PLOS ONE

Discussion

Większość leków chemioterapeutycznych jest specjalnie zaprojektowana do zakłócania syntezy DNA, metabolizmu komórkowego i podziału komórek. Ze względu na ten sposób działania, oczekuje się, że leki te będą powodować kilka rodzajów mutacji. Mutagenność leków chemioterapeutycznych w stosunku do prawidłowych komórek jest jednym z najpoważniejszych problemów w chemioterapii ze względu na możliwość indukowania wtórnych nowotworów złośliwych i nieprawidłowych wyników reprodukcyjnych, takich jak zespoły Downa, Klinefeltera i Turnera. Z tego względu konieczne jest określenie mutagennego działania leków chemioterapeutycznych na komórki prawidłowe. Test mikrojądrowy jest szeroko stosowany do pomiaru nienaprawionych uszkodzeń genomu, a zwiększona częstotliwość MN przewiduje ryzyko wystąpienia raka u ludzi. Ponieważ MN może wynikać z pęknięcia chromosomu (klastogenność) lub opóźnienia chromosomów (aneugeniczność), wykrywanie MN może być potencjalnie stosowane jako ekran dla indukcji liczbowych aberracji chromosomalnych, jeżeli analizy, które pozwalają na identyfikację całych chromosomów wewnątrz MN, takie jak analiza FISH, są włączone.

Klastogenna aktywność epirubicyny podczas mitozy in vivo została zgłoszona przez test MN szpiku kostnego. Obecnie pochodzenie MN indukowanego epirubicyną nie zostało jeszcze określone. Dlatego obecne badanie miało na celu zbadanie zdolności epirubicyny do wywoływania aneuploidii w komórkach somatycznych i germinalnych samców myszy. W celu określenia skuteczności metody, jako kontrolę pozytywną zastosowano dwa modelowe mutageny: kolchicynę i mitomycynę C, znane z działania odpowiednio aneugenicznego i klastogennego. Obserwowane wyniki MNPCE oraz rozkład sygnałów na MN w kontroli oraz dwóch pozytywnych mutagenach w obecnym badaniu dobrze odpowiadają opublikowanym danym . Dane te potwierdziły czułość zastosowanego protokołu eksperymentalnego w wykrywaniu efektów genotoksycznych.

Wyniki testu MN wykazały, że epirubicyna powoduje zależny od dawki wzrost tworzenia MN w szpiku kostnym myszy in vivo (ryc. 1) oraz wzrost centromerycznie ujemnych i centromerycznie dodatnich wybarwionych MN, wskazując na indukcję zarówno klastogenności, jak i aneugeniczności (ryc. 2). Zarówno klastogenny, jak i aneugeniczny potencjał epirubicyny w komórkach somatycznych może być przyczyną rozwoju wtórnych nowotworów. Wyniki dotyczące klastogenności potwierdzają wyniki wcześniejszych badań in vivo, w których po leczeniu epirubicyną obserwowano zwiększenie tworzenia MN i strukturalnych aberracji chromosomalnych w komórkach somatycznych myszy w podobnym zakresie dawek. Wyniki tych badań są również zgodne z wcześniej zgłoszoną indukcją mikrojądra przez epirubicynę w komórkach nowotworowych myszy in vitro, w erytrocytach inkubowanych jaj kurzych oraz w ludzkiej linii komórkowej limfoblastoidalnej TK6. Ponadto, indukcja strukturalnych i liczbowych aberracji chromosomalnych została również zgłoszona wcześniej u pacjentów z nowotworami otrzymujących chemioterapię zawierającą epirubicynę. Wcześniejsze badania wykazały również, że epirubicyna wywołuje strukturalne aberracje chromosomalne w hodowanych komórkach HeLa , zarówno strukturalne, jak i liczbowe aberracje chromosomalne oraz wymianę chromatyd siostrzanych w linii komórkowej chomika chińskiego , a także aberracje chromosomalne w hodowlach limfocytów krwi obwodowej od kobiet z rakiem piersi leczonych schematem zawierającym epirubicynę in vitro .

Badania u ludzi wykazały, że niektóre schematy chemioterapii zwiększają częstość aneuploidii w komórkach germinalnych, sugerując, że tacy pacjenci mogą być narażeni na większe ryzyko nieprawidłowych wyników reprodukcyjnych, szczególnie w wieku rozrodczym. Dlatego ogólną troską jest zmniejszenie ryzyka wytworzenia aneuploidii, wykrycie aneugenii komórek zarodkowych i zrozumienie mechanizmów przyczynowych. W obecnym badaniu aneuploidię w komórkach germinalnych określano za pomocą testu sperm-FISH z sondami DNA specyficznymi dla chromosomów 8, X i Y myszy, z których każdy znakowany był innym kolorem. Aby określić wiarygodność metod, kolchicyna, o której wiadomo, że jest przeważnie aneugeniczna, została użyta jako pozytywna substancja kontrolna, a wyniki kontroli pozytywnej i negatywnej były w tym samym zakresie, co wyniki wcześniejszych badań , -. Dane te potwierdziły czułość protokołu eksperymentalnego w wykrywaniu efektów aneuploidogennych badanych związków.

Epirubicyna jest najbardziej aktywna w fazach S i G2 cyklu komórkowego; jednak ma pewną wykrywalną aktywność we wszystkich fazach cyklu komórkowego . Często donoszono, że substancje chemiczne o właściwościach aneugenicznych mogą zmieniać postęp podziału komórkowego zarówno w komórkach mejotycznych, jak i mitotycznych. W obecnym badaniu oceniano czas rozwoju od podziałów mejotycznych w spermatocytach do plemników najądrza za pomocą testu inkorporacji BrdU. Wyniki jednoznacznie wskazują, że epirubicyna wydłużała czas trwania podziałów mejotycznych w spermatocytach myszy przez 48 h (ryc. 3). Obserwacje te potwierdzają zatem wcześniejsze ustalenia, że indukowane epirubicyną hamowanie funkcji topoizomerazy II w różnych fazach cyklu komórkowego spowalnia progresję cyklu komórkowego i powoduje zatrzymanie komórek w fazie G2/M . Takie zatrzymanie G2/M może być spowodowane indukcją mechanizmu punktu kontrolnego G2, który umożliwia naprawę uszkodzonego DNA przed przejściem komórek do następnej fazy cyklu komórkowego .

Informacje in vivo dotyczące wpływu epirubicyny na brak dysjunkcji podczas mejozy są ograniczone, ale niektóre inne antracykliny, takie jak doksorubicyna i jej pochodna idarubicyna, zapobiegają segregacji chromosomalnej i wywołują znaczny wzrost częstości plemników disomicznych i diploidalnych . Ponadto, badanie in vitro wykazało, że leczenie kultur chomika chińskiego epirubicyną wywołało aberracje liczbowe w postaci hipodiploidii i hiperdiploidii. Ponadto, cytometryczna i histologiczna analiza spermatogenezy myszy wykazała wzrost współczynnika zmienności histogramu DNA jako miary aneuploidii oraz wzrost diploidalnych plemników po leczeniu epirubicyną. W zgodzie z wyżej cytowanymi doniesieniami, obecny eksperyment wykazał, że ekspozycja na epirubicynę spowodowała znaczący, zależny od dawki wzrost częstotliwości plemników disomicznych i diploidalnych oraz że indukcja aneuploidii była liniowo zależna od dawki w zakresie od 0 do 12 mg/kg epirubicyny (ryc. 4). Te obserwacje in vivo są również zgodne z wcześniejszym raportem in vitro na ludzkich limfocytach hodowanych od zdrowych osób i pacjentów z rakiem, u których ekspozycja na doksorubicynę spowodowała wzrost trisomii chromosomów 7 i 17 . Ponadto Ganapathi i wsp. donieśli, że komórki ludzkiej białaczki HL-60, które noszą monosomię 8 jako jedyną zmianę kariotypową, nabyły markery 7q21 po ekspozycji na doksorubicynę. Dodatkowo, wyniki badań cytogenetycznych wykazały trisomię 8 u pacjentów, którzy otrzymali kursy chemioterapii systemowej z antracyklinami. Monosomia 7, 7q-, i niezrównoważona translokacja obejmująca chromosom 7 były obserwowane u pacjentów, którzy otrzymali chemioterapię zawierającą antracykliny. Ponadto strukturalne aberracje chromosomalne chromosomów 1, 9 i 16 były związane z lekami chemioterapeutycznymi zawierającymi antracyklinę .

Pośród innych klas inhibitorów topoizomerazy II, etopozyd był badany wcześniej w spermatocytach myszy , . Wyniki tych badań wskazują, że etopozyd działa jako czynnik genotoksyczny i indukuje aneuploidie w głównie mejotycznych komórkach zarodkowych po traktowaniu komórek pachytenu. Z drugiej strony, Kallio i Lähdetie stwierdzili, że wrażliwość na etopozyd u myszy była największa podczas diplotenu-diacynezy pierwotnych spermatocytów, zmniejszona podczas późnego pachytenu i niska podczas stadiów preleptotenowych; jest to zupełnie inny wzorzec niż w przypadku substancji chemicznych alkilujących DNA. Autorzy ci zasugerowali, że etopozyd powoduje niepowodzenie w rozwiązaniu zrekombinowanych ramion chromosomowych, prawdopodobnie związane z zatrzymaniem cyklu komórkowego i uruchomieniem szlaku apoptotycznego. W swoich szczegółowych badaniach cytogenetycznych Marchetti i wsp. stwierdzili, że pachyten jest najbardziej wrażliwym etapem spermatogenezy na indukcję strukturalnych aberracji chromosomowych i aneuploidii. Ponieważ dane Schmid i wsp. oraz Kallio i Lähdetie mogły wykazać, że etopozyd przedłużał mejotyczny cykl komórkowy, wydaje się możliwe, że efekty zaobserwowane w pierwszych podziałach rozszczepialnych przez Marchetti i wsp. w grupie krycia 24,5-dniowego mogły być w rzeczywistości indukowane na późniejszym etapie, tj. podczas diakinezy mejotycznej, MMI lub MMII zamiast pachytenu, jak sugerowali autorzy.

W obecnym badaniu zaplanowaliśmy badanie sperm-FISH w celu określenia, czy podostre leczenie niskimi dawkami inhibitora topoizomerazy II epirubicyny będzie miało efekt, ponieważ wcześniejsze etapy profazy zostaną włączone do leczenia epirubicyną. Pojedyncze dawki 0,25, 0,5 i 1 mg/kg epirubicyny wstrzykiwano przez 12 kolejnych dni, a próbki plemników pobierano 23 dni po ostatnim leczeniu epirubicyną. Łączna dawka 12 mg/kg epirubicyny zastosowana do całej profazy mejozy istotnie zwiększyła częstość plemników disomicznych i diploidalnych, podczas gdy łączna dawka 3 i 6 mg/kg doksorubicyny była ujemna (ryc. 5). Z kolei pojedyncza dawka 6 mg/kg epirubicyny zastosowana do spermatocytów podczas MMI/MMII dała wynik pozytywny (ryc. 4). Dane te sugerują, że wcześniejsze stadia profazy w stosunkowo mniejszym stopniu przyczyniają się do indukowanej epirubicyną aneuploidii w męskich komórkach rozrodczych.

W niniejszej pracy stwierdzono, że epirubicyna powodowała zauważalny wzrost liczby autodiploidalnych plemników (XX88 i YY88). Po leczeniu epirubicyną plemniki autodiploidalne powstałe w wyniku zatrzymania MMII występowały częściej niż plemniki diploidalne powstałe w wyniku zatrzymania podczas MMI (XY88). Tak więc drugi podział mejotyczny był bardziej wrażliwy na leczenie epirubicyną niż pierwszy podział mejotyczny. Wniosek, że drugie podziały mejotyczne były bardziej wrażliwe na leczenie epirubicyną niż pierwsze podziały mejotyczne jest również poparty obserwowanymi częstościami występowania dysomicznych chromosomów płciowych. Plemniki z sygnałami XX8 lub YY8 występowały częściej niż plemniki z sygnałami XY8. Obserwacje te potwierdzają, że test spermy-FISH dla dysomii lub diploidii jest w stanie wykryć efekty wywołane podczas obu podziałów mejotycznych i porównać czułość obu podziałów mejotycznych, jak wcześniej donoszono , .

W obecnym teście spermy FISH stwierdzono, że najniższa dawka pozytywna do wywołania dysomii lub diploidii plemników wynosiła 6 mg/kg epirubicyny. Jednakże badania MN szpiku kostnego myszy wykazały, że ekspozycja na epirubicynę w dawce 3 mg/kg spowodowała znaczny wzrost MNPCE. Obserwacja ta sugeruje, że MN w szpiku kostnym są indukowane przy niższych dawkach niż disomie lub diploidie w plemnikach. W związku z tym szpik kostny jest tkanką bardziej wrażliwą. Jednakże badania te mierzą różne punkty końcowe. Utrata i łamanie chromosomów jest mierzone w teście MN, a brak dysjunkcji jest wykrywany w teście spermy-FISH. Dlatego też obecne dane potwierdzają ogólny paradygmat oceny zagrożenia, który mówi, że pozytywny wynik badania MN szpiku kostnego jest wskaźnikiem potencjału genotoksycznego związku w komórkach zarodkowych. Jednakże kwantyfikacja aneuploidii w komórkach zarodkowych jest ważna dla celów oceny ryzyka.

Inhibitory topoizomerazy DNA mają wyraźną tendencję do powodowania dwuniciowych pęknięć DNA, które przede wszystkim prowadzą do powstawania centromerowo ujemnych MN . Podobnie wykazanie, że epirubicyna jest skutecznym inhibitorem topoizomerazy II sugeruje, że epirubicyna wywołuje swoje działanie klastogenne poprzez ten mechanizm. Metabolity epirubicyny mogą również aktywować komórki do zwiększenia wewnątrzkomórkowej produkcji reaktywnych form tlenu, których stabilne i dyfundujące formy mogą uszkadzać jądrowe DNA. Jeśli komórkowe mechanizmy naprawcze są przeciążone, pierwotne uszkodzenia DNA mogą prowadzić do strukturalnych lub liczbowych aberracji chromosomalnych i ostatecznie powodować nowotwory. Sugestię tę wspiera fakt, że osoby, u których rozwinął się drugi nowotwór złośliwy po leczeniu pierwszego nowotworu złośliwego, miały mniejszą zdolność do naprawy uszkodzeń podwójnej nici DNA niż osoby, u których nie rozwinął się drugi nowotwór złośliwy, mierzoną intensywnością γH2AX. Indukcja centromerowo-dodatnich MN przez epirubicynę wskazuje, że może istnieć inny mechanizm, poprzez który epirubicyna wywołuje swój genotoksyczny efekt. Obserwacja ta podkreśla znaczenie stosowania modyfikacji FISH testu MN w celu określenia pochodzenia indukowanych MN. Potencjalnym mechanizmem, za pomocą którego epirubicyna może wywierać swoje działanie aneugeniczne, jest hamowanie topoizomerazy II, co może prowadzić do błędnej segregacji chromosomów podczas podziału komórki. Dzieje się tak, ponieważ topoizomeraza II DNA jest niezbędna do prawidłowego rozdzielenia siostrzanych chromatyd podczas podziałów komórkowych, przy czym zarówno brak dysjunkcji, jak i pęknięcia występują w przypadku jej braku. Tak więc epirubicyna może być w stanie hamować dwie kluczowe role topoizomerazy II; jej zdolność do prawidłowej segregacji nowo replikowanych chromosomów, jak również jej funkcję w religacji przejściowych dwuniciowych przerw w DNA.

Podsumowując, poprzez zastosowanie testu FISH z sondą centromerowego DNA dla erytrocytów MN, wykazano, że epirubicyna jest nie tylko klastogenna, ale również aneugeniczna w komórkach somatycznych in vivo. Stosując metodę inkorporacji BrdU wykazano, że opóźnienie mejotyczne wywołane przez epirubicynę wynosi około 48 h. Za pomocą analizy sperm-FISH wykazano, że epirubicyna indukuje aneuploidie podczas mejozy, których efektem są plemniki dysomiczne, jak również całkowite zatrzymanie mejozy, w wyniku którego powstają plemniki diploidalne. Przewaga plemników autodiploidalnych (XX88, YY88) i disomicznych (XX8 lub YY8) wskazuje, że drugi podział mejotyczny jest bardziej wrażliwy na epirubicynę niż pierwszy podział mejotyczny. Wyniki sugeruj± również, że wcze¶niejsze stadia profazy w relatywnie mniejszym stopniu przyczyniaj± się do indukowanej epirubicyn± aneuploidii. Zarówno potencjał klastogenny, jak i aneugeniczny epirubicyny może być przyczyną rozwoju wtórnych nowotworów i nieprawidłowych wyników rozrodu u pacjentów z nowotworami oraz personelu medycznego narażonego na działanie leków zawierających epirubicynę. Chociaż epirubicyna ma mniejszą toksyczność ogólnoustrojową i kardiologiczną niż doksorubicyna i inne antracykliny o równoważnym spektrum działania przeciwnowotworowego, wykazuje ona działanie aneuploidogenne i cytotoksyczne w komórkach nienowotworowych. To działanie aneuploidogenne leku może być odpowiedzialne za pojawienie się nieprawidłowych wyników reprodukcyjnych i wtórnych nowotworów, które są zauważane u niektórych pacjentów z nowotworami w jakiś czas po skutecznym leczeniu ich pierwotnych nowotworów chemioterapią zawierającą epirubicynę.

.