Podwyższona fosfataza alkaliczna u pacjenta z nowotworem: Think You Know the Source?

Przedstawienie przypadku

45-letni mężczyzna z nawrotowym, przerzutowym mięsakiem Ewinga zgłosił się do Memorial Sloan Kettering Cancer Center w celu potencjalnego włączenia do badania klinicznego. Wstępne wyniki laboratoryjne wskazywały na podwyższony poziom fosfatazy alkalicznej i γ-glutamylotransferazy, ale poza tym były nieistotne, w tym prawidłowy poziom aminotransferazy asparaginianowej (AST) i transaminazy alaninowej (ALT). Podwyższone poziomy ALP i GGT sugerowały chorobę wątroby, chociaż pacjent nie miał wcześniej w wywiadzie nieprawidłowości dotyczących wątroby. Biorąc pod uwagę historię choroby kości u pacjenta z przerzutami, podejrzewano, że obserwowany wzrost ALP był spowodowany zwiększonym stężeniem izoenzymu ALP kości. Ważne było jednak udokumentowanie pochodzenia podwyższonego ALP, ponieważ pacjent miał zostać włączony do badania, które miało określić dawkowanie leku i działania niepożądane. Podwyższenie ALP w trakcie badania, które można przypisać izoenzymom specyficznym dla wątroby, zostałoby zgłoszone jako toksyczność ograniczająca dawkę i mogłoby opóźnić leczenie lub potencjalnie wykluczyć pacjenta z badania klinicznego. I odwrotnie, podwyższenie ALP pochodzące z kości i wtórne do choroby nie byłoby zgłaszane jako toksyczność.

Laboratorium zostało skonsultowane w sprawie możliwości przeprowadzenia badań w celu zidentyfikowania specyficznego izoenzymu(ów) odpowiedzialnego(ych) za podwyższone stężenie ALP u tego pacjenta. W tym celu wykonano chemiluminescencyjny test immunologiczny ALP specyficzny dla kości (Beckman Access Ostase). Wynik tego testu wyniósł 68,5 μg/L (przedział referencyjny: 0,0-20,1 μg/L), co oznacza znaczne podwyższenie kostnego ALP. Aby zbadać potencjalny udział innych izoenzymów ALP, wykonano elektroforezę w laboratorium referencyjnym. Metoda ta wykorzystuje elektroforezę do rozdzielenia izoenzymów ALP, a następnie densytometrię do oznaczenia ilościowego. Podobnie do wyników uzyskanych w MSKCC, całkowity poziom ALP u pacjenta był podwyższony i wynosił 524 U/L (przedział referencyjny: 45-115 U/L). Co ciekawe, kostny poziom ALP był nieprawidłowo niski i wynosił 7,8% (przedział referencyjny: 19,1-67,7%) całkowitego poziomu ALP, natomiast wątrobowy poziom ALP był podwyższony i stanowił 92,2% całkowitego poziomu ALP. Nie wykryto ani izoenzymów łożyskowych, ani jelitowych. W świetle tych wyników zespół opieki klinicznej rozpoczął badania w kierunku potencjalnych schorzeń wątrobowo-żółciowych, podczas gdy laboratorium dalej badało rozbieżne wyniki.

W laboratorium referencyjnym wykonano alternatywną metodę wykorzystującą połączenie aktywności enzymatycznej i inaktywacji cieplnej. Wyniki tego badania były również podwyższone zarówno dla izoenzymów wątrobowych (359 U/L; przedział referencyjny: 0-94 U/L), jak i kostnych (101 U/L; przedział referencyjny: 0-55 U/L). Wykonano badania obrazowe, które wykazały obecność hepatopatii zastoinowej wynikającej z zaburzeń perfuzji wtórnych do zatoru żylnego w wątrobie. Stan ten objawia się zwykle podwyższonym poziomem ALP i GGT przy prawidłowych poziomach AST i ALT. Badanie MRI potwierdziło progresję choroby w prawej kości ramiennej i nowe zmiany przerzutowe w trzonie kości łopatkowej. Badania obrazowe potwierdziły obecność dysfunkcji wątroby i postępującej choroby kości, co w obu przypadkach może skutkować podwyższonym poziomem ALP w wątrobie i ALP w kościach. Z powodu tych powikłań pacjentka została wykluczona z badania klinicznego.

Dyskusja

ALP jest enzymem hydrolazowym odpowiedzialnym za deposforylację wielu rodzajów cząsteczek, w tym białek i nukleotydów. Istnieją 4 podstawowe izoenzymy ALP, w tym kostny, wątrobowy, jelitowy i łożyskowy. Około 95% całkowitej aktywności ALP w ludzkiej surowicy pochodzi ze źródeł kostnych i wątrobowych, które występują w stosunku około 1:1 u zdrowych dorosłych (1). U dorosłych podwyższenie poziomu ALP może być obserwowane w wielu stanach chorobowych, w tym w ciąży, zastoinowej niewydolności serca, wrzodziejącym zapaleniu jelita grubego i infekcjach bakteryjnych. Podwyższony poziom ALP w wątrobie jest najczęściej obserwowany w schorzeniach wątrobowo-żółciowych, szczególnie w cholestazie, natomiast podwyższony poziom ALP w kościach jest spotykany w patologiach związanych ze zwiększoną aktywnością osteoblastów, takich jak choroba Pageta lub niektóre nowotwory, które wywodzą się z kości lub rozprzestrzeniły się na kości (2). Ponieważ ALP może pochodzić z kilku źródeł i może być zwiększony w wyniku różnych warunków, często konieczne jest badanie izoenzymów ALP w celu określenia pochodzenia.

Istnieją 3 podstawowe metody dostępne do oceny izoenzymów ALP. Elektroforeza jest 1 metodą, w której izoenzymy ALP są rozdzielane na podstawie różnic w ładunku. Jednakże, ponieważ ruchliwość izoenzymów wątrobowych i kostnych jest praktycznie taka sama, wymagany jest dodatkowy krok. Lektyna z kiełków pszenicy (wheat germ agglutin: WGA) jest dodawana w celu wykorzystania różnic w sialacji pomiędzy izoenzymami wątrobowymi i kostnymi. Izoenzym kostny jest zwykle bogaty w kwas sialowy i będzie reagował z WGA w żelu agarozowym i wytrąci się. Po oddzieleniu izoenzymy są odczytywane na densytometrze w celu kwantyfikacji i wyrażane jako procent całkowitej ALP (3). Druga metoda wykorzystuje różnice w stabilności cieplnej pomiędzy izoenzymami. W tej metodzie, całkowita aktywność ALP jest mierzona z próbki bezpośrednio i po podgrzaniu. ALP kości jest termolabilna; dlatego też pomiary dokonane po podgrzaniu nie będą wykazywały aktywności ALP kości. Wątrobowa ALP jest stabilna termicznie i będzie aktywna w obu pomiarach. Kostna ALP może być wtedy oznaczona przez odjęcie tych dwóch pomiarów (4). Trzecią metodą jest test immunologiczny stosowany wyłącznie do ilościowego oznaczania poziomu ALP kości (5). Istnieje kilka komercyjnie dostępnych zestawów do oznaczania immunologicznego kostnego ALP, jednak w tym badaniu wykorzystano test Ostase firmy Beckman Access. Metoda ta jest jednoetapowym testem immunoenzymatycznym. W skrócie, mysie przeciwciało monoklonalne specyficzne dla kostnego ALP jest dodawane do cząstek paramagnetycznych pokrytych kozim poliklonalnym przeciwciałem anty-mysim. Surowica pacjenta jest następnie dodawana do opłaszczonych cząstek, a obecne w niej kostne ALP zwiąże się z przeciwciałem monoklonalnym przeciwko kostnemu ALP. Dodawany jest substrat chemiluminescencyjny, a światło generowane przez reakcję jest wprost proporcjonalne do stężenia kostnej ALP w próbce.

W tym przypadku, biorąc pod uwagę historię mięsaka Ewinga u pacjenta i brak objawów lub historii dysfunkcji wątroby, najpierw zbadano podwyższenie poziomu kostnej ALP. ALP kostna była podwyższona; jednakże, z powodu różnicy w jednostkach pomiędzy testem immunologicznym do oznaczania ALP kostnej a testem enzymatycznym do oznaczania ALP całkowitej (test immunologiczny mierzący ilość w mikrogramach na litr vs test enzymatyczny mierzący aktywność w jednostkach na litr), wyniki nie mogą być używane zamiennie i muszą być odpowiednio interpretowane. Obserwowany wzrost kostnej ALP dostarczył dowodów na to, że całkowity wzrost ALP był przynajmniej częściowo pochodzenia kostnego, ale nie było możliwe ostateczne zidentyfikowanie kostnej ALP jako jedynego czynnika przyczyniającego się do tego wzrostu. Kolejne badania z zastosowaniem elektroforezy i stabilizacji termicznej w celu zidentyfikowania podwyższenia poziomu innych izoenzymów ALP ujawniły podwyższenie poziomu ALP w wątrobie, ale wykazały również rozbieżność w poziomie ALP kostnej. Badania obrazowe ujawniły patologię leżącą u podstaw zarówno podwyższonego poziomu izoenzymów wątrobowych, jak i kostnych. W związku z tym stwierdzono, że rozbieżne wyniki były wynikiem obniżonego kostnego ALP oznaczonego metodą elektroforezy.

Zdolność metody elektroforetycznej do odróżniania kostnej ALP od ALP wątrobowej opiera się na założeniu, że kostna ALP obecna w surowicy jest bogata w kwas sialowy. W surowicy występują 3 podstawowe izoformy kostnej ALP, mianowicie B1, B2 i B/I (6). Co ciekawe, wykazano, że izoformy te różnią się liczbą obecnych w nich reszt kwasu sialowego. W poprzednim badaniu oszacowano liczbę reszt kwasu sialowego na 29 i 45 odpowiednio dla każdego homodimeru B1 i B2. B/I składa się w 70% z izoenzymu kostnego i w 30% z izoenzymu jelitowego i ma bardzo mało reszt kwasu sialowego (7). Różne izoformy wytrącają się w różnym stopniu w obecności WGA w oparciu o liczbę obecnych reszt kwasu sialowego, przy czym B2 wykazuje najwyższy poziom wytrącania, a następnie B1 i B/I. Podobnie, badanie przeprowadzone przez Farley i wsp. wykazało, że inaktywacja termiczna i test immunologiczny były lepsze niż test strąceniowy WGA do wykrywania kostnej ALP w surowicy osób z osteoporozą pomenopauzalną (8). Jest prawdopodobne, że izoforma obecna u tego pacjenta miała mniej reszt kwasu sialowego, co mogło tłumaczyć rozbieżny wynik prawidłowej kostnej ALP przy użyciu metody elektroforetycznej. Interesujące jest to, że 3 izoformy ALP wykazywały podobną kinetykę inaktywacji cieplnej (7).

W tym przypadku, 3 różne metody zostały użyte do określenia źródła zwiększonej ALP u pacjenta z przerzutową chorobą kości i bez historii dysfunkcji wątroby. Prawidłowa interpretacja początkowego wyniku ALP w kości metodą immunologiczną odegrała kluczową rolę w późniejszym rozpoznaniu i leczeniu wcześniej nierozpoznanego schorzenia wątroby. Badanie to podkreśla znaczenie zrozumienia specyficznej metodologii i ograniczeń stojących za różnymi metodami oznaczania ALP.

2 Niestandardowe skróty

• ALP

  fosfataza alkaliczna

• AST

  .

  aminotransferaza asparaginianowa

• ALT

  transaminaza alaninowa

• GGT

  γ-glutamylotransferaza

• WGA

  aglutynina z kiełków pszenicy.