Specyficzne przeciwciała wymagają specyficznej walidacji

Jednym z najbardziej wykorzystywanych narzędzi w badaniach biomedycznych jest przeciwciało monoklonalne. Białka te mają potencjał wyszukiwania i wiązania się z dowolnym celem i mogą być wykorzystywane do obrazowania komórek, sortowania komórek, testów immunologicznych i wielu innych zastosowań.

Ale te laboratoryjne woły robocze nie zawsze działają prawidłowo. W zależności od charakteru celu, przeciwciało może być niespójne w niektórych testach – na przykład wiązać się z niewłaściwym celem, dając fałszywie pozytywne wyniki. Biorąc pod uwagę powszechność stosowania przeciwciał w badaniach, jest to potencjalnie problem wart miliardy dolarów.

Głównym celem jest opracowanie strategii walidacji przeciwciał, aby badacze mogli mieć pewność, że przeciwciało jest odpowiednie do ich konkretnych potrzeb – i że ich wyniki będą powtarzalne.

Thermo Fisher Scientific opracowało dwuczęściową platformę walidacji przeciwciał, aby sprawdzić nie tylko specyficzność swoich przeciwciał InvitrogenTM (czy wiążą się z właściwym celem), ale także ich przydatność do różnych zastosowań. Jednakże, ten sam test nie jest odpowiedni dla wszystkich przeciwciał: Firma Thermo Fisher stosuje odpowiedni test dla każdego docelowego białka, w zależności od jego funkcji biologicznej. Niektóre przeciwciała będą najlepiej testowane przy użyciu CRISPR-Cas9 w celu zlikwidowania genu kodującego docelowe białko i sprawdzenia, czy przeciwciało nie wiąże się już z żadnym z nich. Inne przeciwciała mogą być testowane przy użyciu immunoprecypitacji, a następnie spektrometrii masowej, aby sprawdzić, czy wiążą się z właściwymi celami.

Thermo Fisher opracowuje i udoskonala testy walidacji przeciwciał w oparciu o funkcję biologiczną docelowego antygenu. Oto dwa studia przypadków specyficznych białek i ich testów specyficzności.

Knock-outs dla raka

Receptor naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) jest dobrze zbadanym białkiem: dysregulacja w szlaku EGFR ma związek z różnymi nowotworami. Aby sprawdzić, czy przeciwciała są specyficzne dla EGFR lub dla któregoś z jego celów, badacze mogą wyeliminować krytyczne białka w szlaku EGFR i zobaczyć, jak zmienia się sygnał wiązania przeciwciał.

W ostatnich latach system CRISPR-Cas9 stał się znany jako najbardziej niezawodny i potężny sposób na wyeliminowanie genu. To czyni go idealnym do badania specyficzności przeciwciał w obrębie kaskady sygnalizacyjnej. Naukowcy z firmy Thermo Fisher wykorzystali standardową linię ludzkiego raka (A-431) i zastosowali western blot, aby uzyskać poziom odniesienia dla sygnału wiązania. Następnie użyli CRISPR-Cas9, aby wyeliminować gen docelowy i stworzyć nokaut EGFR. Western blot białka wyekstrahowanego z tych znokautowanych komórek wykazał, że nie było już żadnego sygnału dla białka docelowego (Rysunek 1).

Dalsze testy potwierdziły ten wynik. Kaskada sygnalizacyjna poniżej EGFR obejmuje takie białka jak RAS, RAF, MEK i ERK. Aktywacja EGFR przez naskórkowy czynnik wzrostu (EGF) prowadzi do fosforylacji tych białek, które można wykryć za pomocą innych przeciwciał rozpoznających te stany fosforylacji. Jednakże, dodanie EGF do komórek pozbawionych EGFR nie powinno skutkować żadną fosforylacją. Dodanie tych samych przeciwciał, które rozpoznają fosforylowane cele, nie dało żadnych sygnałów. Dlatego naukowcy z firmy Thermo Fisher są pewni, że przeciwciało anty-EGFR jest specyficzne dla celu.

Szeroki wachlarz modyfikacji

W jądrze komórkowym, DNA jest ciasno upakowane – owinięte wokół białek histonowych, tworząc chromatynę. Badanie histonów jest trudne, ponieważ mogą one ulegać licznym zmianom chemicznym, znanym jako modyfikacje potranslacyjne (PTM). Na przykład, reszty histonu mogą zyskać jedną lub więcej grup metylowych, acetylowych lub fosforowych, z których każda ma wpływ na funkcje komórkowe.

Część technik, takich jak immunoprecypitacja chromatyny (ChIP), western blotting, immunofluorescencja i immunohistochemia, wykorzystuje przeciwciała przeciwko specyficznym PTM histonów, aby zrozumieć stan histonu i jego wiązania. Jednak kilka modyfikacji histonów ma podobne wzory wiązania DNA; przeciwciało, które nie zostało rygorystycznie przetestowane przeciwko wszystkim PTM histonów, może wiązać się z niewłaściwym typem i dawać wynik fałszywie dodatni.

Thermo Fisher przetestował swoje przeciwciała specyficzne dla PTM histonów, używając szeregu peptydów zawierających różne PTM. Jeśli przeciwciało jest rzeczywiście specyficzne dla jednego PTM, będzie wiązać się tylko z tymi plamkami, które zawierają ten PTM. Badacze firmy Thermo Fisher zmierzyli sygnały przy użyciu współczynnika specyficzności: średnia intensywność wszystkich plamek zawierających określony PTM podzielona przez średnią intensywność wszystkich plamek bez tego PTM (Rysunek 2). Przeciwciała wykazały od 4 do 190 razy wyższy współczynnik specyficzności dla ich docelowych stanów PTM niż stanów nie docelowych, co daje pewność, że są one wysoce selektywne.

Thermo Fisher ma siedem innych testów specyficzności poza genetycznym knock-outem i tablicami peptydowymi. Obejmują one wykorzystanie RNAi do obniżenia ekspresji genów, przeciwciała o różnym stężeniu do niezależnej weryfikacji ukierunkowania oraz naturalnie występującą zmienną ekspresję do potwierdzenia specyficzności. Tylko dzięki tak starannym i rygorystycznym testom naukowcy mogą być pewni, że ich laboratoryjne woły robocze są odpowiednie do celu – i że ich praca wytrzyma najsurowszą kontrolę.

Znajdź noty aplikacyjne dotyczące tych przeciwciał Invitrogen i więcej o dwuczęściowym podejściu testowym Thermo Fisher Scientific tutaj.