Peptydy przeciwdrobnoustrojowe: Their Role as Infection-Selective Tracers for Molecular Imaging

3.3. Asymetria błony

Ale błony komórkowe nie są ani symetryczne, ani statyczne, różnice między błonami fosfolipidowymi ssaków i drobnoustrojów mogą służyć jako potencjalne cele dla peptydów przeciwdrobnoustrojowych. W niektórych komórkach, takich jak erytrocyt bydlęcy, tylko 2% całkowitej zawartości PE znajduje się na zewnętrznym listku błony. Różnice w symetrii błony, nasyceniu dwuwarstw fosfolipidowych i stechiometrii składu wpływają na płynność błony i przejście fazowe. W podobny sposób ładunek wewnętrznego i zewnętrznego listka warstwy komórkowej może być również różny .

3.4. Microbial Ligands and Receptors as Targets for Antimicrobial Peptides

Eksperymenty wykazały, że wersje D- i L-aminokwasowe peptydów przeciwdrobnoustrojowych wykazują podobne powinowactwo wiązania do komórek docelowych, co sugeruje, że stereospecyficzne receptory nie są zaangażowane w ukierunkowanie komórek patogennych . Jednak kilka badań zdaje się to obalać i sugeruje, że pewne białka zlokalizowane w błonie komórkowej drobnoustrojów mogą służyć jako cele wiążące dla pewnych klas peptydów przeciwdrobnoustrojowych, takich jak histatyny. Potwierdza to tezę, że histadyny są zaangażowane w lokalne mechanizmy obronne przed konkretnymi rodzajami patogenów i zostały wykryte w ranach zębów i skóry. Niektórzy badacze postulują również, że anionowe składniki błon komórkowych, na przykład CL, PG lub lipopolisacharyd (LPS), mogą służyć jako pseudoreceptory, umożliwiając wstępną interakcję między peptydem przeciwdrobnoustrojowym a komórką docelową drobnoustroju. Stąd receptory wiążące się z drobnoustrojami mogą stanowić alternatywną ścieżkę interakcji AMP z otoczką komórki bakteryjnej.

3.5. Potencjał transmembranowy

Potencjał transmembranowy to kolejny sposób, w jaki różnią się komórki bakterii i ssaków, a polega on na rozdzieleniu ładunku, który istnieje między wewnętrzną i zewnętrzną warstwą błony cytoplazmatycznej. Gradient elektrochemiczny, wynikający z różnej szybkości wymiany protonów przez błonę komórkową, określany jest jako potencjał transmembranowy (Δψ). Normalna komórka ssaków posiada Δψ w zakresie od -90 do -110 mV. Bakterie patogenne natomiast wykazują Δψ w zakresie od -130 do -150 mV. Ta znacząca różnica w potencjale elektrochemicznym może być kolejnym czynnikiem, który pozwala peptydom przeciwdrobnoustrojowym rozróżniać komórki gospodarza i komórki docelowe .

4. Selective Toxicity Based on Antimicrobial Peptide Design

W wodnym środowisku międzykomórkowym uważa się, że wiele peptydów przeciwdrobnoustrojowych przyjmuje rozszerzone lub nieuporządkowane konformacje, chociaż może tak nie być, jeśli obecne są wiązania wewnątrzcząsteczkowe, które zapewnią określoną konformację w różnych środowiskach ze względu na indukowaną sztywność. Gdy peptyd przeciwdrobnoustrojowy zwiąże się z błoną komórkową patogennego mikroba, może ulec znacznej zmianie konformacyjnej i przyjąć specyficzną konformację, taką jak helisa α. Badania sugerują, że dynamiczne i/lub nieodłączne konformacje peptydów przeciwdrobnoustrojowych mają wpływ na ich selektywną cytotoksyczność. Dodatkowo, peptydy przeciwdrobnoustrojowe mogą ulegać przemianom konformacyjnym, samoasocjacji lub oligomeryzacji w obrębie docelowej błony patogenu, ale nie w obrębie błony komórki gospodarza, aby zwiększyć toksyczność specyficzną dla danej komórki. Zhang i współpracownicy zastosowali syntetyczne peptydy testowe, które były jednolicie kationowe, ale różniły się konformacją i zawierały struktury wydłużone, cykliczne, α-helikalne i β-szkieletowe. Ustalono, że wszystkie testowane peptydy były w stanie oddziaływać i penetrować monowarstwy lipidowe złożone z PG, ujemnie naładowanego fosfolipidu. Jednakże, tylko peptydy o strukturze α-helikalnej i wydłużonej były w stanie oddziaływać z bardziej neutralnie naładowaną błoną PC. W tym samym badaniu stwierdzono również, że peptydy o arkuszu β były zdolne do translokacji fosfolipidów z wewnętrznego do zewnętrznego listka w stężeniach niższych niż te, które były wymagane do permeabilizacji błony. Podobnie Kol i współpracownicy wykazali, że peptydy o porównywalnej konformacji, ale bogate w histydynę i lizynę, a pozbawione tryptofanu, również były w stanie indukować znaczące poziomy translokacji fosfolipidów. Na podstawie tych badań można stwierdzić, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe nie tylko oddziałują z błonami fosfolipidowymi o jedynie specyficznym składzie i symetrii, ale również są w stanie wpływać na przebudowę błon w określonych komórkach.

4.1. In Vivo Preferential Affinity for Microbial versus Mammalian Cells

Welling i współpracownicy przeprowadzili eksperyment in vivo, w którym badali powinowactwo wiążące znakowanego radem fragmentu kationowego peptydu antybakteryjnego ubikwicydyny -UBI 29-41 do komórek drobnoustrojów w porównaniu z komórkami gospodarza. W badaniu zwierzęta zakażono Candida albicans, Klebsiella pneumonia lub Staphylococcus aureus. Sterylne zapalenia wywoływano również w mięśniach ud zwierząt poprzez wstrzyknięcie zabitych termicznie mikroorganizmów lub oczyszczonego LPS, co miało służyć jako kontrola. Radiolabilne peptydy gromadziły się w znacznym stopniu w miejscach zakażonych w porównaniu do sterylnych lub nie zakażonych zapalnie części ciała. Ten eksperyment in vivo wykazał, że peptydy mogą rozróżniać komórki gospodarza i komórki drobnoustrojów, a także gromadzić się w zainfekowanych miejscach. Dzięki pomiarom scyntygraficznym ustalono, że peptydy znakowane radioaktywnie gromadziły się w zakażonych tkankach w szybkim tempie i że występował nawet pięciokrotny wzrost tempa gromadzenia się w zakażonych tkankach w stosunku do tkanek niezakażonych. Ta szybka lokalizacja została zinterpretowana jako peptydy posiadające wyższe lub preferencyjne powinowactwo do powierzchni komórki docelowej w stosunku do powierzchni komórki gospodarza.

4.2. Localisation of Cytotoxic Antimicrobial Peptides Limits Exposure of Vulnerable Host Tissues

It is possible that host cell cytotoxicity is reduced in many multicellular organisms due to their localization to tissues that are not vulnerable to their cytotoxic effects. U większości zwierząt peptydy te są wydzielane przez komórki na stosunkowo obojętne i wytrzymałe powierzchnie, takie jak nabłonek jelit lub płuc, a u płazów – na skórę. W tych miejscach najczęściej dochodzi do interakcji z potencjalnie szkodliwymi mikrobami, a ekspresja większości peptydów przeciwdrobnoustrojowych jest konstytutywna lub szybko indukowana, co pozwala im stanowić część pierwszej obrony przed patogenami. Innym sposobem ochrony wrażliwych tkanek gospodarza przed peptydami przeciwdrobnoustrojowymi jest umieszczanie ich w ziarnistościach fagocytujących leukocytów, które pochłaniają patogeny i narażają je na śmiertelne stężenia peptydów przeciwdrobnoustrojowych i czynników utleniających. W ten sposób wykorzystywana jest klasa peptydów przeciwdrobnoustrojowych defensyn, ponieważ są one jednymi z najbardziej toksycznych i najmniej selektywnych spośród peptydów przeciwdrobnoustrojowych produkowanych przez gospodarza. Lekko kwaśne mikrośrodowisko wewnątrz dojrzałego fagolizosomu jest również najbardziej efektywnym środowiskiem dla defensyn, ponieważ wykazują one maksymalną cytotoksyczność w tych warunkach .

5. Mechanizmy działania peptydów przeciwdrobnoustrojowych

Generalnie konserwowane struktury peptydów przeciwdrobnoustrojowych, w szerokiej gamie organizmów, dostarczają pewnych wskazówek co do ich mechanizmów działania. Są one prawie wyłącznie amfipatyczne i kationowe w warunkach fizjologicznych, i uważa się, że to pomaga w ich selektywności w stosunku do komórek docelowych. Idealny peptyd przeciwdrobnoustrojowy powinien charakteryzować się niską cytotoksycznością w stosunku do komórek gospodarza, ale być toksyczny dla szerokiej gamy mikroorganizmów patogennych. Determinanty przeciwdrobnoustrojowe powinny być łatwo dostępne i nie powinny być podatne na zmiany lub modyfikacje. Ogólnie rzecz biorąc, peptydy przeciwdrobnoustrojowe mają strukturę amfipatyczną, która pozwala im oddziaływać z błonami fosfolipidowymi, strukturami, które są niezbędne dla wszystkich patogenów. Parametry takie jak konformacja (), hydrofobowość (), moment hydrofobowy (), ładunek (), kąt polarny () i amfipatyczność () są ważne dla funkcjonowania peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Co więcej, wszystkie te determinanty są wzajemnie powiązane i modyfikacja jednej z tych cech prowadzi do zmiany pozostałych .

5.1. Konformacja ()

Pomimo, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe mogą występować w szerokim zakresie organizmów żywicielskich i mają różne sekwencje aminokwasów, można je sklasyfikować w kilka dyskretnych grup na podstawie ich struktury drugorzędowej. Dwie największe grupy obejmują peptydy, które posiadają strukturę drugorzędową β-szkieletową lub α-helikalną. Większość pozostałych peptydów przeciwdrobnoustrojowych to te, które mają wyjątkowo wysoki udział jednego lub więcej aminokwasów, takich jak tryptofan lub prolina i arginina. Peptydy α-helikalne są często spotykane w płynie międzykomórkowym owadów i płazów i generalnie przyjmują nieuporządkowaną lub wydłużoną konformację w roztworze wodnym, przyjmując swoją strukturę helikalną dopiero po interakcji z błoną fosfolipidową. Powodem tego jest to, że wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe wymagane dla konformacji α-helikalnej jest zakłócone w polarnym rozpuszczalniku, takim jak woda. W błonie, polarne grupy wiązania wodorowego są osłonięte przed lipofilowym (apolarnym) środowiskiem błony poprzez formację α-helikalną. Konformacja helisy odsłania również apolarne łańcuchy boczne do neutralnego środowiska lipidowego wewnątrz membrany. Chociaż struktura pierwotna peptydów przeciwdrobnoustrojowych klasy β-heliksów wykazuje pewien poziom niepodobieństwa w sekwencji aminokwasowej, wszystkie one mają wspólne cechy w odniesieniu do struktury amfipatycznej, posiadając wyraźne domeny hydrofilowe i hydrofobowe .

5.2. Ładunek ()

Większość peptydów przeciwdrobnoustrojowych jest ogólnie kationowa i posiada ładunek w zakresie od +2 do +9, przy czym wiele z nich posiada silnie zdefiniowane ujemnie naładowane domeny. Ten dodatni ładunek jest ważny dla początkowego przyciągania i interakcji z anionowymi błonami komórkowymi bakterii i innych mikroorganizmów chorobotwórczych. Podobnie, stosunkowo mniej anionowe błony gospodarza nie przyciągają elektrostatycznie peptydów przeciwdrobnoustrojowych i mogą nadawać peptydom pewną selektywność w stosunku do komórek docelowych. Bakterie patogenne są zazwyczaj bogate w kwaśne fosfolipidy, takie jak CL, PG i PS. Dodatkowo, kwasy teichoinowy i teichuronowy ścian komórkowych bakterii Gram-dodatnich oraz LPS bakterii Gram-ujemnych nadają dodatkowy ładunek elektronegatywny powierzchni komórki bakteryjnej. Ustalono, że Δψ bakterii jest zazwyczaj o 50% wyższe niż komórek ssaków i zaproponowano, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe mogą być koncentrowane na powierzchni mikroorganizmów chorobotwórczych w sposób elektroforetyczny. Chociaż wiele badań było w stanie skorelować kationowość peptydów przeciwdrobnoustrojowych z ich aktywnością przeciwdrobnoustrojową, nie istnieje ściśle liniowa zależność. Dathe i współpracownicy wykazali w badaniach z analogami magaininy, że zwiększenie kationowości z +3 do +5 powodowało wzrost aktywności przeciwbakteryjnej zarówno wobec gatunków Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych. Zauważyli oni jednak, że istnieje granica kationowości, po przekroczeniu której zwiększenie ładunku dodatniego nie powoduje już wzrostu aktywności przeciwbakteryjnej. Uważa się, że ten spadek aktywności przeciwbakteryjnej mógł być spowodowany tym, że peptydy wiązały się tak silnie z ujemnie naładowaną grupą główną fosfolipidu, że translokacja peptydu do wnętrza komórki była niemożliwa .

5.3. Amfipatyczność () i moment hydrofobowy ()

Amfipatyczność jest niemal uniwersalną cechą wśród peptydów przeciwdrobnoustrojowych i jest osiągana poprzez szereg różnych struktur peptydowych. Amfipatyczna helisa α jest jedną z najczęstszych i najprostszych z tych cech. Poprzez naprzemienne rozmieszczenie anionowych i kationowych reszt aminokwasowych w każdej z trzech do czterech pozycji, peptyd jest w stanie przyjąć strukturę drugorzędową, która pozwala na optymalną elektrostatyczną interakcję z amfipatycznymi błonami fosfolipidowymi (Rysunek 3). Ta cecha pozwala peptydowi na wywieranie aktywności cytotoksycznej wobec nie tylko ujemnie naładowanych błon komórkowych, ale również tych o ładunku neutralnym lub amfipatycznym .

Rysunek 3

Statystyczna analiza rozkładu reszt w 20-residowym odcinku N-końcowym α-helikalnych AMP pochodzących ze źródeł naturalnych. Przedstawiono graficzną reprezentację częstości występowania różnych typów reszt w każdej pozycji na rzucie koła helikalnego. Nierównomierne rozmieszczenie hydrofobowych i naładowanych peptydów przyczynia się do amfipatycznej natury peptydu (dostosowane z Tossi et al. ).

Amfipatyczność peptydu może być opisana przez jego moment hydrofobowy (), który można obliczyć jako wektorową sumę hydrofobowości poszczególnych aminokwasów, znormalizowaną do idealnej helisy. Wzrost momentu hydrofobowego koreluje z większą permeabilizacją docelowej błony komórkowej. Jest to szczególnie istotne w przypadku interakcji z błonami lipidowymi, które są neutralnie naładowane, gdzie czynniki ładunkowe prawdopodobnie nie spowodują wymaganego przyciągania i interakcji z docelową błoną komórkową. Podobnie jak α-helikalne peptydy przeciwdrobnoustrojowe, peptydy obrony gospodarza o arkuszu β również wykazują amfipatyczność. Objawia się to różną liczbą pasm β zorganizowanych w celu utworzenia powierzchni hydrofobowych i hydrofilowych. Prążki β, które często są antyrównoległe, są stabilizowane przez regularnie rozmieszczone wiązania disiarczkowe lub przez cyklizację szkieletu peptydowego. To wewnątrzcząsteczkowe wiązanie pozwala peptydom przeciwdrobnoustrojowym na utrzymanie sztywnej konformacji nawet w wodnym płynie zewnątrzkomórkowym, a także ułatwia multimeryzację, ponieważ powierzchnie hydrofobowe będą się grupować, aby uniknąć kontaktu ze środowiskiem wodnym. Chociaż dokładny mechanizm, za pomocą którego amfipatyczne peptydy przeciwdrobnoustrojowe powodują przerwanie błony w docelowej błonie komórkowej, jest obecnie nieokreślony, głównie dlatego, że nie jest znana dokładna konformacja peptydów w błonach, badania wykazały, że segregowana amfipatyczność zarówno w α-helikalnych, jak i β-szetowych peptydach przeciwdrobnoustrojowych ma głęboki wpływ na przerwanie przez peptyd naturalnych biomembran .

5.4. Hydrofobowość ()

Hydrofobowość peptydu może być zdefiniowana jako procent hydrofobowych reszt aminokwasowych tworzących jego strukturę pierwotną. W przypadku większości peptydów przeciwdrobnoustrojowych hydrofobowość wynosi około 50% i jest niezbędna do funkcjonowania peptydu, ponieważ umożliwia mu oddziaływanie z warstwą fosfolipidową i przenikanie do niej. Chociaż pewna ilość hydrofobowości jest niezbędna do funkcjonowania peptydu przeciwdrobnoustrojowego, nadmierna hydrofobowość zwiększy prawdopodobieństwo niszczenia komórek gospodarza i zmniejszy jego specyficzność w stosunku do komórek drobnoustrojów. Wieprecht i współpracownicy badali zależność pomiędzy hydrofobowością peptydów a ich zdolnością do permeabilizacji biomembran. Używając analogów magaininy jako modelowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych, byli w stanie utrzymać czynniki takie jak moment hydrofobowy, helikoidalność i ładunek prawie na stałym poziomie, jednocześnie produkując analogi o zmiennej hydrofobowości. Ich eksperymenty wykazały, że hydrofobowość miała niewielki lub żaden wpływ na zdolność peptydu do wiązania się i permeabilizacji membrany, gdy składała się ona wyłącznie z PG. Jednakże w membranach składających się z 3 : 1 stosunku PC : PG, peptydy o najwyższej hydrofobowości miały około 60-krotnie wyższą zdolność permeabilizowania niż peptyd najmniej hydrofobowy, a w membranach składających się wyłącznie z PC różnica była 300-krotna.

5.5. Kąt polarny ()

Kąt polarny peptydu odnosi się do względnej proporcji polarnych do niepolarnych faset peptydu skonformowanego w amfipatyczną helisę. Peptyd helikalny, którego jedna strona składa się całkowicie z polarnych reszt aminokwasowych, a druga strona składa się całkowicie z reszt niepolarnych, miałby kąt polarny 180°. Mniejsza segregacja pomiędzy domenami lub nadmiar reszt hydrofobowych prowadzi do mniejszego kąta polarnego. Badania przeprowadzone przez Uematsu i Matsuzaki zarówno na syntetycznych jak i naturalnie występujących peptydach wykazały, że niższy kąt polarny, a więc bardziej hydrofobowe oblicze bardziej sprzyja permeabilizacji błony. Kąt polarny został również skorelowany ze stabilnością porów wywołanych przez peptydy w biomembranach. Wykazano również, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe o mniejszych kątach polarnych były w stanie indukować wyższy stopień permeabilizacji błony i translokację z większą szybkością niż peptydy o większych kątach polarnych. Jednakże, pory utworzone przez peptydy o mniejszych kątach polarnych były mniej stabilne niż te utworzone przez peptydy o większych kątach polarnych. Właściwości hydrofobowe i hydrofilowe peptydów przeciwdrobnoustrojowych mogą być postrzegane jako odgrywające istotne role w interakcjach z fosfolipidowymi błonami komórkowymi i ich permeabilizacji .

5.6. Common Structural Features of Antimicrobial Peptides

Whilst a wide variety of antimicrobial peptides do exist in nature, conservation of key features and secondary structures has been noted. Skrajne cechy, takie jak amfipatyczność, ładunek, moment hydrofobowy lub kąt polarny nie są korzystne, ponieważ mają tendencję do osłabiania aktywności przeciwdrobnoustrojowej lub prowadzą do zwiększonej cytotoksyczności komórek gospodarza. Minimalny ładunek, jaki peptydy mogą posiadać w celu wywierania jakiejkolwiek aktywności przeciwdrobnoustrojowej wydaje się wynosić +2. Ta minimalna kationowość jest ważna, ponieważ pozwala na początkowe elektrostatyczne przyciąganie do błony bakteryjnej, która jest naładowana ujemnie. Pozwala to również na przemieszczenie wszelkich innych kationów, które mogą być już związane z docelową błoną komórkową i na translokację do wnętrza dwuwarstwy membrany. Podobnie, hydrofobowość peptydu powinna być umiarkowana, ponieważ bardzo hydrofobowe peptydy przeciwdrobnoustrojowe będą celować w błony o neutralnym ładunku netto, takie jak komórki gospodarza, prowadząc do zmniejszenia selektywności celu i uszkodzenia organizmu gospodarza. Można zauważyć, że selektywne namierzanie drobnoustrojów chorobotwórczych jest w dużej mierze spowodowane równowagą między elektronegatywnością i hydrofobowością peptydów przeciwdrobnoustrojowych

6. Początkowe interakcje z docelową błoną komórkową

Wstępne interakcje między peptydem przeciwdrobnoustrojowym a błoną fosfolipidową komórki są ważne, ponieważ określają selektywność komórki docelowej, a także wpływają na wszelkie późniejsze interakcje z komórką docelową. Początkowe interakcje są w dużej mierze określane przez fizyczne i chemiczne cechy zarówno peptydu przeciwdrobnoustrojowego, jak i docelowej błony komórkowej

6.1. Interakcje elektrostatyczne

Powszechnie uważa się, że interakcje elektrostatyczne są odpowiedzialne za początkowe ukierunkowanie na komórkę bakteryjną. Badanie przeprowadzone przez Matsuzaki skorelowało kationowość peptydów przeciwdrobnoustrojowych ze zdolnością wiązania się z błoną, a fakt, że kationowość jest konserwowaną cechą prawie wszystkich peptydów przeciwdrobnoustrojowych w szerokim zakresie organizmów dodatkowo wspiera ten argument. Siły elektrostatyczne działają na długim dystansie, a obfitość reszt lizyny i argininy w peptydach przeciwdrobnoustrojowych, które są przyciągane do ujemnie naładowanych grup fosforanowych biomembran, dodatkowo uwiarygodnia teorię, że te interakcje są odpowiedzialne za początkowe przyciąganie do docelowej błony komórkowej. U bakterii Gram-ujemnych uważa się, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe wypierają kationy, które są normalnie związane z LPS, ponieważ peptydy przeciwdrobnoustrojowe mają powinowactwo wiązania do LPS, które jest około trzy rzędy wielkości większe niż kationy dwuwartościowe zwykle związane z tą cząsteczką. Szczepy bakterii, w których LPS jest silnie podstawiony 4-amino-4-deoxy-L-arabinozą lub jest silnie acylowany wykazują większą oporność na dodatnio naładowane peptydy przeciwdrobnoustrojowe, co dodatkowo uwiarygodnia teorię, że ładunek elektrostatyczny jest ważny dla interakcji z docelową błoną komórkową. Bakterie Gram-dodatnie nie posiadają LPS lub zewnętrznej błony komórkowej, ale mają grubą ścianę komórkową zbudowaną z polimerów kwasu teichuronowego lub teichoinowego. Te wysoce anionowe struktury są idealnym celem dla kationowych peptydów przeciwbakteryjnych. Szczepy Staphylococcus aureus, w których kwasy teichonowe zostały zmodyfikowane, co spowodowało zwiększenie ładunku anionowego, są bardziej podatne na działanie kationowych peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Uważa się również, że fakt, iż większość bakterii ma silny gradient elektrochemiczny (Δψ) w stosunku do komórek ssaków, zwiększa selektywność docelową peptydów przeciwdrobnoustrojowych .

6.2. Receptor-Ligand Interakcje z błoną

Niektóre badania wykazały, że zarówno naturalnie występujące, jak i syntetyczne peptydy oddziałują z błoną równie dobrze, niezależnie od tego, czy używane są D-aminokwasy czy L-aminokwasy. Sugerowałoby to, że interakcje z biomembranami nie są zależne od mechanizmów receptor-ligand; jednakże inne badania wykazały, że może tak nie być w przypadku wszystkich peptydów przeciwdrobnoustrojowych. Stwierdzono, że nizyna, naturalnie występujący cykliczny peptyd o silnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym, wiąże się specyficznie z lipidem II związanym z błoną bakteryjną. Podobnie, wykazano, że tachyplesyna ma specyficzne powinowactwo do LPS. Dane z tych badań sugerują, że wiązanie z udziałem receptora jest ważne dla ukierunkowania na komórki w przypadku niewielkiej liczby peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

7. Zdarzenia następujące po początkowym wiązaniu z błoną

Doświadczalne określenie początkowego przyciągania peptydów do błon komórkowych i interakcji z nimi jest zwykle prostsze niż określenie interakcji, które następują po tym. Różnorodne metodologie, takie jak dichroizm kołowy, krystalografia rentgenowska, magnetyczny rezonans jądrowy, chromatografia cieczowa z odwróconą fazą i rezonans plazmonów powierzchniowych, między innymi techniki, zostały wykorzystane do wyjaśnienia interakcji peptyd-membrana. Jednakże, sugeruje się, że skuteczność i mechanizmy przeciwdrobnoustrojowe są niezwykle wrażliwe na warunki takie jak pH, siła osmotyczna, lepkość roztworu i temperatura, więc wszelkie dane uzyskane za pomocą wyżej wymienionych technik muszą być postrzegane w odniesieniu do tych warunków. Po wstępnym związaniu z błoną, peptydy przeciwdrobnoustrojowe przenikają przez zewnętrzną błonę fosfolipidową, co jest fazą określaną jako stężenie progowe, i w ten sposób są w stanie wywierać swoje cytotoksyczne działanie we wnętrzu komórki. Wniknięcie peptydów do komórki wymaga minimalnej liczby lub stężenia progowego peptydów przeciwdrobnoustrojowych, aby zgromadzić się na powierzchni błony lipidowej. Na to wydarzenie mogą mieć wpływ czynniki inne niż stężenie, takie jak zdolność peptydów do multimeryzacji, a także cechy samej błony fosfolipidowej, takie jak jej skład lipidowy, wielkość grupy nagłówkowej i płynność. Potencjał transmembranowy dwuwarstwy może również wpływać na sposób, w jaki peptyd wchodzi do błony, ponieważ wysoce ujemny potencjał transmembranowy ułatwi tworzenie porów, wciągając dodatnio naładowany peptyd do błony

8. Zmiany w konformacji peptydu po interakcji z błoną

Wiele peptydów przeciwdrobnoustrojowych, zwłaszcza tych o α-helikalnej strukturze drugorzędowej, ulega znacznej rearanżacji konformacyjnej po wejściu do niepolarnego środowiska błony wewnętrznej. α-helikalne peptydy przeciwdrobnoustrojowe są zwykle nieuporządkowane w środowisku zewnątrzkomórkowym, wykazując przypadkowe struktury cewkowe lub wydłużone, ale szybko przekształcają się w uporządkowaną helisę α, gdy są związane z biomembraną. Niektóre peptydy przeciwdrobnoustrojowe mogą ulegać tej zmianie konformacyjnej tylko w połączeniu z ujemnie naładowaną błoną dwuwarstwową. Może to wynikać ze sposobu ułożenia lipidów w takich błonach, gdzie fosfolipidowe grupy główne indukują optymalną periodyczność kationowych reszt aminokwasowych w peptydzie, co z kolei sprzyja prawidłowej konformacji do helikalnej struktury drugorzędowej. Sugeruje się, że ta cecha zapewnia, że peptydy przeciwdrobnoustrojowe będą „aktywowane” do postaci cytotoksycznej tylko w obecności docelowej błony komórkowej, w tym przypadku ujemnie naładowanej bakterii, i nie będą masowo uszkadzać nie docelowych komórek gospodarza. Wewnątrzcząsteczkowe wiązania disiarczkowe występujące w peptydach β-szkieletowych zapewniają, że zachowują one swoją strukturę drugorzędową nawet w środowisku wodnym, a zatem nie ulegają drastycznym rearanżacjom konformacyjnym obserwowanym w peptydach α-helikalnych, chociaż czwartorzędowe struktury peptydowe mogą ulec dysocjacji po wniknięciu do błony, co mogłoby ułatwić selektywną toksyczność. Po wstępnej interakcji z błoną komórkową wiele peptydów może ulegać samoasocjacji, co w połączeniu z interakcjami lipid-peptyd może prowadzić do tworzenia złożonych struktur, które przyczyniają się do cytotoksycznego działania peptydu. Sekwencja aminokwasowa i konformacja peptydu przeciwdrobnoustrojowego w formie monomeru będzie dyktować jego zdolność do tworzenia tych struktur. W peptydach amfipatycznych, domeny hydrofobowe są w stanie oddziaływać z niepolarnym hydrofobowym obszarem rdzenia dwuwarstwy lipidowej, tym samym wpychając peptyd głębiej w błonę. Alternatywnie mogą one również oddziaływać z hydrofobowymi powierzchniami innych peptydów, promując multimeryzację w celu uniknięcia ekspozycji tych powierzchni na środowisko wodne. Ten rodzaj multimeryzacji i interakcji z wnętrzem dwuwarstwy lipidowej może prowadzić do powstawania w biomembranie wyłożonych peptydami porów lub kanałów, co skutkuje utratą integralności i permeabilizacją. Ponieważ biomembrany są bardzo zróżnicowane pod względem składu i struktury, możliwe jest, że peptyd może zachowywać się na wiele różnych sposobów, gdy wiąże się z różnymi błonami komórkowymi. Zaproponowano kilka modeli opisujących tworzenie się porów obserwowane w błonach, które zostały poddane działaniu peptydów przeciwdrobnoustrojowych.

8.1. The Barrel-Stave Model

Ten mechanizm tworzenia porów membranowych jest tak nazwany, ponieważ transmembranowe peptydy, lub kompleksy peptydowe, wyściełające kanał są ułożone w pierścień przypominający beczkę, z peptydami tworzącymi transmembranowe klepki. Peptydy amfipatyczne są zorientowane tak, że domeny hydrofobowe oddziałują z niepolarnymi ogonami węglowodorowymi znajdującymi się we wnętrzu błony lipidowej, natomiast domeny hydrofilowe są zorientowane tak, że skierowane są w stronę wodnego kanału porów i tworzą jego wyściółkę . Początkowo monomer peptydów gromadzi się na powierzchni komórki i ulega konformacyjnej rearanżacji, gdy styka się z błoną (Rysunek 4). Uważa się, że wymusza to odsunięcie na bok fosfolipidowych grup głównych i wywołuje rozrzedzenie błony. Pozwala to hydrofobowej części peptydu wejść do niepolarnego wnętrza błony, podczas gdy kationowe aminokwasy peptydu antybakteryjnego oddziałują z ujemnie naładowanymi grupami głównymi. Kiedy stężenie progowe peptydów zostaje osiągnięte, monomery peptydów są w stanie agregować tworząc multimery, które dalej wtłaczają peptydy do hydrofobowego centrum błony, ponieważ agregacja zapobiega wystawieniu hydrofilowych części peptydu na działanie hydrofobowych części błony wewnętrznej (Rysunek 4(a)). W miarę agregacji coraz większej liczby monomerów peptydu, por w błonie ulega rozszerzeniu .

(a)

(b)

.
(c)

(a)
(b)
(c)

Welling i współpracownicy oceniali całą znakowaną ubikwicydynę i różne znakowane radiolabilnie fragmenty peptydu, w tym UBI1-18 (KVHGSLARAGKVRGQTPK), UBI29-41 (TGRAKRRMQYNRR), UBI18-29 (KVAKQEKKKT), UBI 18-35 (KVAKQEKKKTGRAKRR), UBI31-38 (RAKRRMQY) i UBI22-35 (QEKKKTGRAKRR) pod kątem ich zdolności do wiązania się z komórkami bakteryjnymi i/lub ludzkimi leukocytami w warunkach in vitro. Stwierdzono, że fragmenty peptydowe ubikwicydyny UBI 18-35, UBI 31-38, UBI 22-35 i UBI 29-41 wykazywały znacznie wyższe powinowactwo wiązania do komórek bakteryjnych niż do ludzkich leukocytów. Wyniki in vivo, uzyskane za pomocą scyntygrafii eksperymentalnie zakażonych myszy po dożylnym podaniu różnych radioznakowanych peptydów wykazały, że peptydy UBI18-35 i UBI29-41 wydają się być najbardziej obiecującymi kandydatami. Po okresie 2 h i 24 h od podania, stosunek wiązania leukocytów do bakterii wynosił 1 : 36, 1 : 166 oraz 1 : 73, 1 : 220 odpowiednio dla UBI18-35 i UBI29-41. Badacze doszli do wniosku, że UBI29-41 i UBI18-35 były optymalnymi peptydami do odróżniania infekcji od jałowych stanów zapalnych.

9.3. Human Clinical Trials of -Ubiquicidin 29-41 as an Infection Imaging Agent

Akhtar i współpracownicy badali skuteczność -UBI 29-41 jako środka obrazującego infekcje u osiemnastu pacjentów z podejrzeniem infekcji protezy lub tkanek miękkich. Używając scyntygrafii do monitorowania znakowanego radem peptydu, badacze byli w stanie monitorować stosunek celu do niecelu (T/NT) środka obrazującego. Zakażenie u pacjentów zostało potwierdzone poprzez hodowlę bakterii z zainfekowanego miejsca lub, gdy nie było to możliwe, poprzez pełne badanie krwi. W badaniu stwierdzono, że wszyscy pacjenci dobrze tolerowali peptyd znakowany izotopem promieniotwórczym, nie odnotowano żadnych istotnych zmian w ich parametrach życiowych, a po podaniu -UBI 29-41 nie wystąpiły żadne działania niepożądane. Stosunek T/NT określano w 30, 60 i 120 minucie, przy czym skan 30-minutowy wykazywał najwyższą średnią wartość T/NT. Skanowanie przedniej części całego ciała (ryc. 7) dostarczyło informacji o biodystrybucji znacznika i drogach jego eliminacji przez organizm. Można zauważyć, że znacznik jest eliminowany głównie przez układ moczowy, odnotowano również pewną zależną od perfuzji aktywność wątroby. Stwierdzono, że czułość środka obrazującego wynosi 100%, a swoistość 80%. Badacze stwierdzili, że -UBI 29-41 ma pozytywną wartość predykcyjną wynoszącą 92,9%, negatywną wartość predykcyjną wynoszącą 100% i ogólną dokładność diagnostyczną wynoszącą 94,4%. Radioznakowany peptyd wykazywał skuteczność wobec wielu różnych bakterii, w tym Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes. Zdaniem badaczy, -UBI 29-41 jest wysoce czułym i specyficznym środkiem obrazowania do wykrywania infekcji tkanek miękkich i kości u ludzi.

Rycina 7

Zewnętrzny obraz całego ciała wykonany w 30 minucie po wstrzyknięciu znacznika przedstawiający nerki (strzałka z kropką), wątrobę (strzałka pełna) i pęcherz moczowy (strzałka z kulką) (dostosowany z ).

10. Omówienie i perspektywy

Wykorzystanie metod medycyny nuklearnej, takich jak SPECT lub PET, pozwala klinicystom na nieinwazyjne badanie całego ciała pod kątem procesów fizjologicznych, takich jak utajone zakażenia na poziomie komórkowym. Oprócz tego, że te wysoce czułe technologie są użytecznym narzędziem do badań fizjologicznych i medycznych, są one w stanie wykryć choroby bez lub przed zmianami anatomicznymi (gorączka nieznanego pochodzenia). Do tej pory wykorzystuje się leukocyty znakowane radioaktywnie, przeciwciała monoklonalne przeciwko cytokinom/leukocytom oraz znaczniki związane z określonymi celami molekularnymi lub procesami metabolicznymi. Leukocyty znakowane radiologicznie mają szereg ograniczeń (zmiana funkcji leukocytów w wyniku uszkodzenia radiacyjnego), tj. mają uciążliwą farmakokinetykę, a także są stosunkowo niespecyficzne. Co więcej, znakowane leukocyty i wysokocząsteczkowe znaczniki, takie jak przeciwciała, mogą mieć również ograniczoną penetrację do zainfekowanych lub chorych tkanek. Ostatni z przedstawionych przeglądów wyjaśnia szeroki potencjał AMPs do oceny jako sond obrazowych, biorąc pod uwagę ich unikalne selektywne zaangażowanie w bakterie. Prosta kwerenda literaturowa, wyszukująca „peptydy przeciwdrobnoustrojowe” dała wynik około 6000 publikacji. Jednak po połączeniu tego zapytania z terminem „obrazowanie”, otrzymano tylko 63 publikacje, z których tylko 17 ma znaczenie kliniczne (-UBI-29-41 badań powiązanych). Jest to ważna obserwacja, ponieważ ten fragment ubikwitydyny może stanowić prawie idealny nośnik dla cząsteczek celujących w wykrywanie infekcji. Badania kliniczne na ludziach przeprowadzone przez Akhtar i współpracowników z -UBI 29-41 nie wykazały żadnych dowodów cytotoksyczności u pacjentów, co potwierdza wyniki obecnego badania. Nawet jeśli stwierdzono, że stosunek sygnału do szumu jest niski, jest on z powodzeniem stosowany od 10 lat. W 2010 roku dotychczasowe badania kliniczne zostały uzasadnione przez de Murphy i wsp. w kierunku ich wartości diagnostycznej w początkowym 7-letnim okresie. -Metaanaliza -UBI 29-41 zwróciła wysokie wartości dla czułości (96,3%), swoistości (94,1%) i dokładności (95,3%) z wysoką pozytywną wartością predykcyjną (95,1%) i negatywną wartością predykcyjną (95,5%) . Od 2011 roku z powodzeniem przeprowadzono siedem dodatkowych badań klinicznych (obejmujących łącznie ponad 160 pacjentów), które wykazały, że -UBI29-41-SPECT jest wysoce dokładnym i selektywnym narzędziem diagnostycznym dla infekcji kości w stopie cukrzycowej, protezach biodrowych lub innych infekcjach związanych z implantami; ponadto wykrywa również zapalenie kości i szpiku oraz infekcyjne zapalenie wsierdzia. Można stwierdzić, że to pole zastosowań dla obrazowania -UBI29-41 będzie stale rosło również dlatego, że badania z użyciem alternatywnych radioizotopów innych niż -UBI29-41 mogą przynieść w przyszłości nową grupę środków radiofarmaceutycznych do diagnostyki obrazowej z wykorzystaniem klinicznych badań PET/CT lub PET/MRI. Nowe radioizotopy, takie jak 68Ga, 82Rb lub 62Cu mogą być produkowane na żądanie z generatora radioizotopów bez potrzeby posiadania cyklotronu na miejscu i mogą służyć jako radionuklidy do PET. 68Ga wzbudził zainteresowanie jako emiter pozytonów do obrazowania molekularnego ze względu na pewne zalety, jakie oferuje jako znacznik. Jego radioaktywny okres półtrwania wynosi 67,71 minut, co czyni go kompatybilnym z biokinetyką większości radiofarmaceutyków o niskiej masie cząsteczkowej, takich jak peptydy, oligonukleotydy, aptamery lub fragmenty przeciwciał. Rozpad jądrowy izotopu następuje głównie poprzez emisję pozytonów (89%), o średniej energii pozytonów 740 keV. Dodatkowo, chemia koordynacyjna Ga3+ jest dobrze poznana, co jest pomocne w projektowaniu czynników chelatujących, które mogą być wykorzystane do połączenia tego radionuklidu z wektorem docelowym. Ostatnio UBI29-41 został sprzężony z makrocyklem 1,4,7-triazacyklonan-1,4,7-kwasem trioctowym (NOTA), a następnie znakowany 68Ga . Podejście to było początkowo stosowane z kwasem 1,4,7,10-tetraazacyklododekanowym-N′,N′′,N′′,N′′′′ ′-tetraoctowym (DOTA) w celu uzyskania pochodnych peptydowych, takich jak DOTA-TOC lub DOTA-TATE do wiązania z 68Ga, co następnie umożliwiło obrazowanie PET oparte na receptorach nowotworowych. W badaniu przedklinicznym z użyciem 68Ga-NOTAUBI29-41-PET wykazano, że koniugacja makrocykli nie wpływa na zdolność peptydu do selektywnego wiązania się z bakteriami in vivo. Poza UBI istnieją inne związki oceniane pod kątem obrazowania infekcji i stanów zapalnych, ale większość dostępnych peptydów przeciwdrobnoustrojowych pozostaje niedostatecznie zbadana pod kątem obrazowania infekcji. W 2000 roku ludzkie peptydy neutrofilowe (HNP1-3) były uważane, obok innych peptydów, za użyteczny środek do obrazowania infekcji, jako część mechanizmu obronnego w kulturach monocytów/lymphocytów HNPs odgrywają rolę chemotaktyczną jako cząsteczki pośredniczące. Ta niejednoznaczna rola może stanowić wadę przy opracowywaniu HNPs do obrazowania; stąd zastosowanie poszczególnych peptydów jako wektorów celujących może mieć pewne wtórne ograniczenia, pomimo ich korzystnych właściwości komórkowych. Ponieważ radiofarmaceutyki są w większości przypadków podawane we wstrzyknięciu i.v., peptydy mogą być podatne na degradację enzymatyczną lub destabilizację radioizotopu, jak opisano w przypadku 18F-UBI29-41 . Pochodzący z laktoferyny peptyd hLF(1-11) wykazał dużą wrażliwość jako czynnik infekcyjny skierowany na wielolekooporne szczepy Acinetobacter baumannii; jednak wiązanie z grzybem Candida albicans i wydalanie przez wątrobę czyniły go mniej korzystnym do obrazowania. Ponadto hLF wykazywał działanie immunoaktywujące lub bakteriobójcze w zależności od podanej dawki, czyli napotykał na mechanizm ujemnego sprzężenia zwrotnego poprzez modulację interleukiny-10. Inny przykład, AMP Latarcin-2a, ekstrahowany z jadu pająka środkowoazjatyckiego Lachesana tarabaevi, ma niepożądaną aktywność lityczną wobec bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych, erytrocytów i drożdży w stężeniach mikromolarnych, co czyni go mniej rozważanym do wykrywania bakterii za pomocą PET . Ponadto, większość bakterii jest w stanie produkować proteazy związane z powierzchnią i/lub wydzielane, co jest strategią obronną, która może degradować lub inaktywować AMP. W związku z tym, stosowanie związków pochodnych AMP jako środków obrazowania mogłoby skutkować diagnostyką fałszywie ujemną, w której uporczywa infekcja mogłaby być łatwo błędnie oceniona lub całkowicie pominięta. Poprzez zrozumienie tych specyficznych, wbudowanych w bakterie mechanizmów obronnych, można uniknąć stosowania wrażliwych struktur pochodnych AMP jako środków obrazowania infekcji. Należy również zauważyć, że z wyjątkiem kilku struktur, badania nie ujawniły specyficznego dla bakterii celu podobnego do receptora, który uzupełniałby potencjalne peptydy jako ligandy lub modulatory allosteryczne. Komórki nowotworowe, w przeciwieństwie do nich, wyrażają specyficzne receptory integrynowe, bombesynowe, somatostatynowe, ligandy lub antagonistów, które są ukierunkowane przez znaczniki SPECT lub PET. Co więcej, układ odpornościowy gospodarza, reagując na infekcje, posiada ścieżki patologiczne, które mogą być obrazowane przy użyciu PET. Aktywowane makrofagi mogą działać jako równoważny cel zależny od gospodarza, który może być wizualizowany przez 18F-FDG niespecyficznie, ale rzeczywiste obciążenie bakteryjne pozostaje ukryte. W przeciwieństwie do tego, peptydy pochodne AMP działają w mechanizmie niezależnym od gospodarza: radioznakowane peptydy wiążą się z wolnymi i przylegającymi do komórek, ale nie fagocytowanymi bakteriami, a zatem bakterie stają się niewidoczne dla -UBI29-41-SPECT po ich inkorporacji przez makrofagi. Zastosowanie tej metody potencjalnie pozwala na wczesne wykrycie infekcji przed wystąpieniem jakichkolwiek zmian morfologicznych w organizmie. Pozwala to również na odróżnienie infekcji od jałowego zapalenia, które może wydawać się powierzchownie podobne, ponieważ oba mogą występować jako zaczerwienione, obrzęknięte i niezwykle ciepłe obszary. Wynika to ze zwiększonego przepływu krwi, zwiększonej przepuszczalności naczyń krwionośnych i napływu białych krwinek, które są wspólne w obu sytuacjach. To ostatnie podejście podkreśliłoby podwójny schemat obrazowania znacznika w przyszłych badaniach klinicznych lub nawet podwójne podawanie znacznika (jeśli odpowiednie właściwości radioizotopu i właściwości farmakokinetyczne uzupełniają to podejście). Podsumowując, idealny znacznik do klinicznego obrazowania PET infekcji powinien spełniać kilka kryteriów. (1) powinien być odporny na znaczny rozkład we krwi i mieć rozsądny stopień lipofilności; (2) powinien gromadzić się i być zatrzymywany w miejscu zakażenia (najlepiej przez internalizację i późniejsze wzmocnienie), z minimalną akumulacją w miejscach niezakażonych; (3) powinien mieć szybkie usuwanie niespecyficznego wychwytu aktywności z otaczających regionów, aby uzyskać wysoki stosunek sygnału do szumu; oraz (4) powinien mieć minimalne skutki uboczne i powinien być łatwy do przygotowania, przy niskich kosztach. UBI29-41 udowodnił swoją przydatność w obrazowaniu zakażeń ogólnych, a inne odpowiednie radiofarmaceutyki oparte na AMPs niewątpliwie pojawią się w przyszłości.

Skróty

AMP:	Peptydy przeciwdrobnoustrojowe
B. subtilis:	Bacillus subtilis
C. albicans:	Candida albicans
CL:	Cardiolipina
CT:	Tomografia komputerowa
DNA:	Kwas dezoksyrybonukleinowy
E. coli:	Escherichia coli
FDG:	Fluorodeoksyglukoza
LPS:	Lipopolisacharyd
MRI:	Obrazowanie rezonansem magnetycznym
PC:	Fosfatydylocholina
PE:	Fosfatydyloetanoloamina
PET:	Pozytronowa tomografia emisyjna
PG:	Fosfatydylo-glicerol
PS:	Fosfatydyloseryna
S. aureus:	Staphylococcus aureus
SM:	Sfingomielina
SPECT:	Single photon emission computed tomography
ST:	Sterole
T/NT:	Stosunek substancji docelowych do niecelowych
TATE:	(Tyrosine3)octreotate
TOC:	(fenyloalanina1-Tyrozyna3)oktreotyd
UBI:	Ubiquicidin (fragment).

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Praca związana z tym przeglądem została sfinansowana i życzliwie wsparta przez National Research Foundation (NRF), Instytut Medycyny Komórkowej i Molekularnej oraz Nuclear Technologies in Medicine and the Biosciences Initiative (NTeMBI), krajową platformę technologiczną opracowaną i zarządzaną przez South African Nuclear Energy Corporation (Necsa) i finansowaną przez Departament Nauki i Technologii (DST).

.