PEG Precipitation: A Powerful Tool for Monoclonal Antibody Purification

Wykazano, że metoda wychwytywania peletu ma znaczący wpływ na czystość ponownie rozpuszczonego produktu. Etap wytrącania jest łatwo skalowalny i pasuje do w pełni jednorazowego procesu downstream.

Percivia LLC

Trwają wysiłki mające na celu zidentyfikowanie alternatyw dla chromatografii złożowej, aby zredukować czas i koszty przetwarzania strumieni produktów o wysokim mianie. Chociaż wiele wysiłków skupia się na adsorberach membranowych, które bezpośrednio zastępują kolumny o tej samej lub podobnej chemii, niektóre starsze technologie zaczynają zdobywać popularność w produkcji białek rekombinowanych. Jedną z atrakcyjnych alternatyw dla chromatografii jest wytrącanie, które jest stosowane w przemyśle białek osocza od wielu lat.1 Prosta metoda wytrącania polega na miareczkowaniu płynu procesowego do punktu izoelektrycznego białka, które ma być wytrącone.2 Sole liotropowe, takie jak siarczan amonu, również mają długą historię stosowania w procesach strącania.3 Krótkołańcuchowe kwasy tłuszczowe, takie jak kwas kaprylowy, są dobrze znane ze swojej zdolności do wytrącania DNA i białek komórki gospodarza (HCP).4 Polionowe gatunki są również użytecznymi środkami strącającymi do wychwytywania interesującego produktu lub usuwania zanieczyszczonych białek.5,6

Glikol polietylenowy (PEG) był stosowany do wytrącania produktów i zanieczyszczeń.7,8 Można go również łączyć z wytrącaniem izoelektrycznym w celu zwiększenia wydajności rozdzielania.9,10 Po wytrąceniu można zastosować odwirowanie lub filtrację w celu przeprowadzenia rozdzielenia ciało stałe-ciecz.11 Chociaż odwirowanie jest dobrze znaną metodą osiągania tego rozdzielenia, mycie osadu produktu w celu usunięcia zanieczyszczeń może być problematyczne i nie nadaje się do procesu jednorazowego użytku. Filtracja – normalny lub styczny przepływ – wymaga więcej pracy, ale mycie granulatu jest prostsze i można je łatwo dostosować do procesu jednorazowego użytku.

W obecnej pracy, opracowano etap wytrącania produktu przy użyciu PEG do odzyskiwania przeciwciała monoklonalnego (MAb) z oczyszczonych pożywek hodowli komórek PER.C6. Odpowiednie warunki wytrącania zostały zidentyfikowane poprzez zastosowanie pełnoczynnikowych projektów eksperymentalnych. Oceniono dwa etapy filtracji dla wychwytywania i przemywania wytrąconego produktu, a nadrzędna metoda była skalowana 10-krotnie. Proces całkowitego wytrącania pozwolił na uzyskanie wydajności około 90% i redukcję HCP o 1 LRV, bez znaczącego wzrostu poziomu agregatów ponownie rozpuszczonego MAb. Wreszcie, zbadano wpływ etapu wytrącania na następujący po nim etap wychwytywania metodą wymiany kationowej (CEX).

Materiały i metody Odczynniki

Sole klasy USP, Tween 20, kwas solny, kwas octowy i wodorotlenek sodu zostały zakupione od firmy JT Baker (Phillipsburg, NJ). PEG był klasy odczynnikowej i został zakupiony od JT Baker lub EMD Chemicals (Gibbstown, NJ). Wszystkie bufory zostały przygotowane przy użyciu wody klasy MilliQ (Millipore, Billerica, MA) i zostały przefiltrowane przez filtrację 0,22-µm przed użyciem.

Feedstock

Człowiek MAb (IgG1, pI = 8,3, 150 kDa) został wyprodukowany w Percivia, LLC przy użyciu linii komórkowej PER.C6. Komórki PER.C6 to ludzkie embrionalne komórki siatkówki immortalizowane genem adenowirusa E1, jak opisano w patencie USA 5,994,128.12 Komórki hodowano w standardowym procesie wsadowym lub w procesie XD, w obu przypadkach stosując chemicznie zdefiniowane pożywki.13,14 Podłoża wsadowe oczyszczano przez sedymentację i filtrację wgłębną, a podłoża XD oczyszczano metodą wzmożonego osadzania komórek (ECS), po której następowała filtracja wgłębna.15 Podczas ECS stosowano żywicę krzemionkową-PEI w celu wzmożonego osadzania komórek, a także redukcji DNA i HCP.

Optymalizacja warunków wytrącania

Warunki stosowane do wytrącania MAb-PEG masa cząsteczkowa, stężenie PEG i pH zostały zoptymalizowane za pomocą pełnoczynnikowych projektów eksperymentalnych przy użyciu oprogramowania Minitab (State College, PA). pH sklarowanego podłoża XD zostało dostosowane do pożądanego poziomu za pomocą 2-M Tris w 15-ml probówce stożkowej. PEG dodawano jako 40% (w/w) roztwór podstawowy do pożądanego stężenia końcowego. Następnie probówkę odwirowano przy 1,000g i zdekantowano supernatant. Na koniec, osad ponownie rozpuszczono w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

Pellet Capture by Depth Filtration or Microfiltration

Filtrację wgłębną przeprowadzono przy użyciu różnych klas mediów filtracyjnych. Millistak+HC D0HC, C0HC, i X0HC zostały zakupione od Millipore Corp. (Billerica, MA), a ZetaPlus 60SP02A zakupiono od Cuno (Meriden, CT). Wytrącanie przeprowadzono przy użyciu 40% (w/w) roztworu podstawowego PEG-3350, a wytrąconą pożywkę ładowano przy strumieniu wejściowym 50 L/m2 /h do momentu, aż cały materiał został załadowany lub ciśnienie transmembranowe (TMP) wynosiło 15 psid. Następnie filtry przemywano 20-30 l/m2 20 mM Tris pH 8,5 + 14,4% (w/w) PEG-3350. Po przemyciu, przez filtry przepuszczano 80 L/m2 buforu rezolubilizacyjnego z prędkością 100 L/m2 /h, a permeat recyrkulowano przez urządzenie z prędkością 600 L/m2 /h do momentu, gdy stężenie A280 w basenie permeatu było stabilne, wskazując na całkowite rozpuszczenie MAb. Na koniec, wszelki zatrzymany produkt był odzyskiwany poprzez płukanie buforem o objętości 20 L/m2 i przedmuchiwanie powietrzem modułu filtracyjnego. W niektórych testach media filtracyjne były następnie przemywane 85-mM octanem o pH 5,3, a następnie 1-M NaCl. Dane dotyczące ciśnienia i przepływu były zbierane przy użyciu niestandardowego systemu zaprojektowanego przez ARC Technology Services (Nashua, NH).

Mikrofiltrację przeprowadzono przy użyciu membrany z włókna drążonego 0,22-µm firmy GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). PEG-3350 był dodawany jako 40% (w/w) roztwór podstawowy dla eksperymentu w małej skali i w formie proszku dla pracy w skali. Strumień zasilający wynosił 710 L/m2 /h, a retentat i permeat były nieograniczone. Osad najpierw zatężano 10-14-krotnie, a następnie przemywano trzema objętościami przesączu 20 mM Tris pH 8,5 plus 14,4% (w/w) PEG-3350. Na koniec osad ponownie rozpuszczano w 85 mM octanie sodu pH 5,3 lub 20 mM Tris plus 50 mM NaCl pH 7,5. Dane dotyczące ciśnienia, przepływu i przewodności zebrano przy użyciu systemu stacjonarnego Slice 200 (Sartorius, Gottingen, Niemcy) do badań na małą skalę i systemu SciPro (SciLog, Middleton, WI) do eksperymentu zwiększania skali.

Chromatografia kationowymienna

Toyopearl GigaCap S-650 został pozyskany od Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA) w formacie Toyoscreen 5-mL. Żywica ta została wcześniej wykazana jako wysokowydajny etap wychwytu MAbs.16 Kolumnę zrównano 74-mM octanem sodu o pH 5,3 i załadowano do 90-95 mg-MAb/mL żywicy, używając albo sklarowanego podłoża, albo sklarowanego i poddanego działaniu PEG materiału, z których każdy dostosowano do tego samego pH i przewodności, co bufor równoważący. Następnie kolumnę przemywano buforem równoważącym, a przeciwciało eluowano za pomocą 50 mM octanu sodu pH 5,3 plus 90 mM NaCl.

Techniki analityczne

Stężenie MAb w próbkach zawierających media określano za pomocą analitycznej HPLC Protein A (Applied Biosystems, Foster City, CA). Poziomy agregatów mierzono metodą chromatografii z wykluczeniem rozmiaru (SEC) przy użyciu kolumny TSKgel G3000SWXL firmy Tosoh Bioscience (Montgomeryville, PA), z wykrywaniem pików za pomocą absorbancji UV przy 280 nm. Poziomy HCP zostały określone ilościowo za pomocą testu ELISA specyficznego dla PER.C6 firmy Cygnus Technologies (Southport, NC). SDS-PAGE wykonano przy użyciu żeli NuPAGE 4-12% Bis-Tris, a barwienie wykonano przy użyciu SimplyBlue SafeStain, oba od Invitrogen (Carlsbad, CA).

Wyniki i dyskusja Warunki wytrącania

Dla obu mas cząsteczkowych PEG, 3,350 i 6,000 Da, stężenie PEG było dominującym czynnikiem w odzyskiwaniu i czystości ponownie rozpuszczonego MAb. Wytrącanie za pomocą PEG-3350 skutkowało najwyższym odzyskiem (rysunek 1). Jednakże, wyższy odzysk odbywał się kosztem wyższego obciążenia HCP w ponownie rozpuszczonym MAb. W przypadku zagregowanego MAb poziomy te nie różniły się znacząco od materiału wyjściowego, ale należy zauważyć, że konkretny MAb użyty w tej pracy nie jest skłonny do tworzenia agregatów. Poprawa redukcji HCP przy użyciu PEG-6000 została zniwelowana przez zmniejszenie wydajności produktu. Ostatecznie wybrano warunki 14% (w/v) PEG-3350 (co odpowiada 14,4% w/w) i pH 8,5.

Figura 1

Pellet Capture by Depth Filtration

W pierwszym eksperymencie, ECS-klarowane podłoże XD zostało wytrącone, a pellet został przechwycony przez filtrację wgłębną z podłożem X0HC. Nie zaobserwowano istotnego wzrostu ciśnienia transmembranowego (TMP) podczas ładowania 361 g-MAb/m2 (dane nie pokazane). Po przemyciu, rezolubilizację unieruchomionego osadu przeprowadzono za pomocą 85 mM octanu o pH 5,3. Nawet po recyrkulacji przez 2 h, przeciwciało nie rozpuściło się całkowicie, więc do buforu resolubilizacyjnego dodano 0,1% v/v Tween 20. Po dodatkowych 30 minutach resolubilizacji, MAb zostało całkowicie rozpuszczone.

Tabela 1. Wydajność i usuwanie zanieczyszczeń dla operacji wytrącania PEG przy użyciu filtracji wgłębnej z X0HC w celu odzyskania produktu

Dane bilansu masowego podsumowano w Tabeli 1. Redukcja HCP była niższa niż w poprzednim eksperymencie (rys. 1), gdzie w puli końcowej znajdowało się tylko 5000 ppm HCP w porównaniu do 8300 ppm w tym eksperymencie. Wiadomo jednak, że niektóre filtry wgłębne mają hydrofobowe i anionowymienne (AEX) właściwości adsorpcyjne.17 Wytrącone media zostały załadowane przy stosunkowo wysokim pH (8,5) i niskim przewodnictwie (<10 mS/cm), co mogło indukować wiązanie kwaśnych białek na matrycy AEX. Ponadto wykazano, że w obecności PEG zdolność wiązania białek na matrycach jonowymiennych wzrasta.18,19 Dlatego prawdopodobne jest, że niektóre z HCP, które pozostały w roztworze po wytrąceniu, związały się z podłożem filtracyjnym wgłębnym i zostały wymyte do produktu podczas resolubilizacji. Hipotezę tę wspiera również różnica w zawartości HCP w supernatancie wytrąceniowym i przepływie przez filtr wgłębny (9,900 versus 240 mg), co wskazuje na usunięcie HCP z roztworu przez filtr wgłębny. Po immobilizacji przeciwciała na filtrze wgłębnym, zostało ono ponownie rozpuszczone przy znacznie niższym pH (5,3), co spowodowało elucję związanego HCP i zmniejszyło czystość produktu końcowego. Zjawisko to można złagodzić, stosując mniej adsorpcyjne wkłady filtracyjne, takie jak Millistak+HC D0HC/C0HC i filtry ZetaPlus SP, takie jak 60SP02A, lub rozpuszczając produkt w buforze o niskiej zawartości soli i wyższym pH, takim jak 20-mM Tris o pH 7,5.

Rysunek 2

Strategie te zostały przetestowane przez załadowanie wytrąconego podłoża wsadowego na filtry D0HC, C0HC, X0HC i 60SP02A. Wszystkie filtry przemyto identycznie buforem PEG/Tris, ale resolubilizację przeprowadzono przy użyciu 20 mM Tris pH 7,5 plus Tween 20 dla filtrów Millipore i 85 mM octanu pH 5,3 plus Tween 20 dla filtrów Cuno. Filtry Millipore zostały również pozbawione buforu o niskim pH (85 mM octan pH 5,3) i wysokiej zawartości soli (1 M NaCl) po odzyskaniu produktu w celu określenia, czy jakiekolwiek związane HCP mogły zostać wymyte. Rysunek 2 pokazuje, że wystąpiło znaczne zanieczyszczenie wszystkich badanych filtrów. Ponieważ podłoże wsadowe nie zostało oczyszczone metodą ECS, która, jak wykazano, znacznie zmniejsza poziom DNA w zbiorach XD, może być w nim obecne więcej DNA, które wytrąca się w wysokich stężeniach PEG.20 Wyższa zawartość DNA w osadzie mogła zmniejszyć wydajność filtrów, ale nie zostało to zbadane. Tabela 2 pokazuje, że w każdym z eksperymentów uzyskano lepszą redukcję HCP (84-88% w porównaniu z 46%) i mimo że początkowe obciążenie HCP było wyższe (49 000 ppm w porównaniu z 13 000 ppm), redissolved MAb pools generalnie miały niższą zawartość HCP (6 000-7 800 ppm w porównaniu z 8 300 ppm). Wydaje się, że zastosowanie filtrów niskoadsorpcyjnych i ponowne rozpuszczenie w buforze o wyższym pH rozwiązuje problem HCP wymywanych z filtrów wgłębnych. SDS-PAGE frakcji paskowych ujawnił, że zarówno HCP jak i produkt były związane z filtrami – w tym z mniej adsorbującymi filtrami D0HC i C0HC – i potwierdził, że nośniki X0HC były bardziej adsorbujące niż nośniki D0HC i C0HC (rysunek 3).

Tabela 2. Wydajność i usuwanie zanieczyszczeń dla operacji strącania PEG z zastosowaniem filtracji wgłębnej z różnymi mediami filtracyjnymi w celu odzyskania produktu

Pellet Capture by Microfiltration

Although the HCP burden of the redissolved MAb was reduced by using a buffer with a higher pH and less adsorptive depth filter media, the capacities of the depth filters were low for fed-batch media (<400 g-MAb/m2 ). Mikrofiltracja (filtracja przepływu stycznego, MF TFF) została przetestowana w celu poprawy wydajności z dodatkową korzyścią polegającą na możliwości użycia dowolnego buforu do resolubilizacji ze względu na niską charakterystykę wiązania pustych włókien. Wydajność hydrauliczna MF TFF zagęszczania i płukania osadu wstępnego podawanego partiami jest przedstawiona na rysunku 4. Strumień permeatu wynosił około 100 L/m2 /h, a TMP mieścił się w zakresie od 1,0 do 2,5 psid podczas całej operacji. Obciążenie masowe wynoszące 475 g-MAb/m2 było lepsze niż osiągnięte w którymkolwiek z procesów filtracji wgłębnej. Zarówno odzysk produktu, jak i redukcja HCP wynosiły około 90%, czyli nieco lepiej niż w przypadku filtracji wgłębnej (Tabela 3).

Rysunek 3

Rozdzielanie było znacznie prostsze i szybsze niż w przypadku filtracji wgłębnej; zamiast recyrkulacji buforu przez urządzenie, bufor był pompowany przez wnętrze lumenów do naczynia retentatu z zamkniętym permeatem i pozwalano mu mieszać się przez około 60 minut. Było to wystarczające do ponownego rozpuszczenia przeciwciała i żadne substancje pomocnicze nie były potrzebne. Ze względu na trudności w rozdzielaniu przy filtracji wgłębnej, produkt był ponownie rozpuszczany w stężeniu równym lub zbliżonym do stężenia w podłożu zasilającym. Końcowa pula z procesu MF TFF była prawie dwukrotnie bardziej skoncentrowana niż materiał wyjściowy.

Figura 4

Ponieważ retentat i permeat były otwarte na ciśnienie atmosferyczne, wymagane było minimalne oprzyrządowanie: pompa przepływu krzyżowego, jeden czujnik ciśnienia i pompa transferowa do diafiltracji. Połączenie dużej pojemności, wysokiego odzysku i oczyszczania z HCP oraz prostoty operacyjnej sprawia, że MF TFF jest preferowaną opcją wychwytywania granulek w porównaniu z filtracją wgłębną. Etap wytrącania i MF TFF był skalowany 10-krotnie do urządzenia z włóknami pustymi o powierzchni 0,12 m2 , a wydajność była porównywalna z małą skalą (Tabela 4).

Tabela 3. Wydajność i usuwanie zanieczyszczeń w przypadku operacji strącania PEG z zastosowaniem mikrofiltracji do odzyskiwania produktu w skali laboratoryjnej

Chromatografia wymiany kationowej

Chromatografię wymiany kationowej (CEX) o wysokiej wydajności oceniano z paszami poddanymi wstępnej obróbce z lub bez strącania PEG. Etap wytrącania nie miał znaczącego wpływu na wydajność etapu ani na procentową redukcję HCP, ale eluat otrzymany z wytrącanego materiału wsadowego miał siedmiokrotnie mniej HCP (Tabela 5).

Tabela 4. Wydajność i usuwanie zanieczyszczeń dla operacji wytrącania PEG z zastosowaniem mikrofiltracji do odzyskiwania produktu w skali pilotowej

Wnioski

Wytrącanie od dawna jest stosowane w przemyśle białek osocza do oczyszczania białek na dużą skalę. Technika ta została tutaj zaadaptowana do wstępnego oczyszczania MAb z klarowanych mediów typu fed-batch i XD w sposób skalowalny. Opracowano dwa etapy filtracji jednorazowego użytku w celu wychwycenia i przemycia wytrąconego produktu, eliminując potrzebę wirowania. Wykazano, że operacja wytrącania nie wpłynęła negatywnie na wydajność etapu wychwytywania CEX, a zmniejszyła zawartość HCP w eluacie siedmiokrotnie.

Tabela 5. Wydajność i usuwanie HCP dla GigaCap S-650 obciążonego wytrąconym (+PEG) i nie wytrąconym (âPEG) przeciwciałem

Możliwość zmniejszenia obciążenia zanieczyszczeniami tak daleko na początku procesu oczyszczania jest kluczem do skrócenia procesu na końcu łańcucha lub zastąpienia tradycyjnej chromatografii innymi technologiami jednorazowego użytku. Niższe obciążenie zanieczyszczeniami może poprawić zdolność ładowania przepływowych adsorberów membranowych i ewentualnie filtrów wirusowych, które są generalnie bardzo drogimi elementami w procesie.

Dodatkową korzyścią jest możliwość ponownego rozpuszczenia przeciwciała w buforze, który ułatwia kolejne operacje jednostkowe. Na przykład, pożywki hodowli komórkowych wymagają zwykle rozległego miareczkowania i rozcieńczania lub etapu UF-DF w celu przygotowania do chromatografii wychwytującej z wymieniaczem kationowym. W tym przypadku wytrącone przeciwciało można rozpuścić w buforze wyrównawczym o wysokim stężeniu, skracając w ten sposób czas przetwarzania. Może to być ważne w przypadku produktów, które nie tolerują długiej ekspozycji na warunki niskiego pH/przewodności. W przypadku tego konkretnego przeciwciała, sklarowane podłoże wymaga ponad dwukrotnego rozcieńczenia, aby załadować je na kolumnę CEX, podczas gdy ponownie rozpuszczone MAb może być załadowane bezpośrednio przy prawie dwukrotnym stężeniu nieskorygowanego podłoża. Jest to co najmniej czterokrotne zmniejszenie objętości ładunku, co może skutkować znaczną oszczędnością czasu w przypadku nowoczesnych, wysokowydajnych żywic CEX.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować zespołowi Percivia protein and analytical sciences za wsparcie testowe w tej pracy oraz grupie rozwoju procesów Percivia upstream za dostarczenie mediów do hodowli komórkowych.

Uwaga o znakach towarowych

PER.C6 jest zarejestrowanym znakiem towarowym Crucell Holland BV Corporation; XD jest zarejestrowanym znakiem towarowym DSM NV; a ECS jest zarejestrowanym znakiem towarowym DSM NV. Wszystkie inne nazwy marek są znakami towarowymi ich odpowiednich właścicieli.

MICHAEL KUCZEWSKI jest pracownikiem naukowym I, EMILY SCHIRMER, PhD, jest pracownikiem naukowym II, BLANCA LAIN, PhD, jest starszym pracownikiem naukowym, a GREGORY ZARBIS-PAPASTOITSIS, PhD, jest starszym dyrektorem, wszyscy w dziale rozwoju procesów downstream, Percivia LLC, Cambridge, MA, 617. 301.8821, [email protected]@percivia.com

1. Cohn EJ, Strong LE, Hughes WL, Mulford DJ, Ashworth JN, Melin M, et al. Przygotowanie i właściwości białek surowicy i osocza. IV. A system for the separation into fractions of the protein and lipoprotein components of biological tissues and fluids. J Amer Chem Soc. 1946;68(3):459-75.

2. Van der Wielen L, Hofland G, Ottens M, Gulobovic M, Witkam G-J. Manufacturing protein-based structures using a volatile acid. W: 224th National Meeting of the American Chemical Society. Boston, MA; 2002.

3. Habeeb A, Francis R. Preparation of human immunoglobulin by ammonium sulfate precipitation. Vox Sanguinis. 1976;31:423-34.

4. Wang J, Diehl T, Aguiar D, Dai X-P, Arunakumari A. Precipitation of process-derived impurities in non-Protein A purification schemes for antibodies. BioPharm Int. 2009 Oct suppl, Downstream Processing 2010: Embracing Innovation;4-10.

5. McDonald P, Victa C, Carter-Franklin JN, Fahrner R. Selective antibody precipitation using polyelectrolytes: A novel approach to the purification of monoclonal antibodies. Biotechnol Bioeng. 2009;102(4):1141-51.

6. Moya W, Jaber J, Moya W, inventors; Millipore Corp., assignee. Purification of Proteins. Patent Stanów Zjednoczonych US WO/2008/079280. 2006.

7. Polson A, wynalazca; South African Inventions Development Corporation, cesjonariusz. Frakcjonowanie mieszanin substancji białkowych z zastosowaniem glikolu polietylenowego. Patent Stanów Zjednoczonych US 3415804. 1968.

8. Giese G. Wytrącanie glikolem polietylenowym przeciwciał monoklonalnych i wpływ na chromatografię kolumnową. In: BioProcess Int. Raleigh, NC; 2009.

9. Tracz S, Otto J, Deits T. Effect of divalent ions on protein precipitation with polyethylene glycol: mechanism of action and applications. Protein expression and purification. 1991;2(1):83-9.

10. Ramanan S, Stenson R, Ramanan S, wynalazcy; Amgen, cesjonariusz. Metoda izolowania przeciwciał metodą wytrącania. Patent Stanów Zjednoczonych US 2008/0214795 A1. 2008 2/13/08.

11. Venkiteshwaran A, Heider P, Teysseyre L, Belfort G. Selective precipitation-assisted recovery of immunoglobulins from bovine serum using controlled-fouling crossflow membrane microfiltration. Biotechnol Bioeng. 2008;101(5):957-66.

12. Fallaux FJ, Hoeben RC, Eb AJvd, Bout A, Valerio D, Fallaux FJ, Hoeben RC, wynalazcy; IntroGene B.V, cesjonariusz. Systemy pakowania ludzkich rekombinowanych adenowirusów do stosowania w terapii genowej. Patent Stanów Zjednoczonych US 5994128. 1997.

13. Golden K, Bragg C, Chon J. The XD process: development of a high titer process for PER.C6 cells. W: 21st Meeting of the European Society of Animal Cell Technology. Dublin, Irlandia; 2009.

14. Chon J. Advances in platform fed-catch and XD production processes using the PER.C6 human cell line. Wilbio Waterside Conference; 2009 Apr 20-22; South San Francisco, CA.

15. Schirmer EB, Kuczewski M, Golden K, Lain B, Bragg C, Chon J, et al. Primary clarification of extreme-density cell culture harvests by enhanced cell settling. Bioprocess Int. 2010;8(1):32-9.

16. Lain B, Cacciuttolo MA, Zarbis-Papastoitsis G. Development of a High-Capacity MAb Capture Step Based on Cation-Exchange Chromatography. Bioprocess Int. 2009;7(5):26-34.

17. Yigzaw Y, Piper R, Tran M, Shukla AA. Exploitation of the adsorptive properties of depth filters for host cell protein removal during monoclonal antibody purification. Biotechnol Prog. 2006;22:288-96.

18. Milby KH, Ho SV, Henis JMS. Ion-exchange chromatography of proteins: the effect of neutral polymers in the mobile phase. J Chromatogr. 1989;482:133-44.

19. Gagnon P, Godfrey B, Ladd D. Method for obtaining unique selectivities in ion-exchange chromatography by addition of organic polymers to the mobile phase. J Chromatogr A. 1996;743:51-5.

20. Paithankar KR, Prasad KS. Precipitation of DNA by polyethylene glycol and ethanol. Nucleic Acids Research.1991;19(6):1346.