Najczęściej używane testy apoptozy w badaniach nad apoptozą
Pytanie:
Jakie są najczęściej używane testy apoptozy?
The Protein Man Says:
Badania nad apoptozą wymagają zastosowania szerokiej gamy testów apoptozy, ponieważ sam proces jest dość skomplikowany. Dodatkowo, nie ma jednego parametru, który mógłby zdefiniować śmierć komórki we wszystkich systemach, więc należy użyć kilku podejść w swoich badaniach.
Główne typy testów apoptozy
Istnieje pięć różnych typów testów apoptozy, które są obecnie używane w badaniach apoptozy. Obejmują one testy kaspaz, testy fragmentacji DNA, testy przepuszczalności komórek i testy mitochondrialne. Ponadto, istnieje również rodzaj testów, które mogą być stosowane w celu ułatwienia analizy szlaków sygnalizacyjnych apoptozy.
Atesty kaspazy. Obecność enzymów kaspazy w dowolnej próbce jest pewnym wskaźnikiem, że zachodzą złożone wydarzenia biochemiczne związane z apoptozą. W związku z tym, testy kaspazowe mogą być stosowane do wykrywania apoptozy w populacjach komórek podczas jej najwcześniejszych etapów. Te testy rutynowo wykorzystują specyficzne substraty, które są trawione przez kaspazy w celu uwolnienia substratów kolorymetrycznych lub fluorometrycznych.
Testy fragmentacji DNA. Apoptoza i rozszczepianie DNA idą ze sobą w parze, więc można określić stopień apoptozy poprzez pomiar fragmentów DNA obecnych w próbce. Większość badaczy wykorzystuje do tego celu analizę drabinkową apoptycznego DNA, kwantyfikację ELISA oraz testy TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling).
Testy przepuszczalności komórek. Średnie stadium apoptozy może być określone za pomocą testów przepuszczalności komórek. Jak zapewne wiesz, zdrowe komórki mają sztywne błony plazmatyczne, podczas gdy martwe komórki mają wysoce przepuszczalne błony komórkowe. Z ich wysoce naruszonymi błonami, barwniki fluorescencyjne mogą łatwo przechodzić przez komórki apoptyczne. Kiedy tak się stanie, zaobserwujesz charakterystyczną fluorescencję lub wzór barwienia, który wskazuje na obecność populacji komórek apoptopowych w twojej próbce.
Zwiększenie przepuszczalności komórek powoduje również utratę białek cytozolowych z komórki. Dehydrogenaza mleczanowa (LDH) jest rozpuszczalnym enzymem cytozolowym, który jest uwalniany do medium hodowlanego po utracie integralności błony wynikającej z apoptozy lub nekrozy. Aktywność LDH może być zatem stosowana jako wskaźnik integralności błony komórkowej i służy jako ogólny środek do oceny cytotoksyczności wynikającej ze związków chemicznych lub środowiskowych czynników toksycznych. Istnieje kilka testów do ilościowego oznaczania uwolnionej LDH.
Atesty mitochondrialne. Testy mitochondrialne mogą pomóc w określeniu wczesnego etapu apoptozy, ponieważ wykorzystują barwnik kationowy, który daje inną fluorescencję, gdy jest stosowany w populacjach zdrowych komórek i w populacjach komórek apoptycznych.
Znajomość tego, których testów apoptozy używać i kiedy ich używać, może znacznie pomóc w badaniach, więc lepiej zacząć je znać na pamięć.
Znajomość tego, których testów apoptozy używać i kiedy ich używać, może znacznie pomóc w badaniach, więc lepiej zacząć je znać na pamięć.