Sekwencjonowanie bisulfitowe

Sekwencjonowanie bisulfitowe stosuje rutynowe metody sekwencjonowania na genomowym DNA poddanym działaniu bisulfitu w celu określenia statusu metylacji na dinukleotydach CpG. Inne strategie niesekwencjonowania są również stosowane do badania metylacji w specyficznych loci lub na poziomie całego genomu. Wszystkie strategie zakładają, że indukowana bisulfitem konwersja niezmetylowanych cytozyn do uracylu jest kompletna, co służy za podstawę wszystkich kolejnych technik. Idealnie byłoby, gdyby zastosowana metoda określała status metylacji oddzielnie dla każdego allelu. Metody alternatywne do sekwencjonowania bisulfitowego obejmują Combined Bisulphite Restriction Analysis i metylowaną immunoprecypitację DNA (MeDIP).

Metodologie analizy DNA poddanego działaniu bisulfitu są stale rozwijane. Aby podsumować te szybko rozwijające się metodologie, napisano wiele artykułów przeglądowych.

Metodologie można ogólnie podzielić na strategie oparte na PCR specyficznym dla metylacji (MSP) (Rysunek 4) oraz strategie wykorzystujące łańcuchową reakcję polimerazy (PCR) wykonywaną w warunkach niespecyficznych dla metylacji (Rysunek 3). Metody oparte na mikromacierzach wykorzystują również PCR oparte na warunkach niespecyficznych dla metylacji.

Metody oparte na PCR niespecyficznym dla metylacjiEdit

Rysunek 3: Metody analizy metylacji DNA nieoparte na PCR specyficznym dla metylacji. Po konwersji bisulfitowej genomowy DNA jest amplifikowany metodą PCR, która nie rozróżnia sekwencji metylowanych i niemetylowanych. Liczne dostępne metody są następnie wykorzystywane do dyskryminacji na podstawie zmian w obrębie amplikonu w wyniku konwersji bisulfitowej.

Bezpośrednie sekwencjonowanieEdit

Pierwsza zgłoszona metoda analizy metylacji przy użyciu DNA poddanego konwersji bisulfitowej wykorzystywała PCR i standardowe sekwencjonowanie dideoksynukleotydów DNA w celu bezpośredniego określenia nukleotydów opornych na konwersję bisulfitową. Startery są zaprojektowane tak, aby były specyficzne dla danego pasma, jak również specyficzne dla bisulfitu (tj. startery zawierające cytozyny inne niż CpG, tak że nie są komplementarne do DNA nie poddanego działaniu bisulfitu), flankując (ale nie obejmując) interesujące nas miejsce metylacji. Dlatego też, w przeciwieństwie do PCR specyficznego dla metylacji, będzie on amplifikował zarówno sekwencje metylowane, jak i niemetylowane. Wszystkie miejsca niezmetylowanych cytozyn są widoczne jako tyminy w powstałej w wyniku amplifikacji sekwencji nici sensownej oraz jako adeniny w amplifikowanej nici antysensownej. Poprzez włączenie do primerów PCR adaptorów do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, produkty PCR mogą być sekwencjonowane przy użyciu masywnie równoległego sekwencjonowania. Alternatywnie, co jest pracochłonne, produkt PCR może być klonowany i sekwencjonowany. W celu wzmocnienia produktu do sekwencjonowania można zastosować metody zagnieżdżonego PCR.

Wszystkie kolejne techniki analizy metylacji DNA z wykorzystaniem DNA poddanego działaniu bisulfitu opierają się na raporcie Frommera i wsp. Chociaż większość innych metod nie jest prawdziwymi technikami opartymi na sekwencjonowaniu, termin „sekwencjonowanie bisulfitowe” jest często używany do ogólnego opisu technik analizy metylacji DNA z konwersją bisulfitową.

PirosekwencjonowanieEdit

Pyrosekwencjonowanie było również stosowane do analizy DNA poddanego działaniu bisulfitu bez użycia PCR specyficznego dla metylacji. Po amplifikacji PCR regionu zainteresowania, pirosekwencjonowanie jest wykorzystywane do określenia sekwencji bisulfitowej specyficznych miejsc CpG w tym regionie. Stosunek C do T w poszczególnych miejscach może być określony ilościowo na podstawie wielkości inkorporacji C i T podczas wydłużania sekwencji. Głównym ograniczeniem tej metody jest koszt technologii. Pirosekwencjonowanie pozwala jednak na rozszerzenie jej na metody przesiewowe o wysokiej przepustowości.

Dalsze udoskonalenie tej techniki zostało ostatnio opisane przez Wong i wsp., którzy wykorzystują startery specyficzne dla alleli, które włączają polimorfizmy pojedynczego nukleotydu do sekwencji startera sekwencjonującego, co pozwala na oddzielną analizę alleli matczynych i ojcowskich. Technika ta jest szczególnie przydatna do analizy imprintingu genomowego.

Analiza konformacji pojedynczej nici wrażliwej na metylację (MS-SSCA)Edycja

Metoda ta opiera się na metodzie analizy polimorfizmu konformacji pojedynczej nici (SSCA) opracowanej dla analizy polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP). SSCA rozróżnia jednoniciowe fragmenty DNA o identycznym rozmiarze, ale różnej sekwencji, w oparciu o różną migrację w elektroforezie niedenaturującej. W MS-SSCA jest to wykorzystywane do rozróżniania regionów poddanych działaniu bisulfitu, amplifikowanych metodą PCR, zawierających interesujące nas miejsca CpG. Chociaż SSCA nie ma czułości, gdy obecna jest tylko różnica pojedynczego nukleotydu, obróbka bisulfitowa często powoduje szereg konwersji C do T w większości regionów zainteresowania, a wynikająca z tego czułość zbliża się do 100%. MS-SSCA umożliwia również półilościową analizę stopnia metylacji DNA na podstawie stosunku intensywności pasm. Jednak ta metoda jest przeznaczona do oceny wszystkich miejsc CpG jako całości w regionie zainteresowania, a nie poszczególnych miejsc metylacji.

Analiza topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM)Edycja

Kolejną metodą różnicowania przekształconego od nieprzekształconego DNA poddanego działaniu bisulfitu jest wykorzystanie analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości (HRM), ilościowej techniki opartej na PCR, pierwotnie zaprojektowanej do rozróżniania SNP. Amplikony PCR są analizowane bezpośrednio poprzez wzrost temperatury i wynikające z tego uwolnienie interkalującego barwnika fluorescencyjnego podczas topnienia. Stopień metylacji, reprezentowany przez zawartość C-to-T w amplikonie, determinuje szybkość topnienia i w konsekwencji uwalniania barwnika. Metoda ta pozwala na bezpośrednią kwantyfikację w teście jednopłytkowym, ale ocenia metylację w amplifikowanym regionie jako całości, a nie w specyficznych miejscach CpG.

Wrażliwe na metylację przedłużenie primera pojedynczego nukleotydu (MS-SnuPE)Edit

MS-SnuPE wykorzystuje metodę przedłużenia primera pierwotnie zaprojektowaną do analizy polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. DNA jest konwertowane bisulfitowo, a specyficzne dla bisulfitu primery są annealed do sekwencji aż do pary zasad bezpośrednio przed CpG zainteresowania. Starter jest dopuszczony do przedłużenia o jedną parę zasad do C (lub T) przy użyciu dideoksynukleotydów kończących polimerazę DNA, a stosunek C do T jest określany ilościowo.

Do określenia tego stosunku C:T można użyć kilku metod. Na początku MS-SnuPE opierał się na radioaktywnych ddNTPs jako reporterze przedłużenia primera. Można również stosować metody oparte na fluorescencji lub pirosekwencjonowanie. Jednakże, analiza spektrometrii mas MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight) może być użyta do rozróżnienia dwóch polimorficznych produktów przedłużenia primera, w zasadzie w oparciu o test GOOD zaprojektowany do genotypowania SNP. Para jonowa odwróconej fazy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (IP-RP-HPLC) również została wykorzystana do rozróżnienia produktów przedłużenia primera.

Rozszczepienie specyficzne dla bazy/MALDI-TOFEdit

Niedawno opisana metoda przez Ehricha i wsp. dalej wykorzystuje konwersje bisulfitowe poprzez dodanie etapu rozszczepienia specyficznego dla bazy w celu zwiększenia informacji uzyskanej ze zmian nukleotydów. Stosując najpierw transkrypcję in vitro regionu zainteresowania do RNA (poprzez dodanie miejsca promotora polimerazy RNA do primera PCR we wstępnej amplifikacji), RNaza A może być użyta do rozszczepienia transkryptu RNA w miejscach specyficznych dla zasad. Ponieważ RNaza A rozszczepia RNA specyficznie na rybonukleotydach cytozyny i uracylu, specyficzność zasadową uzyskuje się poprzez dodanie odpornego na rozszczepienie dTTP, gdy pożądane jest rozszczepienie specyficzne dla cytozyny (specyficzne dla C), oraz poprzez dodanie dCTP, gdy pożądane jest rozszczepienie specyficzne dla uracylu (specyficzne dla U). Rozszczepione fragmenty mogą być następnie analizowane metodą MALDI-TOF. Traktowanie bisulfitem powoduje albo wprowadzenie/usunięcie miejsc rozszczepienia przez konwersję C do U albo przesunięcie masy fragmentu przez konwersję G do A w amplifikowanej nici odwrotnej. Rozszczepienie specyficzne dla C spowoduje specyficzne przecięcie wszystkich metylowanych miejsc CpG. Analizując rozmiary powstałych fragmentów, można określić specyficzny wzór metylacji DNA miejsc CpG w obrębie regionu, a nie określać stopień metylacji regionu jako całości. Metoda ta wykazała skuteczność w badaniach przesiewowych o wysokiej wydajności, umożliwiając badanie licznych miejsc CpG w wielu tkankach w sposób efektywny kosztowo.

PCR specyficzny dla metylacji (MSP)Edycja

Rysunek 4: PCR specyficzny dla metylacji jest czułą metodą dyskryminacyjnej amplifikacji i wykrywania metylowanego regionu zainteresowania przy użyciu starterów specyficznych dla metylacji na genomowym DNA poddanym konwersji bisulfitowej. Takie primery annealują tylko do sekwencji, które są metylowane, a więc zawierają 5-metylocytozyny, które są odporne na konwersję przez bisulfit. In alternative fashion, unmethylated-specific primers can be used.

This alternative method of methylation analysis also uses bisulfite-treated DNA but avoides the need to sequence the area of interest. Zamiast tego, pary primerów projektuje się tak, aby były „metylacjospecyficzne”, zawierając sekwencje komplementarne tylko do nieprzekształconych 5-metylocytozyn, lub przeciwnie, „niemetylacjospecyficzne”, komplementarne do tymin przekształconych z niemetylowanych cytozyn. Metylacja jest określana na podstawie zdolności specyficznego primera do uzyskania amplifikacji. Metoda ta jest szczególnie przydatna do badania wysp CpG o prawdopodobnie dużej gęstości metylacji, ponieważ zwiększona liczba par CpG w primerze zwiększa specyficzność oznaczenia. Umieszczenie pary CpG na 3′-końcu primera również poprawia czułość. Pierwszy raport wykorzystujący MSP opisywał czułość wystarczającą do wykrycia metylacji 0,1% alleli. Ogólnie rzecz biorąc, MSP i związane z nim protokoły są uważane za najbardziej czułe przy badaniu statusu metylacji w określonym locus.

Metoda MethyLight jest oparta na MSP, ale zapewnia analizę ilościową przy użyciu ilościowej PCR. Stosowane są primery specyficzne dla metylacji, a także specyficzna dla metylacji fluorescencyjna sonda reporterowa, która annealizuje do amplifikowanego regionu. Alternatywnie, startery lub sondy mogą być zaprojektowane bez specyficzności metylacyjnej, jeśli potrzebna jest dyskryminacja pomiędzy parami CpG w obrębie zaangażowanych sekwencji. Kwantyfikacja jest wykonywana w odniesieniu do metylowanego referencyjnego DNA. Modyfikacja tego protokołu w celu zwiększenia specyficzności PCR dla DNA przekształconego w bisfosulfit (ConLight-MSP) wykorzystuje dodatkową sondę do bisfosulfitu nieprzekształconego DNA w celu ilościowego określenia tej niespecyficznej amplifikacji.

Inna metodologia wykorzystująca MSP-amplifikowany DNA analizuje produkty przy użyciu analizy krzywej topnienia (Mc-MSP). Metoda ta amplifikuje bisulfitowane DNA zarówno z primerami specyficznymi dla metylacji, jak i niemetylowanymi oraz określa ilościowy stosunek tych dwóch produktów poprzez porównanie pików różnicowych wygenerowanych w analizie krzywej topnienia. Wprowadzono metodę analizy topnienia o wysokiej rozdzielczości, która wykorzystuje zarówno ilościową PCR, jak i analizę topnienia, w szczególności do czułego wykrywania metylacji na niskim poziomie

Metody oparte na mikromacierzachEdit

Metody oparte na mikromacierzach stanowią logiczne rozszerzenie dostępnych technologii analizy DNA poddanego działaniu bisulfitu w celu umożliwienia analizy metylacji w całym genomie. Mikromacierze oligonukleotydowe są projektowane przy użyciu par sond hybrydyzacyjnych oligonukleotydów ukierunkowanych na interesujące nas miejsca CpG. Jedna z nich jest komplementarna do niezmienionej sekwencji metylowanej, a druga jest komplementarna do sekwencji niemetylowanej przekształconej z C na U. Sondy są również specyficzne dla bisulfitu, aby zapobiec wiązaniu do DNA niekompletnie przekształconego przez bisulfit. Test Illumina Methylation Assay jest jednym z takich testów, który stosuje technologię sekwencjonowania bisulfitowego na poziomie mikromacierzy w celu wygenerowania danych dotyczących metylacji w całym genomie.

.