Przeciwciała przeciwplemnikowe: Antisperm antibodies and infertility: an unsolvable question?

Once again the detection and clinical significance of antisperm antibodies (ASA) is being discussed (Helmerhorst et al., 1999). Chociaż ostrożnie stwierdza się, że „istnieją powody, aby zaakceptować odporność przeciwplemnikową jako przyczynę subpłodności”, autorzy wymieniają trzy powody, dla których klinicyści nie są skłonni do wykonywania testów na obecność ASA u subpłodnych par: (i) brak standaryzowanego i powszechnie akceptowanego testu na obecność ASA; (ii) brak konsensusu co do klinicznych konsekwencji ASA; oraz (iii) brak dowodów na mechanistyczne wyjaśnienie, w jaki sposób ASA upośledza poczęcie. Te trzy twierdzenia zasługują na komentarz.

Dyskusja Helmerhorsta et al. (1999) opiera się ściśle na nowoczesnych koncepcjach immunologicznych, prowadząc do zalecenia immunoblottingu i chromatografii powinowactwa jako obiecujących w tej dziedzinie. Dla tych, którzy zajmują się tą dziedziną od wielu lat, zalecenia te mogą wywołać uczucie deja vu. Była to powszechna strategia ~20 lat temu i od tego czasu przeprowadzono wiele badań przy użyciu enzymatycznych testów immunosorbcyjnych (ELISA), z użyciem plemników lub frakcji antygenowych, a także metodą immunoblottingu (Lehmann i in., 1985; Mettler i in., 1985). Jednakże wyniki były ogólnie rozczarowujące; nie osiągnięto jasności, na którą liczono. Nie ma dobrego wytłumaczenia tego braku sukcesu, ale jednym z aspektów problemu może być to, że konwencjonalne myślenie immunologiczne nie wystarcza, by osiągnąć postęp w immunologii reprodukcyjnej. Należy również wziąć pod uwagę fizjologię reprodukcji. Spojrzenie na możliwe efekty in-vivo ASA może to zilustrować.

Mechanistyczne wyjaśnienia dla upośledzenia poczęcia przez ASA?

Twierdzenie Helmerhorsta et al. o „braku dowodów na mechanistyczne wyjaśnienie, jak ASA upośledza poczęcie” jest raczej zaskakujące, szczególnie w holenderskiej pracy, nawet w pracy z Groningen. To właśnie w Groningen wybitna grupa, kierowana przez Jana Kremera, wykazała, że migracja plemników z ASA klasy immunoglobulin (Ig) A na ich powierzchni przez śluz szyjkowy była silnie upośledzona, najwyraźniej dlatego, że część Fc cząsteczki IgA (ale nie cząsteczki IgG) wiąże się skutecznie z micelami śluzu szyjkowego (Jager i in., 1980). W teście kontaktu plemników ze śluzem szyjkowym, odsetek plemników pokrytych przeciwciałami IgA był proporcjonalny do odsetka plemników ujawniających tak zwane zjawisko „wstrząsania”, tj. silne ruchy ogona bez postępu do przodu w śluzie szyjkowym. Dalsze dowody na znaczenie IgA znaleziono, gdy wykazano, że leczenie plemników pokrytych IgA proteazą IgA1 poprawiło migrację plemników przez śluz szyjkowy (Bronson i in., 1987).

Oznacza to, że przeciwciała IgA przeciwko jakiemukolwiek antygenowi wyrażonemu na błonie plemnika będą upośledzać penetrację i że w tej sytuacji klasa immunoglobulinowa ASA staje się ważniejsza niż swoistość antygenowa. Jest to sprzeczne z konwencjonalnymi reakcjami immunologicznymi, co może być powodem, dla którego zjawisko wstrząsania jest często pomijane w dyskusjach immunologicznych. Jest to jednak najwyraźniej bardzo efektywny mechanizm; w eksperymentach nad migracją plemników pokrytych IgA do śluzu szyjkowego w kapilarach, plemniki od pacjentów z silną odpowiedzią immunologiczną często sięgały zaledwie kilku mm w głąb śluzu. Wiązanie fragmentu Fc IgA ze śluzem szyjkowym należy rozpatrywać w perspektywie ewolucyjnej. Ponieważ śluz szyjkowy stanowi jedyną barierę między środowiskiem a żeńskimi narządami płciowymi i jamą otrzewnową, w śluzie muszą istnieć mechanizmy obronne zapobiegające przedostawaniu się drobnoustrojów do narządów płciowych. Przeciwciała IgA przeciwko mikroorganizmom pełnią tę funkcję poprzez wychwytywanie mikroorganizmów. W rzadkich przypadkach, gdy kobieta wytworzyła przeciwciała IgA przeciwko plemnikom lub, co częstsze, gdy plemniki dostające się do śluzu są już pokryte IgA, wynik będzie taki sam: uwięzienie plemników lub upośledzenie ich migracji.

Bardziej konwencjonalny mechanizm immunologiczny, poprzez który ASA może zmniejszyć płodność, polegałby na wiązaniu się z receptorem, za pomocą którego plemniki przyczepiają się do komórki jajowej, blokując w ten sposób interakcję plemnik-jajko. W tej sytuacji, specyficzność antygenowa ASA będzie miała kluczowe znaczenie, a ponieważ w błonie plemnika znajduje się więcej niż jeden autoantygen, nie wszystkie ASA mogą mieć taki efekt. W ciągu ostatnich dwóch dekad zjawisko to było szeroko badane w związku z zapłodnieniem in-vitro (IVF) z użyciem plemników od mężczyzn z ASA. W prawie wszystkich badaniach obserwowano znaczące obniżenie odsetka zapłodnionych jajeczek. Jedno z wczesnych badań wskazywało również, że efekt blokujący był spowodowany głównie przez przeciwciała IgA (Clarke et al., 1985), ale nie zauważono tego w kolejnych badaniach, a eksperymenty absorpcyjne wykazały, że efekt hamujący może być również spowodowany przez przeciwciała IgG (Bronson et al., 1982). Ostatnie badania nad wiązaniem plemników do zony pellucida (Francavilla i in., 1997) są szczególnie ilustracyjne. W każdym eksperymencie dodawano równe liczby plemników od osoby płodnej i od pacjenta z silną reaktywnością w teście immunobead, tak aby dwa rodzaje plemników, znakowane różnymi fluorochromami, mogły konkurować o wiązanie do zona pellucida. W porównaniu z plemnikami od płodnych mężczyzn, plemniki od pacjentów z normalnymi próbkami nasienia (poza obecnością ASA) były hamowane w ~50% przypadków, wzmocnione w kilku przypadkach i niezmienione w pozostałych, co pasuje do koncepcji, że specyficzność przeciwciał musi odgrywać rolę. Jednakże, pomimo silnej odpowiedzi immunologicznej pacjentów z wysokim mianem krążącego ASA, a w większości przypadków zarówno IgG jak i IgA, na prawie wszystkich plemnikach, inhibicja nigdy nie była całkowita, ale niektóre z plemników pokrytych przeciwciałami były związane z zoną pellucida. Jest to zgodne z doświadczeniem z wielu innych badań IVF, że nawet jeśli odsetek zapłodnionych jaj może być zmniejszony przez obecność ASA, niektóre jaja zwykle będą zapłodnione.

Wniosek z tej dyskusji na temat możliwych skutków ASA zmniejszających płodność jest taki, że upośledzenie migracji plemników przez śluz szyjkowy przez przeciwciała IgA jest bardzo skutecznym mechanizmem, podczas gdy blokowanie interakcji plemnik-jajko (spowodowane zarówno przez IgG jak i IgA ASA) wydaje się być mniej skuteczne, prawdopodobnie rzadko zapobiegając, ale może opóźniając poczęcie. Doświadczenia kliniczne potwierdzają te wnioski. W klinikach leczenia niepłodności, mężczyźni z ASA rzadko mają izolowaną odpowiedź IgG, ale zwykle prezentują mieszaninę przeciwciał IgG i IgA. Z drugiej strony, w badaniach płodności mężczyzn poddanych wazektomii, a następnie wazowasostomii, odpowiedzi immunologiczne ograniczone do klasy IgG nie były rzadkie, ale mężczyźni ci wydawali się mieć normalną płodność, podczas gdy wskaźnik płodności był odwrotnie skorelowany z odpowiedzią IgA (Meinertz i in., 1990). Dlatego wydaje się, że „brak dowodów na wyjaśnienie mechanistyczne” nie powinien powstrzymywać klinicysty przed badaniem pacjentów (przynajmniej mężczyzn) z problemami płodności na obecność ASA.

Brak znormalizowanego i powszechnie akceptowanego testu na obecność ASA?

Chociaż nie można podawać żadnych argumentów przeciwko temu stwierdzeniu Helmerhorsta i wsp. (1999), powstaje pytanie, czy jest to sprawiedliwy i konieczny wymóg, aby test był używany? Jeśli tak, to szerokie spektrum badań laboratoryjnych może zostać drastycznie ograniczone. Zasadniczym pytaniem wydaje się być to, czy niektóre testy na ASA dają klinicznie istotne wyniki.

Przez wiele lat powszechne były testy aglutynacji plemników (makroskopowa aglutynacja żelatynowa lub mikroskopowa aglutynacja kuwetowa) (Rose et al., 1976). Ostatnio testy te zostały zdyskredytowane i często opisywane są jako niewiarygodne, szczególnie w związku z opisem nowych technik. Prawdą jest, że żadna z nich nie jest idealna, obie wymagają świeżych próbek nasienia o optymalnej jakości. W teście aglutynacji żelatynowej używa się dużych objętości nasienia, a w teście aglutynacji kuwetowej potrzebne jest doświadczenie i ostrożność w odczytywaniu wyników, aby odróżnić prawdziwe aglutynaty od niespecyficznych zbitek. Niemniej jednak, testy te dały klinicznie istotne wyniki u mężczyzn. Kilka badań wykazało, że wysokie miana w surowicy lub wolne przeciwciała w osoczu nasienia występują bardzo rzadko, z wyjątkiem pacjentów z problemami z płodnością (u ~10% mężczyzn z par o niewyjaśnionej płodności) (np. Bronson i in., 1985) oraz wśród normospermicznych mężczyzn w badaniu uzupełniającym (Rümke i in…, 1974), wzrastające miana w surowicy w aglutynacji żelatynowej były skorelowane z obniżającą się płodnością (np. tylko 12,5% z 64 mężczyzn z mianami od 128-512 i żaden z 11 z mianami ≥1024 nie wywołał poczęcia w okresie obserwacji 2-16 lat). Ponieważ ASA wykrywane w surowicy należą głównie do klasy IgG, może wydawać się dziwne, że miano w surowicy wiąże się z subpłodnością, skoro za efekt antypłodnościowy ASA odpowiadają głównie przeciwciała IgA w nasieniu. Wyjaśnienie jest takie, że przeciwciała IgA bardzo rzadko występują bez przeciwciał IgG, a wysokie stężenia IgA występują głównie u pacjentów, którzy mają również wysokie stężenia IgG.

Równie ważną obserwacją w tych badaniach było to, że niskie stężenia przeciwciał (miana 4-16) były równie powszechne wśród płodnych kontroli i niepłodnych pacjentów, co wskazuje, że tak niskie wartości najwyraźniej nie wpływały w żaden znaczący sposób na płodność.

W ostatnim czasie najbardziej popularny stał się test immunobead pośredni (Bronson i in., 1982). Świeże plemniki, pobrane techniką swim-up, inkubuje się z surowicą lub plazmą nasienia, następnie starannie przemywa i dodaje immunobeads pokryte anty-IgG lub anty-IgA (lub anty-IgM). Pod mikroskopem, immunobeads są widoczne jako przylegające do ruchliwych plemników, jeśli próbka zawiera ASA odpowiedniej klasy immunoglobulin. Użycie anty-immunoglobuliny gwarantuje specyficzność reakcji; jest to bardzo czuły test, określa klasę immunoglobulinową ASA i wymaga tylko niewielkiej ilości plemników, co czyni go, jak się wydaje, idealnym testem. Niemniej jednak, istnieje pewien problem. W celu zachowania jego praktyczności, jest on zwykle przeprowadzany tylko z jednym rozcieńczeniem surowicy, zwykle niskim rozcieńczeniem (najczęściej 1:4). W takich przypadkach, pośredni test immunobead działa jako bardzo czuły test przesiewowy, tak że nawet niskie poziomy przeciwciał bez znaczenia dla płodności (co prawdopodobnie stanowi większą część reakcji pozytywnych) mogą wywoływać silne reaktywności, przynajmniej dla IgG (np. patrz Bronson et al., 1985). Może to wyjaśniać, dlaczego kilku badaczy zakwestionowało wartość testowania na ASA i znaczenie ASA jako przyczyny niepłodności. Gdyby test był przeprowadzany z większymi rozcieńczeniami surowicy (np. 1:50 i 1:250), mógłby dostarczyć lepszych wskazówek klinicznych.

Najbardziej racjonalnym sposobem badania ASA u mężczyzn jest oczywiście oznaczanie immunoglubulin (IgG i IgA) na powierzchni plemników pacjentów za pomocą bezpośredniego mieszanego odczynu aglutynacji (MAR) lub testów immunobead. Oba testy są szybkie, łatwe i czułe, ale wymagają ruchliwych plemników, aby zapewnić przyleganie erytrocytów lub immunobeads do błony plemnika. Są one doskonałymi testami przesiewowymi; jeśli reakcja jest negatywna lub słabo pozytywna (≤50% ruchliwych plemników przenoszących immunoglobuliny), pacjent nie może mieć problemu niepłodności spowodowanego ASA i nie ma potrzeby wykonywania dalszych testów immunologicznych. Z drugiej strony, jeśli wszystkie lub większość plemników posiada immunoglobuliny na swojej błonie, konsekwencje dla płodności są trudniejsze do oceny, przede wszystkim dlatego, że te czułe testy nie są w stanie odróżnić plemników z niewielką ilością immunoglobulin od plemników, które są w pełni nasycone przeciwciałami na wszystkich dostępnych cząsteczkach antygenów. Zarówno dla wywołanego przez IgA upośledzenia migracji plemników przez śluz szyjkowy, jak i dla ewentualnego zablokowania interakcji plemnik-jajnik, należy przyjąć, że liczba cząsteczek przeciwciał odgrywa pewną rolę. W tej sytuacji przydatne może być oznaczanie ASA w surowicy i osoczu nasienia. Przy wysokim mianie w surowicy lub nadmiarze wolnego ASA w osoczu nasienia wydaje się prawdopodobne, że ilość ASA na plemnikach również będzie wysoka.

To, że te teoretyczne rozważania zgadzają się z rzeczywistością kliniczną, zostało zilustrowane w najbardziej wyraźny sposób w naszym badaniu uzupełniającym na mężczyznach poddanych wazowasostomii, wspomnianym powyżej (Meinertz i wsp., 1990).

W okresie obserwacji (22-111 miesięcy, mediana 44 miesiące), 10 z 15 mężczyzn (66,7%) z ujemnym bezpośrednim MAR (≤10% ruchliwych plemników z przylegającymi erytrocytami) wywołało zapłodnienie, ale tak samo 42 z 79 mężczyzn (53,2%) z dodatnim MAR (dokładny test Fishera z dwoma ogonami: P = 0,4995). Tak więc, sam dodatni MAR (>10% dla IgG lub IgA) nie dawał informacji o stanie płodności. Większość mężczyzn z ASA miała zarówno IgG jak i IgA na swoich plemnikach, ale niektórzy mieli tylko IgG. Czyste reakcje IgA nie były rejestrowane. Patrząc na mężczyzn z reakcjami immunologicznymi ograniczonymi do klasy IgG, wskaźnik poczęć dla całej grupy wynosił 85,7% (18/21), a dla tych z IgG na wszystkich plemnikach był równie wysoki (11/13 = 84,6%). Tak więc nie można było odnotować żadnego efektu anty-płodności dla IgG; w rzeczywistości wskaźnik poczęć był wyjątkowo wysoki, nawet wyższy niż u pacjentów bez ASA (chociaż różnica nie była statystycznie istotna). Z drugiej strony, mężczyźni z reaktywnością zarówno IgG jak i IgA wykazywali malejącą płodność wraz ze wzrostem reaktywności IgA. Dla całej grupy wskaźnik poczęć wynosił 42,9% (24/56), a dla tych z IgA na wszystkich plemnikach 21,7% (5 z 23). W porównaniu z grupami z reaktywnością tylko IgG, różnice były wysoce znaczące. W próbie identyfikacji mężczyzn o szczególnie silnej odpowiedzi immunologicznej okazało się, że żaden z 10 mężczyzn ze 100% reaktywnością IgA w MAR i krążącymi aglutyninami plemników w mianie 256 lub większym nie wywołał ciąży, a tylko jeden z 13 mężczyzn ze 100% IgA MAR i wolnymi aglutyninami plemników w osoczu nasienia odniósł sukces.

Chociaż obecnie nie ma jednego badania, które pozwoliłoby w sposób jednoznaczny ocenić stan płodności indywidualnego pacjenta w odniesieniu do subpłodności lub niepłodności immunologicznej, to wydaje się uzasadnione stwierdzenie, że przy odpowiedniej kombinacji badań (np. MAR lub testy immunobead w połączeniu z aglutyninami plemnikowymi w surowicy lub osoczu nasienia) możemy dość zbliżyć się do tego celu. Ostatnie badanie dotyczące diagnostyki i postępowania w przypadku ASA, przeprowadzone przez ośrodki medycyny reprodukcyjnej w Wielkiej Brytanii (Krapez et al., 1998), wykazało, że zdecydowana większość ośrodków rzeczywiście stosuje tę strategię. I tak, 44 z 48 ośrodków badało plemniki na obecność ASA za pomocą bezpośrednich testów MAR (28 laboratoriów) lub testów immunobead (19 laboratoriów). W niektórych przypadkach badano również osocze nasienia, a 17 laboratoriów badało surowicę od partnerów płci męskiej różnymi testami, głównie testem aglutynacji kuwetowej. Oznacza to, że prawie wszystkie ośrodki w prosty sposób zidentyfikowały mężczyzn, którzy mogą mieć immunologiczną przyczynę swojej niepłodności. Chociaż jest to najlepsze, co można obecnie zrobić, nie jest to optymalne. Potrzebna jest technika, która w bardziej precyzyjny sposób pozwoli zidentyfikować mężczyzn, którzy mają problem imunologiczny. Obecnie cytometria przepływowa wydaje się obiecującą techniką, która może być w stanie określić dokładną ilość IgG i IgA na poszczególnych plemnikach (Räsanen et al., 1992; Ke et al., 1995).

Brak konsensusu w sprawie klinicznych konsekwencji ASA?

Na pierwszy rzut oka to twierdzenie Helmerhorsta et al. może wydawać się słuszne, ale pytanie brzmi, czy można porównywać badania z użyciem wielu różnych technik i kryteriów? Lata temu powszechnie uważano, że ASA może powodować niepłodność, ale obecnie obraz wydaje się znacznie mniej jasny. Może być kilka powodów tej zmiany poglądu.

Po pierwsze, dowiedzieliśmy się, że nawet przy najwyższych poziomach ASA (szczególnie IgA) trudno wykluczyć poczęcie. Dlatego pytanie brzmi raczej, w jakim stopniu ASA może powodować subpłodność. Badania nad męską niepłodnością, omówione w tym przeglądzie, opierały się głównie na różnych konwencjonalnych (niektórzy mogą powiedzieć, że staromodnych) technikach. Jednakże, nawet jeśli konsensus może być zbyt mocnym słowem, wyniki takich badań są generalnie zgodne, wskazując, że niskie poziomy ASA szkodzą w niewielkim stopniu, nieco wyższe wartości (szczególnie IgA) powodują subpłodność wzrastającą do czegoś bliskiego niepłodności dla bardzo wysokich poziomów ASA; wniosek, który oczywiście stanowi poważną przeszkodę dla prób wyprodukowania szczepionki przeciw niepłodności, opartej na antygenach spermy!

Po drugie, kiedy wprowadzane są nowe testy na ASA, powinny być one porównywane z testami konwencjonalnymi, a jeśli nie określają one tego samego rodzaju ASA, należy o tym pamiętać. Kiedy 15 lat temu przeprowadzono wieloośrodkowe badania Światowej Organizacji Zdrowia (WHO) nad przeciwciałami przeciwko antygenom rozrodczym, okazało się, że kilka technik, w tym większość testów ELISA, technik immunoblottingu, biernej hemaglutynacji i testów cytotoksyczności, nie wykrywało ASA rejestrowanych w technikach konwencjonalnych. Co więcej, wyniki miały zwykle niewielkie znaczenie kliniczne, nie wykazując istotnych różnic pomiędzy grupami płodnymi i niepłodnymi (Hjort i in., 1985). Niestety, często zapomina się o tym w dyskusjach na temat ASA.

Po trzecie, w badaniach należy uwzględnić aspekt ilościowy i klasę immunoglubulinową przeciwciał. Tak więc, wszyscy pacjenci z reaktywnością w bezpośrednim teście MAR lub immunobead nie powinni być traktowani jako jedna grupa, ale ci ze słabą reaktywnością (prawdopodobnie płodni) powinni być odróżnieni od tych z przeciwciałami na prawie wszystkich plemnikach (prawdopodobnie niepłodni), i podobnie ci z przeciwciałami tylko IgG (prawdopodobnie płodni) nie powinni być mieszani z tymi z silną reaktywnością zarówno dla IgG jak i IgA (prawdopodobnie niepłodni lub niepłodni).

Ostatnie badanie ośrodków medycyny reprodukcyjnej w Wielkiej Brytanii (Krapez i in., 1998) wykazało, że zazwyczaj nie dokonuje się rozróżnienia pomiędzy IgG i IgA ASA. Wynika to prawdopodobnie z faktu, że większość niepłodnych mężczyzn z ASA będzie miała mieszankę tych dwóch klas immunoglobulin na swoich plemnikach. Jednak próby leczenia pacjentów są zgodne z wnioskami wyciągniętymi z badań laboratoryjnych i „eksperymentów klinicznych” (badania na mężczyznach poddanych wazowasostomii). I tak, w większości ośrodków stosuje się inseminację domaciczną w celu przezwyciężenia wywołanego przez IgA upośledzenia penetracji plemników przez śluz szyjkowy. U pacjentów z silną odpornością na plemniki (>50% reaktywności w teście MAR lub immunobead) stosowano albo IVF, albo wewnątrzcytoplazmatyczną iniekcję plemników (ICSI), ale na ogół z liberalnymi wskazaniami w porównaniu z wnioskami wyciągniętymi powyżej. Wynika to oczywiście z faktu, że ASA często nie są jedyną przyczyną niepłodności u tych pacjentów, ale rolę może odgrywać również niska liczba plemników, słaba ruchliwość lub problemy u partnerki. Tak więc, anty-płodnościowe efekty ASA są trudne do przeanalizowania w grupach niepłodnych pacjentów.

Wazektomizowani, a następnie wazowasostomizowani mężczyźni wydają się oferować znacznie lepszą grupę; w rzeczywistości jest to grupa bardzo podobna do zwierząt doświadczalnych. Oboje partnerzy mają zwykle wcześniej potwierdzoną płodność, co pozwala na wykluczenie genetycznych czynników niepłodności. Można wybrać grupę mężczyzn, którzy byli poddawani wazektomii przez określony czas i którzy mieli udaną wazowasostomię z akceptowalną liczbą plemników wykazujących dobrą ruchliwość w próbce nasienia. Jeśli więc oboje partnerzy są zdrowi od ostatniego poczęcia, czynniki niepłodności inne niż ewentualnie ASA są znacznie mniej prawdopodobne niż w grupie pacjentów niepłodnych. Dużą zaletą w grupie pacjentów po wazowasostomii jest to, że ich status płodności nie jest znany od początku, a zatem automatycznie włączana jest grupa kontrolna; tzn. niektórzy nie mają ASA, niektórzy mają tylko IgG, a niektórzy mają zarówno IgG jak i IgA. Wydaje się, że jest to idealna grupa do badania skutków ASA i do oceny nowych technik, i zaskakujące jest to, że była ona tak rzadko wykorzystywana. Kluczowym pytaniem w związku z tym jest oczywiście to, czy mężczyźni poddani wazektomii wytwarzają przeciwciała na wszystkie te same antygeny, przeciwko którym mogą reagować niepłodni mężczyźni. Konieczne są dalsze badania, ale jak dotąd nie mamy dowodów na to, że tak nie powinno być.

Prowadzi to do wniosku, że immunologia nasienia może dostarczyć klinicystom użytecznych informacji. Być może obecnie nie jest to już tak istotne, gdy czynnik immunologiczny wraz z wieloma innymi czynnikami niepłodności może być przezwyciężony przez techniki wspomaganego rozrodu. Jednak nadal dobrą zasadą jest osiągnięcie jak najdokładniejszej diagnozy przed rozpoczęciem leczenia.

.