczyło wczesnych etapów rozwoju procesu (np. wybór szczepu i optymalizacja pożywki). Nie ma jeszcze publicznie dostępnych danych na temat inżynieryjnej charakterystyki mieszania i transferu tlenu oraz porównania wydajności hodowli z danymi z bioreaktorów w skali laboratoryjnej.

Ostatnio pojawiły się opracowania mające na celu zmniejszenie skali MBR do submililitrowych objętości procesowych. Chociaż te miniaturowe systemy oferują największy zakres zastosowań w HT, istnieje praktyczna granica, jak małe mogą być objętości hodowli. Urządzenia, które wykorzystują zbyt małe objętości procesowe mogą okazać się niewykonalne do prowadzenia hodowli z wystarczającym monitorowaniem i pobieraniem próbek. Chociaż OD, DOT i pH mogą być monitorowane online, inne krytyczne parametry, takie jak stężenie substratu i wydajność produktu często nie są monitorowane; jednakże, może być możliwe obejście tego problemu dla niektórych procesów poprzez włączenie do produktu markerów, takich jak białko zielonej fluorescencji. Parowanie może stać się poważnym problemem w tak ekstremalnie małych objętościach hodowli, jeśli pracuje się z długimi procesami hodowli bakterii i komórek ssaków; również, biorąc pod uwagę ekstremalnie małą objętość procesu, byłoby technicznym wyzwaniem dokładne kontrolowanie pH poprzez dodawanie cieczy. Niemniej jednak, skala działania stanowi radykalny postęp w projektowaniu MBR i znacznie zwiększa ich potencjalne zastosowanie do równoległej hodowli komórek HT.

W tym zakresie, grupa badawcza Jensena z MIT opracowała submililitrowy prototyp MBR, który został zmodyfikowany i rozszerzony do systemu multipleksowego zdolnego do przeprowadzenia ośmiu oprzyrządowanych hodowli mikrokomórkowych o objętościach roboczych 150 μl . Przy użyciu standardowych metod mikrofabrykacji, studzienki hodowlane wykonane z PMMA i poli(dimetylosiloksanu) (PDMS) są unieruchomione na aluminiowej podstawie zawierającej wszystkie elementy czujnika, a transfer tlenu jest możliwy dzięki dyfuzji przez membranę gazoprzepuszczalną i mieszadła magnetyczne zdolne do sterowania mieszaniem indywidualnie dla każdego reaktora. DOT, pH i OD mogą być monitorowane online za pomocą sond optycznych. Grupa doniosła, że urządzenie może podtrzymywać hodowlę wsadową E. coli, jednak DOT spadł do 0% po 2-3 godzinach, prawdopodobnie w wyniku ograniczenia tlenowego. Jest to prawdopodobne, biorąc pod uwagę, że maksymalna wartość kLa zmierzona w tym MBR wynosiła tylko 75 h-1. Niemniej jednak, autorzy wykazali, że zachowanie wzrostu było porównywalne z tym uzyskanym przy użyciu szeregu większych urządzeń do hodowli komórek. Ta sama grupa badawcza przeprowadziła również szczegółową analizę ekspresji genów w mikromacierzy DNA E. coli hodowanej w MBR o pojemności 50 μl. Praca ta stanowi prawdziwy postęp w rozwoju MBR, ponieważ nie tylko pokazuje dowód zasady, ale także pozwala na wysoce równoległą analizę ekspresji genów i może być wykorzystana do lepszego zrozumienia fizjologii komórek podczas hodowli z zastosowaniem podejścia systemowego. Maharbiz i wsp. opisali rozwój urządzenia opartego na matrycy, łączącego reaktory mikrostudzienkowe z technologią mikrofabrykacji krzemu, które jest w stanie wspierać hodowlę E. coli w ośmiu studzienkach 250 μl jednocześnie. Podobnie jak w reaktorze MIT (opisanym powyżej) studzienki były umieszczone na płycie bazowej zawierającej czujniki do pomiaru pH i OD (DOT nie był mierzony, ale autorzy twierdzą, że byłoby to wykonalne). Tlen był generowany elektrochemicznie w każdej hodowli, a mieszanie było zapewnione przez kulkę ze stali nierdzewnej, która mieszała hodowlę, rozpraszając tlen i rozbijając pianę na powierzchni. Jednak ten zespół badawczy nie dostarczył żadnych danych porównawczych w skali laboratoryjnej, z którymi można by określić, czy skalowanie byłoby wykonalne z takiego urządzenia.

Inny komercyjny system do pracy w trybie HT został opracowany przez Bioprocessors Corp. (Woburn, MA, USA). To urządzenie do hodowli komórek (nazwane SimCell®) jest w stanie obsługiwać i niezależnie kontrolować do 1500 hodowli, co pozwala na zastosowanie metod pełnoczynnikowego projektowania eksperymentalnego do optymalizacji procesu. To urządzenie typu „reaktor na chipie” jest oparte na konstrukcji mikroprzepływowej z membraną gazoprzepuszczalną umożliwiającą transfer tlenu, a mieszanie jest zapewnione przez obracanie mikro-bioreaktorów w inkubatorach o kontrolowanym środowisku, wykorzystujących nawilżone powietrze w celu zminimalizowania parowania. System ten może być w wysokim stopniu zautomatyzowany i jest zintegrowany z robotem do przenoszenia płytek z inkubatora do stacji czujnikowej do pomiaru pH, DOT i gęstości komórek oraz stacji płynów, gdzie można dodawać media do pracy w trybie wsadowym oraz kwas/zasada do kontroli pH. Objętości w każdym reaktorze wynoszą od ok. 300 μl do ok. 700 μl w zależności od zastosowania (komórki drobnoustrojów lub ssaków), a każdy reaktor może pracować w trybie wsadowym, wsadowym z podawaniem lub perfuzyjnym. Wykazano, że urządzenie wspiera hodowlę E. coli i drożdży, dając kinetykę wzrostu porównywalną do tej uzyskiwanej przy użyciu konwencjonalnych STR. Firma opisała również wzrost komórek CHO bez ograniczenia tlenu przy dużej gęstości komórek i wykorzystała symulacje obliczeniowej dynamiki płynów (CFD), aby pokazać, w jaki sposób odtworzono środowisko fizyczne widoczne w bioreaktorach z łopatkami o dużej skali. kLa w systemie zostało zamodelowane przez CFD i oszacowane na 60 do 500 h-1, wartości podobne do tych, które można znaleźć w kolbach wstrząsanych i sub-optymalnych STR.

MBRs jako narzędzie do zmniejszania skali

Należy zauważyć, że nie wszystkie miniaturowe systemy do hodowli komórek są przeznaczone do zwiększania/ zmniejszania skali istniejących bioprocesów; w niniejszym przeglądzie wspomniano, jak takie urządzenia mogą być wykorzystywane do wielu zastosowań, takich jak ocena organizmów rekombinantów/dzikich typów na wczesnym etapie, ulepszanie szczepów i opracowywanie podłoży wzrostowych. Jednakże miniaturowe systemy wykorzystywane w późniejszych etapach rozwoju procesu, np. do optymalizacji działania i warunków hodowli, powinny być skalowalne. Z tego powodu istotne jest, aby dobrze ugruntowane metody „reguły postępowania”, często stosowane w przemyśle do skalowania procesów z laboratorium do zbiorników produkcyjnych, zostały zbadane w celu sprawdzenia, czy można je wykorzystać do skalowania z MBR. Te sprawdzone metody obejmują skalowanie na podstawie mocy gazowanej na jednostkę objętości, prędkości końcówki mieszadła, stałego DOT, zdolności przenoszenia masy tlenu (kLa) lub czasu mieszania. Nie istnieje jednak podejście „jeden rozmiar dla wszystkich” i dlatego należy podkreślić, że nie można uniwersalnie zastosować jednej podstawy równoważności do wszystkich MBR. Żaden z systemów wyszczególnionych w niniejszym przeglądzie nie może wykorzystać wszystkich ustalonych metodologii zwiększania/ zmniejszania skali opisanych powyżej. Na przykład stałą wartość DOT trudno jest osiągnąć w systemach wstrząsanych w porównaniu z konwencjonalnymi STR, ponieważ brak mechanicznego mieszania (i spargingu – w przypadku systemów opartych na MTP) oznacza, że kontrola poziomów DOT powyżej poziomu krytycznego w tych urządzeniach jest technicznie bardzo trudna. Ta szczególna cecha sama w sobie nie stanowi problemu tak długo, jak długo hodowane komórki są wystarczająco wolno rosnące (albo naturalnie albo przez zastosowanie słabego podłoża i/lub działanie w temperaturze nie sprzyjającej maksymalnemu tempu wzrostu), ale ogranicza ona zastosowanie takich systemów do wykonywania wielu procesów o wysokiej gęstości komórek, w których występują szybko rosnące mikroorganizmy o wysokim zapotrzebowaniu na tlen.

Wskazówkę co do tego, które kryterium zmniejszania skali powinno być stosowane dla danego bioprocesu (a zatem wskazówkę co do tego, która platforma miniaturyzacji jest preferowana dla tego procesu) można uzyskać poprzez zbadanie charakterystyki komórek i warunków procesowych danego bioprocesu. Dla szybko rosnących organizmów, takich jak E. coli lub Bacillus subtilis, ograniczeniem jest zwykle przenoszenie tlenu, podczas gdy naprężenia ścinające nie stanowią prawdopodobnie istotnego problemu; dlatego też zmniejszanie skali takiej hodowli komórkowej można zaprojektować na podstawie równego specyficznego poboru mocy lub na podstawie równego kLa. Jednakże, warunkiem wyboru równego kLa jest możliwość dokładnego oszacowania poboru mocy do miniaturowego bioreaktora. Prace przeprowadzone na UCL w 10 ml MBR potwierdzają wcześniejsze prace Bujalskiego et al., które wykazały, że liczba mocy wirnika maleje wraz ze średnicą zbiornika. Dlatego ważne jest, aby nie używać liczb mocy wirnika w skali konwencjonalnej do szacowania poboru mocy w MBR, ponieważ może to prowadzić do ograniczenia tlenu dla szybko reagujących mikrobów poprzez przeszacowanie mocy przekazywanej do systemu.

Szczególnym wyzwaniem jest wzrost organizmów nitkowatych ze względu na ich złożoną morfologię. Buliony fermentacyjne zawierające takie organizmy mają stosunkowo wysoką lepkość i wymagają dodatkowych nakładów mocy w celu utrzymania odpowiedniego mieszania i przenoszenia masy. Ponadto, organizmy nitkowate są znacznie większe niż bakterie jednokomórkowe i mogą być bardziej podatne na uszkodzenia przy ścinaniu. Na przykład Heydarian i wsp. podali, że średnia długość hyfusów bakterii Saccharopolyspora erythraea wytwarzającej erytromycynę przekroczyła mikroskalę turbulencji Kołmogorowa w standardowym bioreaktorze o pojemności 7 L w szerokim zakresie warunków roboczych. W przypadku S. erythraea wykazano, że jeśli mycelia jest nadmiernie ścinana, co skutkuje zbyt małą długością hyfusów, może to mieć wpływ na tworzenie produktu erytromycyny. Z tego powodu może być wskazane wybranie prędkości końcówki jako podstawy zmniejszania skali przy stosowaniu organizmów nitkowatych. Chociaż mechanizmy rządzące tworzeniem granulek w kulturach nitkowatych nie są dobrze poznane, Vecht i wsp. wykazali korelację pomiędzy zmniejszającą się OTR i redukcją średniej wielkości granulek u Streptomyces tendae . Stwierdzili oni, że tworzenie się granulek w tym organizmie jest głównie wynikiem oddziaływań hydrofobowych kontrolowanych przez DOT. Biorąc pod uwagę szkodliwy wpływ, jaki tworzenie się granulek może mieć na produkcję metabolitów wtórnych u wielu organizmów nitkowatych – ze względu na zahamowanie poboru tlenu do środka granulki wzrastające wraz ze średnicą granulki – jest oczywiste, że w celu zmniejszenia skali procesów hodowli komórek nitkowatych, MBR muszą utrzymywać poziomy rozpuszczonego tlenu występujące w procesie na dużą skalę, na którym opiera się zmniejszenie skali, aby utrzymać wydajność produktu. Równe kLa jest trudne do zastosowania przy zmniejszaniu skali, ponieważ jest ono zwykle obliczane w systemach modelowych, które w niewielkim stopniu przypominają rzeczywiste buliony fermentacyjne. Ponadto, na kLa mają wpływ zmiany koalescencji i reologii bulionu hodowlanego w trakcie procesu hodowli – zmiany, które są bardzo trudne do zmierzenia i uwzględnienia. Kluczem przy wyborze podstawy do zmniejszania skali bioreaktora jest nie narażanie komórek na naprężenia przekraczające te spotykane w dużej skali.

Spośród miniaturowych urządzeń omawianych w tym przeglądzie, jasne jest, że niektóre z nich dążą do odwzorowania bioreaktorów wielkoskalowych w ich geometrii. Na przykład, większość MSBR i MBCR to geometryczne faksymile bioreaktorów wielkoskalowych. Zachowanie podobieństwa geometrycznego jest korzystne dla efektywnego porównania skali, ponieważ pozwala na zachowanie pewnych kluczowych założeń; np. zachowanie jednakowego współczynnika kształtu pozwala przewidzieć ciśnienie hydrostatyczne, a tym samym rozpuszczalność tlenu w różnych skalach działania. Daje to korzyści takim urządzeniom, ponieważ ich mechanizmy osiągania transferu tlenu i mieszania oraz obliczania poboru mocy mogą być oparte na tych samych zasadach ustalonych w dużej skali. Dynamika płynów będzie podobna, chociaż należy zauważyć, że niektóre bezwymiarowe liczby opisujące dynamikę płynów, na przykład liczba Reynoldsa w mieszalnikach, wydają się mieć mniejszy wpływ w tak małych skalach. Bardziej fundamentalne jest pytanie, jak skuteczne mogą być MBR, gdy osiągną tak małe rozmiary, że ich właściwości przepływu i mechanizmy przenoszenia masy i mieszania różnią się od tych występujących w bioreaktorach wielkoskalowych, które starają się naśladować. Szczególnie narażone są na to MTP, ponieważ brak mechanicznego mieszania oznacza, że efekty napięcia powierzchniowego mają większe znaczenie niż w MSBR, gdzie wirniki mogą zmniejszyć ten efekt i pomóc w utrzymaniu efektywnego mieszania płynów. Ponadto istnieje niebezpieczeństwo, że przy zastosowaniu ekstremalnych warunków w MTP (pod względem częstotliwości wstrząsania i objętości wypełnienia) cała ciecz procesowa utworzy cienką warstwę wzdłuż wewnętrznej powierzchni studni, co poważnie ograniczy mieszanie i nasili szkodliwy efekt napięcia powierzchniowego. Różne reżimy przepływu w MBR spowodowane różnymi metodami mieszania mogą mieć wpływ na zdolność takich systemów do odtwarzalnego prowadzenia hodowli komórek; jeśli warunki są różne w małej i dużej skali pod względem mieszania i przenoszenia masy gaz-ciecz, może to prowadzić do problemów, np. wyboru klonów nieodpowiednich do produkcji lub różnic w jakości produktu, szczególnie w przypadku białek rekombinowanych. Z drugiej strony, praca Micheletti et al. wskazuje, że przejście z systemów wytrząsanych na mieszane jest możliwe, jeśli kryteria skalowania są starannie dobrane. Wykorzystując niedawno wprowadzoną korelację do przewidywania kLa w MTP, udało im się z powodzeniem zwiększyć skalę hodowli E. coli wykazującej ekspresję enzymu transketolazy z systemu mikrostudzienek (1 mL objętości) do 1,4 L STR na podstawie stałej kLa. Ta sama grupa dostarcza również wstępnych danych na temat zadowalającego skalowania procesu hodowli komórek ssaków przy użyciu stałej średniej szybkości rozpraszania energii .

Automatyzacja MBR

Automatyzacja MBR jest kluczem do rozszerzenia możliwości HT. Kilka z miniaturowych systemów ostatnio opracowanych wykorzystuje zmodyfikowany MTP jako punkt wyjścia (np. i Applikon MicroReactor ®). Systemy te wydają się być bardzo obiecujące ze względu na łatwość ich integracji z istniejącymi platformami automatyzacji robotyki. MTP, na których takie systemy są zaprojektowane, są oparte na standardowej powierzchni podstawy, są mechanicznie proste, a sama standaryzacja ich konstrukcji czyni je idealnymi do wbudowania w zautomatyzowane, zrobotyzowane platformy, które naprawdę przenoszą takie technologie do domeny HT, nadając im zdolność do przeprowadzania setek hodowli komórek równolegle, przy wykorzystaniu powierzchni niewiele większej niż powierzchnia konwencjonalnego bioreaktora w skali pilotażowej. Alternatywą jest opracowanie miniaturowego systemu bioreaktorów, który sam w sobie jest podatny na automatyzację. Przykładem takiego podejścia są technologie opracowane przez grupę Weuster-Botz we współpracy z H + P Labortechnik i Bioprocessors Corp. Urządzenia te oferują pewien stopień możliwości HT, jak również zaawansowaną wbudowaną robotykę w przypadku systemu SimCell® firmy Bioprocessors Corp.

Urządzenia robotyczne stosowane w połączeniu z MBR zazwyczaj posiadają głowice pipetujące zamontowane na ramionach, które są w stanie poruszać się w trzech wymiarach po całym obszarze roboczym. Głowice pipetujące mogą również radzić sobie z różnymi geometriami MBR, a oddzielne ramiona robotyczne mogą pobierać i umieszczać sprzęt pomocniczy w dowolnym miejscu w przestrzeni roboczej. Możliwość podnoszenia i umieszczania oznacza, że jeden robot może inokulować, kontrolować pH, pobierać próbki i uzupełniać MBR, oferując w ten sposób prawdziwie zintegrowane rozwiązanie. Ponadto roboty mogą łączyć platformy do hodowli komórek z instrumentami analitycznymi (np. systemami HPLC) i przeprowadzać złożone testy, takie jak ELISA dla produktów przeciwciał, wykorzystując próbki w czasie rzeczywistym – testy, które wykorzystują zdolność robota do wykonywania tysięcy operacji związanych z obsługą cieczy w krótkim czasie. Aseptyczne warunki hodowli komórek mogą być utrzymywane dzięki umieszczeniu robota w specjalnie skonstruowanej szafie bezpieczeństwa biologicznego.