Odkrycie, aktywność i charakterystyka litycznej polisacharydowej oksygenazy AA10 z symbionta dżdżownicy Teredinibacter turnerae

Ekspresja i charakterystyka enzymatyczna AA10 LPMO z T. turnerae

Gamma-proteobacterium T. turnerae jest jedynym endosymbiontem występującym w skrzelach dżdżownic, którego udało się wyizolować, wyhodować i zmapować jego genom. Poprzez automatyczną anotację i ręczne przeszukiwanie BLAST przewidywanego proteomu T. turnerae, zidentyfikowaliśmy jeden gen (NCBI Reference Sequence: WP_019602454.1) kodujący AA10 LPMO (zwany dalej TtAA10A). Przewidywana sekwencja białka zawiera N-końcowy peptyd sygnałowy, domenę LPMO oraz bogaty w serynę region łącznika, po którym następuje domena modułu wiążącego węglowodany (CBM) 10 (Rys. 1a). Znaleziono AA10 z dołączonymi domenami CBM2, CBM3, CBM5, CBM10, CBM12, CBM18 i CBM73 (Bernard Henrissat, komunikacja osobista) i wiadomo, że są one aktywne na celulozie lub chitynie. Domeny CBM10 są uważane za wiążące celulozę, a więc mogą zapewniać rozpoznawanie celulozy, które raczej nie jest związane z wydarzeniem katalitycznym. Chociaż różni się od CBM powszechnie spotykanych w białkach AA10, jego obecność w strukturze domeny genu TtAA10A daje wskazówkę, że białko to może być przede wszystkim aktywne na polisacharydach opartych na glukozie.

Po wielokrotnych próbach ekspresji genu z różnymi znacznikami powinowactwa, rozpuszczalności i różnymi sygnałami sekrecyjnymi, ostatecznie uzyskano wystarczającą ilość białka do analiz poprzez produkcję C-końcowo strep-tagowanej domeny katalitycznej LPMO (od His25 do Gly228) w E. coli (Rys. 1b). Oczyszczone znakowane białko obciążono nadmiarem miedzi, odsolono poprzez chromatografię wykluczania rozmiaru, przeanalizowano pod kątem czystości poprzez SDS-PAGE (Rys. 1c) i identyfikację białek na podstawie spektrometrii mas (nie pokazano), a następnie wykorzystano do kolejnych eksperymentów.

Rekombinowane TtAA10A (tylko domeny katalityczne, 25-228,) wykazuje cechy prawidłowo złożonego AA10. Analiza przesunięcia termicznego (Thermofluor) oczyszczonej, obciążonej Cu TtAA10A wskazuje na temperaturę topnienia (Tm) 50,4 °C. Usunięcie miedzi za pomocą 10 mM EDTA obniża Tm do 42,5 °C, co sugeruje efekt stabilizacji białka przez metalowy kofaktor, jak opisano w poprzedniej literaturze dla innych LPMO (na przykład, Fig. 1d). Zauważyliśmy również zmienność w preparatach białkowych, z niektórymi preparatami zawierającymi pojedynczy (aktywny środek) Cu, podczas gdy inne zawierały dwa atomy Cu, opisane poniżej.

Activity assays, on both single and double Cu site samples, were carried out on a range of commercial polysaccharide substrates (Avicel, β-chitin from squid pen, α-chitin from shrimp shell, celuloza, skrobia kukurydziana, pachyman, ksylan z drewna bukowego, glukomannan, ksyloglukan, lichenan, galaktan, galaktomannan i mannan) w obecności redukującego kofaktora, kwasu galusowego. Próbki analizowano po 24 h metodą MALDI-TOF MS, a masy pików produktów reakcji porównywano z wcześniej publikowanymi danymi, ujawniając mieszany wzór utleniania C1-C4, wyłącznie na celulozie, zależny od obecności donora elektronów (rys. 2a, b). Produkty nie zostały wykryte w żadnej z kontroli negatywnych (plik dodatkowy 1: Rysunek S1). Analiza MALDI-TOF MS surowego ekstraktu z testów aktywności przeprowadzonych z TtAA10A obciążonym Cu w obecności 10 mM EDTA nie wykryła uwalniania produktów (dane nie pokazane), wskazując, że zgodnie z oczekiwaniami, miedź jest niezbędna do aktywności.

Eksperymenty synergistyczne przeprowadzono poprzez koinkubację TtAA10A i komercyjnych hydrolaz glikozydowych (GH6 i GH9) w obecności Avicelu i kwasu galusowego, a powstałe mono- i oligosacharydy oznaczono ilościowo przy użyciu wysokosprawnej chromatografii anionowymiennej (HPAEC). Podczas gdy reakcje z użyciem samego LPMO lub GH uwalniały znikome ilości wolnych cukrów, reakcje koinkubacji wykazywały silny efekt synergistyczny, dodatkowo wzmocniony obecnością donora elektronów (Rys. 2c, d, plik dodatkowy 2: Rysunek S2). Warto zauważyć, że oba komercyjne GH (GH6 i GH9) testowane podczas tych eksperymentów należą do rodzin, które zostały zidentyfikowane jako jedne z najobficiej występujących w proteomie trawiennym dżdżownic, co wzmacnia biologiczne znaczenie powyższych testów aktywności w kontekście trawienia drewna w środowisku dżdżownic.

Elektronowa spektroskopia rezonansu paramagnetycznego

Nasze pierwsze dowody na to, że niektóre preparaty białkowe zawierały dwa miejsca Cu pochodziły z analiz EPR. Widmo X-band CW-EPR nasyconego Cu roztworu zamrożonego (165 K) TtAA10A (Rys. 3) wykazywało dwa zestawy pików nadsubtelnych w równoległym regionie widma, wskazując na obecność dwóch różnych geometrii koordynacyjnych miedzi, wynikających albo z różnych środowisk koordynacyjnych w obrębie jednego miejsca (np. różnice w stanach protonowania ligandów) albo z odrębnego drugiego miejsca wiążącego miedź. Rzeczywiście, dokładna symulacja równoległego regionu widma może być uzyskana z dwoma różnymi gatunkami, z których każdy daje inny zestaw parametrów hamiltonianu spinowego, gz = 2.267 i |Az| = 425 MHz (gatunek 1) oraz gz = 2.314 i |Az| = 465 MHz (gatunek 2), Tabela 1, z proporcją pomiędzy gatunkami 1 i 2 około 3:2. Wartość gz gatunku 2 jest wysoka w porównaniu z tym, czego można by oczekiwać dla typowej koordynacji miedzi w miejscu aktywnym AA10 LPMO (spektroskopia LPMO ostatnio zrecenzowana w Ref. ), na podstawie czego przypisujemy gatunek 1 do miedzi związanej z kanonicznym miejscem aktywnym aparatu histydynowego. Jego wartości Hamiltonianu spinowego są typowe dla osiowej geometrii koordynacyjnej Cu, która zawiera mieszaninę N i O-donujących ligandów. (Zauważmy, że gatunek 2 nie może pochodzić od wolnego gatunku miedzi w roztworze, ponieważ wszystkie małe cząsteczki są usuwane podczas przygotowywania białka; stąd wszystkie sygnały miedzi w EPR pochodzą od miedzi związanej z białkiem.)

Aby określić, czy dwa sygnały pochodzą z jednego miejsca wiążącego miedź o różnych geometriach koordynacyjnych, czy z dwóch różnych miejsc miedziowych, przeprowadzono eksperyment miareczkowania X-band CW-EPR. Białko było wstępnie traktowane EDTA (10x stężenie białka) w celu usunięcia miedzi, a następnie wymieniane w buforze w celu usunięcia EDTA. Ta wolna od miedzi próbka białka została przetestowana i, jak oczekiwano, nie wykazała sygnału opartego na miedzi. Dodanie 0,2 równoważnika miedzi (w porównaniu do stężenia białka) wykazało pojedynczy sygnał w regionie równoległym, przypisany jonowi miedzi (II) w miejscu aktywnym branki histydynowej (gatunek 1). Dalsze dodawanie miedzi zwiększało ten sygnał miedziowy w obrębie aparatu histydynowego, z jednoczesnym wzrostem sygnału dla gatunku 2, widocznym już po 0,4 równoważnika miedzi (plik dodatkowy 3: Rysunek S3). Te eksperymenty miareczkowania zostały przeprowadzone przy stałym pH i pokazują, że dwa gatunki w widmie EPR nasyconego miedzią TtAA10A reprezentują dwa różne miejsca wiążące Cu z nieco różnymi powinowactwami do miedzi, gdzie gatunek 1 jest miejscem o wyższym powinowactwie. Ponadto, próbka TtAA10A z 0,4 ekwiwalentu Cu została pozostawiona w 4 °C na 48 h, a jej widmo EPR zostało ponownie zbadane. Próbka ta nie wykazała żadnej różnicy w stosunku gatunków miedzi, co dowodzi, że różne miejsca wiązania nie powstały z powodu dużych różnic w kinetyce wiązania miedzi.

Nauważalnie, w kilku wytworzonych przez nas preparatach, wyizolowano próbkę TtAA10A, która wykazywała tylko pojedynczy sygnał miedzi w widmie EPR. Przyczyny tej różnicy w stechiometrii miedzi wyizolowanego białka nie są jasne, ponieważ próbki te zostały rzekomo przygotowane w identycznych warunkach jak te, które dały TtAA10A z dwoma różnymi sygnałami Cu w widmie X-band EPR (gatunek 1 i gatunek 2). Nie byliśmy w stanie wykryć żadnych różnic w aktywności dla tych pojedynczo zajętych miedzią preparatów w porównaniu z poprzednimi próbkami, ale mogliśmy wykorzystać te próbki do zmierzenia zarówno widm X-band jak i Q-band CW-EPR dla aktywnego centrum Cu TtAA10A (Rys. 4) z zajętym tylko usztywnieniem histydynowym, jak sądziliśmy w odniesieniu do poprzednich widm. Próbka ta pozwoliła nam zatem na jednoczesne dopasowanie widm w paśmie X i Q w celu uzyskania dokładniejszych parametrów hamiltonianu spinowego dla jonu miedzi w miejscu aktywnym w warstwie histydynowej (gatunek 1). Wartości te są podane w Tabeli 2. Dodatek PASC do TtAA10A nie spowodował żadnych zmian w widmach EPR (dane nie pokazane).

Struktura 3D TtAA10A

Aby uzyskać dalszy wgląd w molekularne podstawy biochemicznych właściwości TtAA10A i zbadać tę, potencjalnie niezwykłą, podwójną strukturę Cu, określiliśmy strukturę krystaliczną rekombinowanego białka do rozdzielczości 1,4 Å (Dodatkowy plik 4: Tabela S1). Ogólna struktura ujawniła rdzeniowy fałd immunoglobulinopodobny ozdobiony pętlami i wiązką helikalną, co jest typowe dla enzymów z tej rodziny (Rys. 5). Rzeczywiście, porównania strukturalne przy użyciu serwera DALI wykazują najbliższe strukturalne dopasowania do Cellvibrio japonicus AA10A (PDB ID 5fjq) i Serratia marcescens CBP21 (PDB ID 2bem) z RMSD wynoszącymi 2,4 Å i 2,3 Å odpowiednio na 180 i 170 pozycjach Cα, co stanowi tylko 30% identyczności na poziomie sekwencji. Biorąc pod uwagę wysoką aktywność TtAA10A na celulozie, może być nieco zaskakujące, że dwa najbliższe dopasowania strukturalne do tego enzymu to chitynowo aktywne AA10. Trzecim najbliższym dopasowaniem strukturalnym był jednak AA10 ze Streptomyces coelicolor (ScAA10, PDB ID 4oy7 ), który jest AA10 specyficznym dla celulozy, co daje RMSD 2,5 Å na 160 atomach Cα. TtAA10A i ScAA10 mają tylko 26% identyczności sekwencji, mimo że są aktywne na tym samym substracie, co jeszcze bardziej podkreśla trudność w odniesieniu do specyficzności substratowej LPMO na podstawie samej sekwencji i ogólnej struktury (szerzej omówionej w kontekście AA9 w Ref. ).

Jak w przypadku wszystkich dotychczas zbadanych LPMO (zdefiniowanych przez ich aktywność), miejsce aktywne TtAA10A jest utworzone przez motyw „bransolety histydynowej”, który znajduje się w centrum prawie płaskiej powierzchni (Rys. 5a, b). W tej pozycji zamodelowano pojedynczy jon miedzi koordynowany w typowej geometrii w kształcie litery T przez aminowy terminus i łańcuch boczny His 1 oraz łańcuch boczny imidazolu His 107. W pozycjach osiowych wokół jonu miedzi w miejscu aktywnym, TtAA10A znajdują się Phe 195 i Gly 105. Pozycje te są często zajmowane przez łańcuch boczny fenyloalaniny/tyrozyny i alaniny, odpowiednio, w innych AA10. Ta ostatnia jest zaangażowana w tworzenie środowiska sterycznego, które napędza powstawanie zniekształconej geometrii koordynacyjnej miejsca aktywnego obserwowanej w chitynowych AA10s w ich stanie utlenienia Cu(II). W tym przypadku, zastąpienie Ala przez Gly pozwala miedzi w miejscu aktywnym przyjąć nieco bardziej osiową geometrię koordynacji, bliższą tej typowej dla AA9s i celulozowo aktywnych AA10s i zgodną z parametrami hamiltonianu spinowego gatunku 1 w naszej analizie EPR opisanej wcześniej, Rys. 4. Struktury krystaliczne LPMO są często narażone na fotoredukcję w wyniku uszkodzeń radiacyjnych, tak że geometria spoczynkowa miejsca aktywnego nie może być bezpośrednio obserwowana w strukturach krystalicznych (przykłady obejmują ). Analiza sfery otaczającej jon miedzi w TtAA10A ujawnia jedynie słabą gęstość dla cząsteczki wody w odległości 2,6 Å od miedzi i silniejszą gęstość dla drugiej cząsteczki wody w odległości 3,2 Å łączącej się wodorowo z Glu 53. Te cząsteczki wody są zbyt odległe od miedzi, aby można je było uznać za bezpośrednio koordynujące. Wydaje się zatem, że miedź w tym enzymie również uległa fotoredukcji do stanu utlenienia Cu(I).

Nasza struktura ujawnia położenie drugiego miejsca wiążącego miedź, które zostało zaobserwowane w widmach EPR. Miejsce to znajduje się 14,4 Å (Cu…Cu) od jonu miedzi w aparacie histydynowym w dużej ujemnie naładowanej łacie na powierzchni białka (Rys. 5a, b; Plik dodatkowy 5: Rysunek S4). Ten drugi jon miedzi jest bezpośrednio koordynowany przez His 165, Glu 5, Asp 101, cząsteczkę wody i His 207*, który jest dostarczany przez Strep-tag z sąsiedniej cząsteczki w krysztale. W związku z obserwacją tego oddziaływania, sprawdziliśmy stan oligomeryczny białka w roztworze za pomocą SEC-MALLS (plik dodatkowy 6: Rysunek S5). Potwierdziło to, że białko jest monomeryczne, co sugeruje, że interakcja miedź-His207* jest artefaktem krystalicznym (choć może wskazywać na potencjalne oddziaływanie białko-białko). Niemniej jednak, w połączeniu z danymi EPR, struktura sugeruje, że to drugie miejsce jest zajęte w roztworze, z His 207* prawdopodobnie zastąpionym przez cząsteczkę wody. Wielokrotne dopasowanie sekwencji 500 najlepszych ortologów TtAA10A zidentyfikowanych poprzez wyszukiwanie BlastP pokazuje, że podczas gdy kwaśna reszta w pozycji 5 nie jest rzadkością wśród AA10, reszty 101 i 165 są w dużej mierze konserwowane tylko w obrębie LPMO z bakterii blisko spokrewnionych z Teredinibacter.

Była znacząca debata na temat możliwych pozycji, w których donory elektronów, zarówno małocząsteczkowe, jak i białkowe, mogą wiązać się z LPMO, aby umożliwić katalizę, gdy enzym jest związany z powierzchnią stałego substratu (patrz, na przykład ). Rzeczywiście, badanie struktury TtAA10A pod kątem potencjalnych ścieżek przenoszenia ładunku przy użyciu programu EHPath pokazuje, że wyraźna i szybka ścieżka przeskakiwania dziur ze średnim czasem przebywania dziur wynoszącym tylko 20 ms istnieje pomiędzy histydyną 1 i tyrozyną 3 (separacja 10 Å). Tyrozyna 3 przylega (5,3 Å) do drugiego miejsca Cu, co zapewnia wydajną ścieżkę transferu ładunku pomiędzy dwoma miejscami miedzi. Dlatego, biorąc pod uwagę potencjalną ścieżkę transferu ładunku między dwoma miejscami miedzi, zbadaliśmy, czy drugie miejsce metaliczne (w naszym przypadku zajęte przez miedź, chociaż nie mogliśmy wyprzeć Cu solami Fe, Ni, Zn i Mn) stanowi miejsce wiązania dla białkowego partnera redoks (wiązanie innego białka do tego miejsca jest sugerowane przez asocjację Strep-tag z sąsiednią cząsteczką w sieci krystalicznej), i próbowaliśmy ściągnąć białka z przewidywanego sekretomu T. turnerae, które mogą trwale oddziaływać z TtAA10A przy użyciu kolumny powinowactwa (StrepTrap HP) immobilizowanej TtAA10A. Eksperymenty te (dane nie pokazane) nie doprowadziły do wyizolowania żadnych kandydujących białkowych aktywatorów dla TtAA10A, ale nie można wykluczyć, że enzym aktywujący mógłby wiązać się przejściowo w tym regionie, aby umożliwić przeniesienie elektronu do LPMO i w ten sposób zainicjować katalizę. Należy jednak zauważyć, że podczas rafinacji struktury zidentyfikowaliśmy również miejsce wiążące sód na powierzchni białka (plik dodatkowy 7: Rysunek S6). Czy te dodatkowe miejsca wiążące są wynikiem zwiększonego ładunku, jaki białko to może mieć, aby być stabilne w środowisku soli, w którym żyje T. turnerae, pozostaje kwestią otwartą. Niemniej jednak, te cechy powierzchni TtAA10A mogą być interesujące dla inżynierów enzymów, jeśli LPMO mają być stabilizowane lub przystosowane do specyficznych warunków, które mają być zastosowane w bioreaktorach przemysłowych.

.