New insights into apoptosome structure and function

Wcześniejsze informacje strukturalne były krytyczne w ujawnianiu organizacji domeny apoptosomu. Ludzki apoptosom zawiera siedem cząsteczek Apaf-1 symetrycznie rozmieszczonych w strukturze w kształcie koła, tworząc centralną piastę składającą się z NODs z siedmioma przedłużonymi ramionami HD2, z których każde kończy się regionem w kształcie litery V, który jest tworzony przez dwa β-śmigła . Fałdy α/β NBD i HD1 wiążą między sobą ADP/dATP, podczas gdy powtórzenia WD40 tworzą 7- i 8-łopatkowe śmigła β. Wbrew wcześniejszym sugestiom stwierdzono, że boczne oddziaływania pomiędzy fałdami α/β sąsiadujących cząsteczek Apaf-1 są wykorzystywane do organizacji centralnej piasty, podczas gdy N-końcowe CARDs siedzą powyżej tego pierścienia i są nieuporządkowane w nieobecności pc-9 (PDB 3J2T) . Jednak ostatnie struktury bliskie atomowym wykazały, że Apaf-1 CARDs tworzą dyskopodobną cechę na powierzchni aktywnego apoptosomu w obecności pc-9 CARDs, a ten układ różni się od tego, który znajduje się w CED-4 i Dark (ryc. 1 i 2) . Stabilność centralnej piasty jest utrzymywana przez złożoną sieć oddziaływań α-helikalnych, wiązań wodorowych i mostków solnych pomiędzy sąsiadującymi modułami NBD i HD1 z sąsiednich cząsteczek Apaf-1 . Kontakty WHD/HD1 na sąsiednich protomerach wydają się wspierać składanie apoptosomu z domenami WHD mostkującymi sąsiednie domeny NBD i HD1. Podobnie jak w Dark, helisa ISM w Apaf-1 (α12) jest sparowana z helisą α13 poprzez rozległe oddziaływania hydrofobowe, tworząc motyw helisa-pętla-helisa w każdej podjednostce, które z kolei oddziałują bocznie z sąsiednimi podjednostkami, tworząc helikalny płot, który tworzy centralny por w pierścieniu.

W zdrowych komórkach, monomery Apaf-1 istnieją w zamkniętej, nieaktywnej konformacji z ADP osadzonym w szczelinie w interfejsie NBD-HD1 (PDB 1Z6T, 3SFZ) . Ta zamknięta konformacja zapowiada wymóg rozległych zmian konformacyjnych monomeru, aby ułatwić tworzenie apoptosomów. W przeciwieństwie do tworzenia apoptosomów u C. elegans i Drosophila, cytochrom c uwalniany z mitochondriów podczas sygnalizacji apoptozy wiąże się z monomerycznym Apaf-1, który wyzwala zmiany konformacyjne prowadzące do wymiany nukleotydów (ATP lub dATP może zastąpić ADP), a następnie oligomeryzacji rozszerzonego Apaf-1 w celu utworzenia apoptosomu (ryc. 3). Aby zrozumieć zachodzące zmiany konformacyjne, potrzebne są dokładne modele nieaktywnych i rozszerzonych stanów Apaf-1. Wyznaczono dwie struktury krystaliczne nieaktywnych monomerów Apaf-1 ze związanym ADP, przy czym w jednej z nich brakuje β-pędników, a w drugiej N-końcowych domen CARD w celu ułatwienia krystalizacji. Jednakże, NOD w tych dwóch formach krystalicznych jest praktycznie identyczny, co pozwoliło na skonstruowanie modelu konsensusowego dla całego monomeru Apaf-1 ze związanym ADP. Bliskie struktury atomowe ludzkiego apoptosomu zostały obecnie uzyskane przez kilka grup przy użyciu jednocząsteczkowej krio-EM, aby zapewnić wgląd w rozszerzoną konformację Apaf-1 w nieobecności i obecności pc-9 (PDB 3JBT, 5JUY, 5WVE; Rys. 3) . Zgodnie z przewidywaniami, konformacja Apaf-1 w centralnej piaście, ramionach HD2 i regionie regulacyjnym jest zasadniczo identyczna zarówno w nieaktywnych, jak i aktywnych apoptosomach. Badania te dostarczyły ważnych szczegółów dotyczących specyficznych reszt zaangażowanych w międzydomenowe kontakty van der Waalsa w obrębie pojedynczych cząsteczek Apaf-1, ujawniły reszty krytyczne dla interakcji domenowych, które stabilizują aktywny apoptosom, i wykazały interakcje w obrębie V-kształtnej domeny czujnika tandemowych 7- i 8-łopatkowych β-śmigieł, które tworzą powierzchnię wiążącą cytochrom c

W apoptosomie Apaf-1 miejsce wiążące dATP znajduje się na interfejsie NBD-HD1 i jest utworzone częściowo przez pętlę Walkera A i pętlę między HD1 i WHD. Podczas gdy Apaf-1 może wiązać ADP w stanie nieaktywnym, istnieje niewielka preferencja do używania dATP do montażu apoptosomu in vitro (przegląd w ref. ), podczas gdy ATP jest znacznie bardziej obfite in vivo (~ 2 mM dla ATP vs. 10 μM dla dATP). Pewna stabilizacja zachodzi poprzez oddziaływania pomiędzy resztami argininowymi (Arg265) w NBD, a także Ser325 i Tyr359 w HD1 oraz związaną cząsteczką ATP/dATP. Obrót pary NBD-HD1 wokół helisy α 20 w WHD pozycjonuje pętlę HD1-WHD na dnie kieszeni nukleotydowej, co pozwala parze NBD-HD1 na tworzenie oddziaływań obwodowych w piastze centralnej podczas montażu. Przerywa to również interakcje z WHD, które normalnie stabilizują zamkniętą konfigurację .

Sensorowe β-śmigła i wiązanie cytochromu c

„Szprychy” koła apoptosomu wystają na zewnątrz z piasty przez domeny HD2, a każde ramię tworzy podstawę regionu w kształcie litery V zawierającego dwie domeny sensorowe β-śmigła. W najdłuższej izoformie Apaf-1 (Apaf-1XL), która ulega ekspresji w większości tkanek, piętnaście powtórzeń WD40 tworzy tandemowe 7- i 8-łopatkowe β-śruby, a ostatnie badanie krio-EM wykazało, że ma to nowy mechanizm zamknięcia. Ta topologia β-śrub jest podobna do tej, którą można znaleźć w białku oddziałującym z aktyną (Aip1p), w którym linker z HD2 tworzy d-strand ostatniej łopatki w 8-łopatkowym β-śrubie (wskazany przez mały niebieski region obecny na początku 7-łopatkowej łopatki na Rys. 1a), przed przejściem do formowania 7-łopatkowej β-śruby. Ta topologia została zweryfikowana przez strukturę krystaliczną murine Apaf-1 w rozdzielczości 3,0 Å i wydaje się być zachowana w ciemnych β-śrubach .

W apoptosomie Apaf-1, V-kształtne β-śruby tworzą kieszeń wiążącą cytochrom c, a interakcja z cytochromem c wydaje się być stabilizowana przez wiązania wodorowe i mostki solne . Zarówno zredukowane, jak i utlenione formy cytochromu c mogą oddziaływać z apoptosomem, pośrednicząc w jego aktywacji. Co ciekawe, cytochrom c wydaje się oddziaływać preferencyjnie z ośmiołopatkowym β-śrubowcem, podczas gdy bardziej ograniczona powierzchnia kontaktu tworzy się z siedmiołopatkowym β-śrubowcem. Cytochrom c jest rozwiązany w rozdzielczości ~ 6 Å w nowych mapach, z powodu lokalnego ruchu, a cząsteczka jest obrócona o ~ 90°, w stosunku do wcześniejszego modelu opartego na dokowaniu molekularnym do mapy, gdzie heliksy nie były rozwiązane. Ukierunkowana mutageneza ujawniła krytyczne reszty w cytochromie c wymagane do stabilnego stowarzyszenia z β-śrubami Apaf-1, a niektóre z tych reszt (G56, P76, I81) są ważne dla tworzenia apoptosomów i późniejszej aktywacji kaspaz .

Skrócone cząsteczki Apaf-1 pozbawione regionów powtórzenia WD-40 mogą również składać się w celu utworzenia apoptosomów, które są konstytutywnie aktywne, ale z czasem ulegają rozpadowi . Sugeruje to, że β-propellers mogą być nieco hamujące dla montażu, jednocześnie stabilizując apoptosom Apaf-1 . Jednakże β-propellers w apoptosomie Apaf-1 są zlokalizowane na dużym promieniu i nie oddziałują z sąsiednimi podjednostkami, ani z innymi domenami w monomerze, z wyjątkiem HD2. Stąd mechanizm destabilizacji pozostaje tajemniczy. Chociaż jest to spekulacja, brak β-śmigieł w okrojonych apoptosomach może osłabiać interakcje HD2 z centralną piastą prowadząc do zależnego od czasu demontażu.

Jest teraz jasne, że wiązanie cytochromu c powoduje rotację w górę regionu β-propeller, który zakłóca połączenie między 7-listkowym β-propellerem i parą NBD-HD1 w nieaktywnym monomerze Apaf-1 , podczas gdy 7-listkowy β-propeller obraca się w kierunku 8-listkowego β-propeller w ruchu zaciskającym . Zdarzenia te destabilizują konformację autoinhibitowanej Apaf-1 i ułatwiają wymianę nukleotydów poprzez promowanie zmian konformacyjnych, które odsłaniają kieszeń wiążącą ADP, umożliwiając wiązanie ATP/dATP. Stabilizuje to monomer Apaf-1 w przedłużonej konformacji, tak że może on oddziaływać z sąsiednimi protomerami. Eksperymenty z przesunięciem pasma sugerują, że wymiana nukleotydów i związane z nią zmiany konformacyjne w Apaf-1 mogą zachodzić w odpowiedzi na wiązanie cytochromu c, ponieważ nie wykryto znaczących zmian w konformacji Apaf-1 po dodaniu dATP w nieobecności cytochromu c. Dane te razem wzięte wspierają model sekwencyjny, w którym wiązanie cytochromu c następuje przed wymianą nukleotydów, aby ułatwić przejście z zamkniętej do rozszerzonej konformacji Apaf-1. Ponadto, wyniki te wskazują, że powtórzenia WD40 działają jako czujniki, które wyzwalają początkowe składanie apoptosomu przez wiązanie cytochromu c.

Możliwe mechanizmy aktywacji prokaspazy-9

Prokaspaza-9 jest rekrutowana przez apoptosom w celu utworzenia holoenzymu, który zwiększa jej aktywność katalityczną . W roztworze, pc-9 jest konstytutywnym monomerem, gdy nie jest związana z Apaf-1, podczas gdy aktywne kaspazy w ogóle są dimerami. Co godne uwagi, dimeryczna interakcja pomiędzy dwoma monomerami pc-9 w sieci krystalicznej sprzyja tworzeniu się miejsca aktywnego na jednej podjednostce katalitycznej, podczas gdy druga podjednostka pozostaje w konfiguracji nieaktywnej (PDB 1JXQ), a podobne zjawisko występuje w dimerach CED-3 w wysokim stężeniu. N-końcowy CARD w pc-9 oddziałuje z Apaf-1 CARD(s) w celu rekrutacji apikalnej prokaspazy do apoptosomu, a to sprzyja aktywacji domeny katalitycznej, która jest oddzielona od CARD długim linkerem (Rys. 2a) . Ponadto, podjednostki p20 i p10 domeny katalitycznej są również połączone linkerem, który podlega samookleszczeniu. Tak więc, aby zrozumieć, jak pc-9 jest aktywowany, musimy zrozumieć rolę CARDs i linkerów pc-9 w holo-apoptosomie.

Zaproponowano różne modele, które wyjaśniają mechanizmy aktywacji pc-9 przez apoptosom . Model dimeryzacji indukowanej bliskością” przewiduje, że rekrutacja cząsteczek pc-9 do apoptosomu Apaf-1 może ułatwić homodimeryzację, która, jak się uważa, prowadzi do autoaktywacji pc-9. Jednak do niedawna żadne dowody strukturalne ani biochemiczne nie wykazały, że pc-9 jest homodimerem, gdy wiąże się z apoptosomem (patrz poniżej ). W „modelu konformacji indukowanej” zaproponowano, że apoptosom Apaf-1 jest platformą, która wiąże pc-9 w celu ułatwienia jego aktywnej konformacji. Ostatnie modelowanie sugerowało, że aktywacja pc-9 jest pośredniczona głównie poprzez regulację allosteryczną przez platformę apoptosomu . We wszystkich tych modelach podstawową funkcją apoptosomu jest złożenie multimerycznego kompleksu między Apaf-1 i pc-9 CARDs w celu ułatwienia aktywacji pc-9 poprzez zwiększenie lokalnego stężenia zymogenu . Ponadto dane dotyczące zmodyfikowanego pc-9, który jest konstytutywnym dimerem w roztworze, sugerują, że CARD i jego łącznik mogą hamować domeny katalityczne. W związku z tym tworzenie heterodimeru CARD na apoptosomie może uwolnić tę inhibicję, jednak pomysł ten pozostaje do zbadania.

Choć dimeryzacja może odgrywać kluczową rolę w aktywacji, jak to się dzieje na apoptosomie pozostało niewyjaśnione, a w rzeczywistości ostatnie dane sugerują możliwość bardziej skomplikowanego mechanizmu aktywacji, który obejmuje zarówno homodimeryzację cząsteczek pc-9, jak i tworzenie heterodimeru pojedynczej domeny katalitycznej pc-9 z NBD Apaf-1 . Co intrygujące, nieaktywna konformacja monomeru Apaf-1 nie wyklucza wiązania pc-9 poprzez interakcje CARD-CARD, jak wykazały eksperymenty z przesunięciem pasma. Tak więc, heterodimery pc-9/Apaf-1 mogą być rekrutowane do składającego się apoptosomu jako część jego aktywacji (Fig. 3). Pozostaje otwartym pytaniem, czy składanie Apaf-1 w obecności pc-9 jest kierowane przez dodatkowe interakcje między CARDs w powstającym dysku.

Wstępna struktura krystaliczna ujawniła stabilny kompleks 1:1 między domenami CARD Apaf-1 i pc-9 z komplementarnym interfejsem (znanym jako typ I), który jest niezbędny do aktywacji pc-9 . Jednakże, ten stabilny kompleks 1:1 okazał się później niewystarczający do aktywacji pc-9. Zamiast tego, Apaf-1 i pc-9 CARDs tworzą kompleksy oligomeryczne wyższego rzędu, stabilizowane głównie przez dwa z trzech możliwych interfejsów (znanych jako Typ I, II i III), które występują również w innych kompleksach domen śmierci. Porównanie interakcji zaangażowanych w tarczę CARD-CARD w apoptosomach CED-4, Dark i Apaf-1, podkreśla pewne zachowanie interfejsów typu II i III, przy czym interakcje typu I CARD występują tylko w ludzkim apoptosomie. Niedawna struktura krystaliczna o rozdzielczości 2,1 Å ujawniła heterotrimeryczny kompleks składający się z dwóch CARD Apaf-1 z CARD pc-9 umieszczonym pomiędzy nimi. Interakcje typu II obejmujące reszty w pc-9 (Arg36/ Arg65) i Apaf-1 (Glu78) CARDs okazały się krytyczne dla aktywacji pc-9, wraz z interakcjami typu I opisanymi wcześniej. Ponadto, pojedyncza reszta (Glu41 w karcie CARD Apaf-1) może tworzyć bifurkowaną interakcję z kartą CARD pc-9 w minimalnym interfejsie typu III. Wykazano również, że dodatkowe interakcje z Lys58 i Lys62 na karcie CARD Apaf-1 są wymagane do aktywacji pc-9 i mogą pomóc w pozycjonowaniu kart CARD Apaf-1 na platformie. Tak więc, tworzenie heterotrimerycznego kompleksu CARD zapewnia środki do wiązania wielu domen katalitycznych pc-9 do platformy apoptosomu .

Dwie struktury o bliskiej rozdzielczości atomowej aktywnego apoptosomu Apaf-1 ujawniły ogólną architekturę układu dysku Apaf-1 i pc-9 CARD tworzy przechylony dysk, który siedzi w powyżej centralnej piasty (Fig. 2 i 3) . Niedopasowanie symetrii pomiędzy dyskiem a platformą skutkuje acentrycznym ustawieniem dysku CARD, gdy patrzy się na niego z góry (Rys. 3) . Dysk może być opisany jako spirala par Apaf-1 i pc-9 CARD z czterema Apaf-1 CARD tworzącymi dolną „warstwę”, podczas gdy trzy lub cztery pc-9 CARD są obecne na górnej powierzchni (Rys. 2b-d). Ponadto, Apaf-1 CARDs przemieszczają się dalej od powierzchni centralnej piasty, ponieważ spiralnie wznoszą się w górę w sposób lewoskrętny, a zatem mają inne konformacje linkera i inne oddziaływania z ich kognatycznymi NBDs w centralnej piastze. Pary CARD Apaf-1 i pc-9 oddziałują poprzez interfejsy typu II, a łączą się bocznie wokół spirali głównie poprzez oddziaływania typu I. Co ciekawe, tylko cztery z siedmiu Apaf-1 CARDs oddziałują z pc-9 CARDs w dysku. Dzieje się tak dlatego, że pozostałe trzy cząsteczki Apaf-1 CARD nie mieszczą się łatwo we wzorze wiązania podjednostkowego spirali i nie mogą kontynuować spirali, ponieważ ich łączniki CARD-NBD są zbyt krótkie. Apaf-1 CARDs z sąsiednich podjednostek apoptosomu znajdują się w miejscu szwu (pomiędzy pozycjami 1a i 7a), gdzie spirala przestaje się wydłużać pionowo (Rys. 2c, d). Formacja dysku Apaf-1/pc-9 CARD jest wymagana do aktywacji apoptosomu, a domeny katalityczne pc-9 są elastycznie połączone z CARD poprzez linker (Rys. 2a). W jednej strukturze uwidoczniono dysk z czterema Apaf-1 CARDs i trzema pc-9 CARDs, ze słabą gęstością wskazującą, że czwarty pc-9 CARD może wiązać się z wierzchołkiem spirali helikalnej przy niższym obłożeniu. W drugiej strukturze, dominująca konfiguracja dysku zawierała 8 CARDs, przy czym konformacja CARDs w spirali była bardzo podobna pomiędzy dwoma niezależnie rozwiązanymi strukturami (patrz nakładka, Rys. 2d). Różnice w pH i stężeniu soli mogą odpowiadać za różne zajęcie pozycji ósmej. Tak więc montaż apoptosomu promuje rekrutację i lokalne stężenie pc-9 CARDs, co pozwala na tworzenie nowego oligomeru helikalnego z 7 lub 8 CARDs.

Najnowsza analiza (przez MALS i SAXS) wykazała, że tworzenie kompleksu CARD jest zależne od stężenia i równe ilości Apaf-1 i pc-9 CARDs asocjują jako pary przez silniejszy interfejs typu I, z dominującym kompleksem 3:3 tworzonym przy wysokim stężeniu w roztworze. Ten kompleks CARD został skrystalizowany, a struktura określona w rozdzielczości 3,0 Å ujawniła lewoskrętną spiralę trzech par Apaf-1/pc-9 CARD o konformacji podobnej do obserwowanej w apoptosomie, ale z pewnymi różnicami (PDB 5WVC; Fig. 2e) . Środowisko w krysztale jest jednak zupełnie inne niż to, z którym mamy do czynienia w apoptosomie, częściowo z powodu kontaktów sieciowych i braku powierzchni nukleacyjnej z ograniczeniami narzuconymi przez łączniki CARD-NBD. Może to tłumaczyć obserwowane różnice pomiędzy helikalnymi strukturami CARD. Obejmuje to dodanie jednego lub dwóch dodatkowych CARD do spirali przypominającej dysk w holo-apoptosomie i posiadanie czterech CARD Apaf-1, które tworzą podstawę dysku, a nie trzech, jak znaleziono w roztworze i w krysztale. Po optymalnym dopasowaniu dysku 8 CARD ze spiralą 6 CARD ze struktury krystalicznej, istnieje dobra zgodność między CARD w pozycjach 2p, 3a i 4p, z pewną rozbieżnością w drugiej połowie spirali 6 CARD (Rys. 2f, g). W szczególności, Apaf-1 CARD w pozycji 7a jest przesunięta pionowo do pozycji pośredniej, przy braku Apaf-1 CARD w pozycji 1a (Rys. 2g). Tak więc interakcje między platformą a dyskiem CARD są krytyczne dla zarodkowania większych spirali 7 i 8 CARD znalezionych na apoptosomie.

Podczas montażu dysku, zarodkowanie spirali może wystąpić na różne sposoby, w tym tworzenie heterotrimeru CARD składającego się z dwóch Apaf-1 CARD i jednego pc-9 CARD, z Apaf-1 CARD umieszczonym u podstawy spirali (w pozycji 1a). Kolejne dodanie dwóch par Apaf-1/pc-9 CARD, które oddziałują poprzez swoje interfejsy typu I, może następnie nastąpić z ostatecznym zamknięciem spirali przez pc-9 CARD w pozycji 8p w niektórych przypadkach. Jednakże możliwe są inne permutacje, biorąc pod uwagę elastyczną naturę linkera Apaf-1 CARD-NBD, tak że trzy pary Apaf-1/pc-9 CARD „typu I” mogą być zarodkowane kolejno z centralnego węzła, z dodatkiem Apaf-1 CARD u podstawy spirali (w pozycji 1a), podczas wczesnych etapów montażu. Co ważne, montaż dysku może być kooperatywny w celu utrzymania właściwego odstępu między czterema Apaf-1 CARDs na apoptosomie, które tworzą podstawę spirali .

Dla aktywnego apoptosomu, jedna główna różnica jest widoczna na centralnej piaście, przy porównywaniu opublikowanych struktur (Fig. 3 i 4) . W skrócie, gęstość zidentyfikowana jako katalityczna domena pc-9 (p20/p10) znajduje się na centralnej piaście w ostatniej mapie 3D, a cecha ta okazała się być obecna w około 50% kompleksów . Ponadto, podobna gęstość została uwidoczniona na poprzedniej mapie holo-apoptosomu o niższej rozdzielczości, co pozwoliło na rozsądne, choć wstępne dokowanie podjednostek p20/p10; zatem zaobserwowana cecha jest powtarzalna. Jednak ta nowa gęstość została uwidoczniona tylko w niskiej rozdzielczości, co może odzwierciedlać pewną elastyczność w przyłączaniu podjednostek p20/p10 do centralnej piasty. Na mapie o rozdzielczości zbliżonej do atomowej, opracowanej przez grupę Yigong Shi, dodatkowa gęstość w kształcie sierpa została uwidoczniona w rozdzielczości ~ 7 Å na centralnej piaście, przylegającej do dysku CARD. Gęstość ta wyraźnie zawiera dodatkową pc-9 CARD w centrum, która oddziałuje z dwoma Apaf-1 CARD znajdującymi się po obu stronach, w sposób podobny do tego, jaki zaobserwowano w dwóch strukturach krystalicznych. Jednakże, ta heterotrimeryczna konfiguracja mogła być rozwiązana tylko w ~ 10% cząsteczek. Tak więc wydaje się, że warunki eksperymentalne podczas przygotowywania próbki i zamrażania siatki mogą wpływać na to, jak pc-9 oddziałuje z potencjalnymi miejscami wiązania na centralnej piaście, w tym na tworzenie spirali przypominającej dysk ze zmienną liczbą pc-9 CARDs i w użyciu miejsc wiązania, które są zlokalizowane w sąsiedztwie dysku acentrycznego. Kiedy dwie ostatnie asymetryczne struktury holo-apoptosomu są wyrównane w oparciu o ich dyski CARD, nowe szczyty gęstości zlokalizowane na centralnej piaście znajdują się w dość odmiennych miejscach (ryc. 4). Podczas gdy domena katalityczna pc-9 (p20/p10) może znajdować się w dwóch pozycjach (z najbardziej prawdopodobną pokazaną na Rys. 4c), trzy gęstości CARD są obrócone i mają inny profil patrząc z boku (nie pokazano), w porównaniu do tego dla domeny katalitycznej pc-9 (Rys. 4b, d). Wzór gęstości łączników Apaf-1 CARD-NBD umożliwia dokładne odwzorowanie wszystkich istotnych łączników CARD-NBD w holo-apoptosomie z trzema CARD i sześcioma uporządkowanymi CARD Apaf-1 (Rys. 4d). Krytycznie, długość linkera (~ 25-30 Å) i względne pozycje linkerów mogą wykluczać wiązanie modułu trzech CARD do pozycji 1 lub 2 na centralnym hubie. Tak więc wydaje się, że istnieje wiele miejsc na centralnej piaście, które mogą być wykorzystane w różny sposób do wiązania pc-9 CARD lub domeny katalitycznej.

Prokaspaza-9 została oszacowana jako wiążąca się z apoptosomem w stosunku 2-5 zymogenów na 7 cząsteczek Apaf-1 , więc wydaje się, że dokładna liczba cząsteczek pc-9 związanych z apoptosomem może się różnić w zależności od warunków podczas montażu, co może odzwierciedlać dynamiczną naturę tej proteolitycznej maszyny. Przez rozszerzenie, wydaje się jasne, że szósty lub siódmy pc-9 CARD nie jest związany przez ich odpowiedniki Apaf-1, w stosunku do miejsc już udokumentowanych na apoptosomie, co może odzwierciedlać albo ograniczenie steryczne, albo konieczność większego oligomeru do stabilizacji związanych pc-9 CARDs. Co ważne, niektóre domeny katalityczne pc-9 nie są widoczne na aktualnych mapach gęstości cryo-EM, ze względu na ich elastyczne przyłączenie poprzez długie łączniki CARD-p20, co utrudnia rozszyfrowanie i zrozumienie dokładnych mechanizmów aktywacji, jednocześnie podkreślając potrzebę dalszych badań pojedynczych cząsteczek.

Podstawową funkcją apoptosomu jest aktywacja pc-9, aby mógł on wykonać apoptozę. Chociaż badania strukturalne zapewniły wgląd w rekrutację i wymagania dotyczące aktywacji pc-9, seria badań biochemicznych wykazała, że zarówno dimeryzacja indukowana bliskością, jak i regulacja allosteryczna monomerycznego pc-9 są krytyczne dla regulacji funkcji apoptosomu i mogą również regulować czas trwania aktywności apoptosomu. Po pierwsze, rekrutacja pc-9 przez apoptosom zwiększa jego lokalne stężenie, aby umożliwić homodimeryzację, co zwiększa jego powinowactwo do kompleksu. Co ciekawe, nieulegająca rozszczepieniu pc-9 ma większą skłonność do homodimeryzacji i wykazuje zwiększoną aktywność proteazową (rozszczepianie kaspazy-3) w obrębie apoptosomu, niż rozszczepiona kaspaza-9. W konsekwencji rozszczepienie międzysubunitowego łącznika p20/p10 domeny katalitycznej zmniejsza powinowactwo pc-9 do apoptosomu, a po przetworzeniu kaspaza-9 jest uwalniana i nie wiąże się ponownie z apoptosomem. Co ważne, badania te wykazały, że homodimeryzacja pc-9 jest kluczowym wydarzeniem wymaganym do aktywacji i że apoptosom działa w celu ułatwienia tego wydarzenia. Jest to zgodne z badaniami biochemicznymi innych kaspaz CARD, takich jak kaspaza-2 i Dronc, gdzie początkowa aktywacja wymaga dimeryzacji, a nie rozszczepienia zymogenu. Stabilizacja wiązania pc-9 do apoptosomu wymaga nie tylko interakcji CARD-CARD, ale także interakcji małej podjednostki pc-9 (p10) poprzez jej motyw GCFNF404 w celu utworzenia homo- i heterodimerów. W tym momencie nie jest jasne, w jaki sposób tworzenie homodimerów pc-9 wpływa na stabilność dysku CARD-CARD, ponieważ dimery domeny katalitycznej wydają się być dość elastyczne, ponieważ mogą być uwalniane z holo-apoptosomu przez trombinolizę ukierunkowaną przez miejsce i nie są rozwiązywane na mapach cryo-EM udoskonalonych bez symetrii. Motyw GCFNF w pc-9 oddziałuje również z NOD Apaf-1, tworząc heterodimery pc-9/Apaf-1, które wydajnie rozszczepiają kaspazę-3. Dane te sugerują, że domena katalityczna pc-9, która oddziałuje bezpośrednio z apoptosomem, może być aktywna. To przypuszczalne miejsce aktywne dla rozszczepiania kaspazy-3 może odpowiadać nowemu zagęszczeniu zaobserwowanemu na centralnym hubie, które zostało zinterpretowane jako cząsteczka p20/p10 i potrzebne są dalsze badania w tym zakresie. W sumie, wyniki te wskazują, że pc-9 może mieć dwie różne aktywne konformacje w apoptosomie, z jednym lub prawdopodobnie dwoma homodimerami związanymi z dyskiem CARD i heterodimerem pc-9/Apaf-1 związanym z centralną piastą. Gdy uwzględni się holo-apoptosomy z trzema modułami CARD związanymi z centralną piastą, to możliwe jest co najmniej sześć permutacji rozmieszczenia od trzech do pięciu domen katalitycznych pc-9 (Rys. 5). Tak więc, liczba możliwych aktywnych domen katalitycznych pc-9 (jako homodimerów i heterodimerów) będzie się zmieniać w zależności od liczby cząsteczek pc-9 rekrutowanych do apoptosomu, ponieważ wypełniają one możliwe miejsca wiązania pośredniczone przez Apaf-1 CARDs.

Wreszcie, całkowite rozszczepienie pc-9 przez kaspazę-3 usuwa łącznik międzypodjednostkowy i przywraca pełną aktywność kaspazy-9, wskazując, że kaspaza-3 ma również proteolityczne sprzężenie zwrotne z pc-9, które może wzmacniać sygnał apoptotyczny . Podobny mechanizm został zaproponowany dla kaspazy-2. Te biochemiczne badania przedstawiły ponadto molekularny model czasowy, w którym szybkość dysocjacji kaspazy-9 z apoptosomu jest określona przez początkowe rozszczepienie łącznika p20-p10, co zmniejsza jej powinowactwo do wiązania z apoptosomem. Jednak całkowita dysocjacja rozszczepionej kaspazy-9 od holo-apoptosomu wymagałaby uwolnienia jej CARD z modułu dysku lub trzech CARD. Tak więc może istnieć hierarchia uwalniania aktywnych cząsteczek kaspazy-9, która zależy od lokalnego środowiska ich CARDs. Konstrukcja dysku CARD, w którym wszystkie CARD pc-9 znajdują się na górnej powierzchni, może również ułatwiać uwalnianie kaspazy-9.

.