Technologia rozgałęzionego DNA (bDNA)

BY admin
|

Wprowadzenie

Test rozgałęzionego DNA (bDNA) zapewnia unikalne i potężne narzędzie do wiarygodnej kwantyfikacji cząsteczek kwasów nukleinowych. Zasadniczo różni się od metod amplifikacji docelowej, takich jak PCR, test bDNA bezpośrednio mierzy cząsteczki kwasu nukleinowego na poziomach fizjologicznych poprzez wzmocnienie sygnału reportera, zamiast replikacji sekwencji docelowych jako środków detekcji, a zatem unika błędów nieodłącznie związanych z ekstrakcją i amplifikacją sekwencji docelowych. Test bDNA wykorzystuje liniowe wzmocnienie sygnału przy użyciu syntetycznych sond oligonukleotydowych i cząsteczek bDNA oraz może dokładnie i precyzyjnie mierzyć od około 500 do 10 000 000 cząsteczek. Nowe postępy w technologii bDNA obejmują dodanie cząsteczek przedwzmacniacza i włączenie nowych nukleotydów, isoC i isoG, do sekwencji sond oligonukleotydowych w celu dalszego wzmocnienia sygnału i zmniejszenia szumu spowodowanego niespecyficzną hybrydyzacją składników testu bDNA. Te ulepszenia rozszerzyły ilościową granicę detekcji testu bDNA do poziomu zaledwie 50 molekuł.

Historia technologii bDNA

Doskonale nadający się do rutynowego stosowania w warunkach klinicznych lub badawczych, test bDNA został z powodzeniem zastosowany w wielu dziedzinach, w tym w prognozowaniu i monitorowaniu pacjentów z chorobami wirusowymi. Zapewniając wiarygodne środki do bezpośredniej kwantyfikacji obciążenia wirusowego w próbkach klinicznych, testy bDNA zostały opracowane do pomiaru DNA wirusa zapalenia wątroby typu B, RNA wirusa zapalenia wątroby typu C, RNA ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 i DNA wirusa cytomegalii. Dzięki indywidualnemu projektowaniu sond oligonukleotydowych, potencjalne zastosowania testów bDNA wykraczają daleko poza kwantyfikację wirusowych kwasów nukleinowych. Poprzez tworzenie sond oligonukleotydowych dla specyficznych sekwencji docelowych cząsteczek kwasów nukleinowych, test bDNA został zaadaptowany do szerokiej gamy zastosowań. Na przykład, badacze zaprojektowali sondy dla testu bDNA do pomiaru poziomu komórkowego mRNA. Okazało się to owocnym podejściem dla wielu zastosowań badawczych, w tym monitorowania zmian w poziomach mRNA cytokin w populacjach pacjentów zdrowych i z obniżoną odpornością, badania wzorców splicingu insuliny oraz oceny indukcji genów stresu dla zastosowań toksykologii molekularnej. Biorąc pod uwagę jego wszechstronność, łatwość użycia i wysoki poziom wydajności, test bDNA szybko staje się metodą z wyboru dla kwantyfikacji kwasów nukleinowych

Outline

Test bDNA wykorzystuje format mikropłytek 96-dołkowych i jest oparty na serii specyficznych reakcji hybrydyzacji i chemiluminescencyjnej detekcji zhybrydyzowanych sond. Do powierzchni każdej mikrostudzienki przymocowane są sondy „wychwytujące”, które zawierają specyficzną sekwencję nukleotydów. Te sondy wychwytujące wiążą się z podzbiorem „sond docelowych”, które są związane ze specyficznymi sekwencjami nukleotydów w docelowej cząsteczce kwasu nukleinowego. Ta seria hybrydyzacji zakotwicza docelową cząsteczkę kwasu nukleinowego do powierzchni mikrodołka. Wykrywanie docelowego kwasu nukleinowego i wzmocnienie sygnału odbywa się poprzez kolejną serię hybrydyzacji.

Drugi podzbiór sond docelowych łączy docelową cząsteczkę kwasu nukleinowego z cząsteczkami wzmacniacza bDNA. Dzięki dodaniu cząsteczek przedwzmacniacza, aby zapewnić dodatkową warstwę wzmocnienia pomiędzy sondami docelowymi a cząsteczkami wzmacniacza bDNA, można osiągnąć jeszcze większe wzmocnienie sygnału. Każda cząsteczka wzmacniacza bDNA została zaprojektowana tak, aby zawierała 15 ramion, z których każde zawiera trzy miejsca wiążące dla sprzężonych z fosfatazą alkaliczną „sond etykietujących”. Sygnał chemiluminescencyjny jest generowany po wprowadzeniu substratu dioksetanowego, który jest aktywowany przez fosfatazę alkaliczną. Sygnał ten jest łatwo kwantyfikowany poprzez zliczanie liczby fotonów emitowanych w luminometrze. Oznaczenie bDNA jest z natury ilościowe, ponieważ liczba emitowanych fotonów jest bezpośrednio związana z ilością docelowego kwasu nukleinowego w próbce.

Materiały

Sprzęt – Podgrzewacz do płytek Chiron wyposażony w uchwyt na mikrodołki 8×12 – Luminometr Chiron do odczytu płytek

Odczynniki na dzień 1

  • Oligonukleotydy-zmodyfikowane mikrostudzienki
  • Rozcieńczalnik do lizy
  • Odczynnik do lizy (proteinaza K)
  • Sondy docelowe do wychwytywania
  • Sondy docelowe do znakowania
  • Odczynniki
  • Odczynniki do analizy
  • Standardy i kontrole (opcjonalnie)

Odczynniki na dzień 2

Procedura

Dzień 1

  1. Przygotować odczynnik roboczy do próbek poprzez połączenie:
  • 6 ml rozcieńczalnika do lizy
  • 600 ml odczynnika do lizy
  • 32 ml 500 fm/ml sond docelowych do wychwytywania (20 fm/200 ml końcowy)
  • 96 ml500 fm/ml sond docelowych do znakowania (60 fm/200 ml końcowy)

Uwaga: Rzeczywiste stężenia sond docelowych będą się różnić w zależności od docelowej cząsteczki kwasu nukleinowego.

  1. Dla próbek osocza lub surowicy, pipetować 150 ml Odczynnika Roboczego do Próbek i 50 ml surowicy lub osocza do zduplikowanych mikrostudzienek modyfikowanych oligonukleotydami. W przypadku próbek komórek lub tkanek, przygotować i wyekstrahować granulki RNA w Odczynniku Roboczym Specimen, jak opisano powyżej, i odpipetować 200 ml każdego ekstraktu RNA do zduplikowanych mikrostudzienek modyfikowanych oligonukleotydami.
  2. Jeśli jest to pożądane, kontrole pozytywne i negatywne mogą być dołączone do celów specyficzności. Kontrole należy traktować w taki sam sposób, jak opisano dla próbek w etapie 2 (powyżej) i przeprowadzać w duplikatach.
  3. Jeśli jest to pożądane, można dołączyć wzorce do bezwzględnej kwantyfikacji. Odpipetować 150 ml Odczynnika Roboczego do Próbek i 50 ml odpowiedniego składnika krzywej standardowej do zduplikowanych mikrostudzienek modyfikowanych oligonukleotydami.
  4. Zakleić mikrostudzienki folią Mylar i inkubować mikrostudzienki przez noc w temperaturze 53°C w podgrzewaczu płytkowym Chiron. (Uwaga: Temperatura będzie zależała od określonej optymalnej temperatury dla danego badania.)

Dzień 2

  1. Wyjąć płytkę z podgrzewacza płytek Chiron i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas gdy płytka stygnie, przygotować roztwór wzmacniacza przez rozcieńczenie koncentratu wzmacniacza o stężeniu 200 fm/ml w rozcieńczalniku do etykiet. Końcowe stężenie powinno wynosić 10 fm/50 ml.
  2. Umyć dwukrotnie mikrostudzienki przy użyciu roztworu Wash A, następnie odpipetować 50 ml rozcieńczonego wzmacniacza do każdej studzienki. Inkubować mikrodołki przez 30 minut w temperaturze 53°C w podgrzewaczu płyt Chirona.
  3. Wyjąć płytkę z podgrzewacza płyt Chirona i pozostawić ją na 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas gdy płytka stygnie, przygotować roztwór roboczy etykiety poprzez rozcieńczenie sondy z etykietą w stężeniu 500 fm/ml w rozcieńczalniku do etykiet. Końcowe stężenie powinno wynosić 20 fm/50 ml.
  4. Płukać mikrodołki dwukrotnie roztworem Wash A, następnie odpipetować 50 ml Roztworu Roboczego Etykiety do każdego dołka. Inkubować mikrodołki przez 15 minut w temperaturze 53°C w podgrzewaczu płyt Chirona.
  5. Wyjąć płytkę z podgrzewacza płyt Chirona i pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. W tym czasie przygotować Roztwór Substratu wykonany z 99,7% v/v LumiphosPlus i 0,3% v/v 10% SDS (na przykład: 3 ml LumiphosPlus, 9 ml 10% SDS).
  6. Płukać mikrodołki dwukrotnie Płukaniem A, a następnie trzykrotnie Płukaniem B. Dodać 50 ml Roztworu Substratu do każdego dołka.
  7. Pomiar chemiluminescencji w luminometrze z odczytem płytkowym. (Obejmuje to inkubację mikrodołków przez 30 minut w temperaturze 37°C przed pomiarem w celu osiągnięcia kinetyki stanu ustalonego).

Rozwiązywanie problemów

  • Z dołkami zmodyfikowanymi ligonukleotydami należy obchodzić się ostrożnie. Nie rozdzielać pasków studzienek na segmenty. Zabezpieczyć studzienki świeżym uszczelniaczem do płytek, aby zapobiec parowaniu podczas inkubacji. Podczas usuwania uszczelniacza płytek po inkubacji należy uważać, aby nie wyciągnąć dołków z uchwytu mikrodołków.
  • Wszystkie próbki, wzorce i kontrole powinny być oznaczane w duplikatach w celu optymalnej kwantyfikacji. Należy unikać próbek lipemicznych lub mętnych, ponieważ mogą one dać niejednoznaczne wyniki.
  • W celu uzyskania optymalnych wyników, wszystkie odczynniki należy przed użyciem doprowadzić do temperatury wskazanej w procedurze badania. Dodaj odczynnik do mikrodołków, dotykając końcówką pipety ścianki w pobliżu punktu środkowego dołka, ponad powierzchnią płynu w dołku.

Zastosowanie

Kwantyfikacja wirusów lub badanie wiremii stało się częścią rutynowego postępowania z pacjentami zakażonymi wirusem HIV-1 lub wirusem zapalenia wątroby typu C (HCV). Obecnie istnieje kilka technologii molekularnych, które są dostępne do użytku w klinicznych warunkach laboratoryjnych. Spośród nich, tylko testy z rozgałęzionym DNA (bDNA) są zatwierdzone przez FDA do badania wiremii HIV-1 i HCV. Ta technologia wzmacniania sygnału jest zbudowana na serii reakcji hybrydyzacji, które są bardzo podatne na pełną automatyzację i w ten sposób zmniejszają ilość pracy wymaganej do wykonania tego typu analizy.

Molekularne testy diagnostyczne wykorzystujące technologię bDNA do wykrywania docelowych cząsteczek kwasu nukleinowego są czułymi, specyficznymi i wiarygodnymi narzędziami w diagnostyce infekcji wirusowych i bakteryjnych oraz do monitorowania postępu choroby w trakcie terapii. Testy bDNA ewoluowały od etapów rozwoju w laboratorium badawczym do zatwierdzonych przez US Food and Drug Administration testów ilościowych o cennych zastosowaniach klinicznych. Testy bDNA są mniej pracochłonne niż wiele procedur opartych na badaniach molekularnych, ponieważ są bardzo podatne na całkowitą automatyzację. Używając bDNA, amplifikacja docelowej sekwencji nie jest wymagana, a zatem w przypadku testów bDNA mniej prawdopodobne jest zanieczyszczenie krzyżowe pomiędzy replikowanymi próbkami z powodu nadmiernej ilości amplikonów lub przeniesienia. Ponadto, ponieważ bDNA jest technologią wzmacniania sygnału, badanie jest w stanie określić ilościowo z mniej niż 0,5 log lub 3-krotną zmiennością dla całego zakresu dynamicznego.

technologia bDNA okazała się wszechstronna, ponieważ opracowano metody wykrywania infekcji szerokiego zakresu mikroorganizmów, w tym pasożyta Trypanosoma

brucei, wirusa cytomegalii, wrażliwych na antybiotyki i opornych na antybiotyki bakterii Staphylococcus, wirusa brodawczaka ludzkiego oraz wirusa zapalenia wątroby typu B. Jednakże, ostatnie wysiłki skupiły się na rozwoju testów bDNA do ilościowego oznaczania RNA wirusa HIV-1 i wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), co doprowadziło do rutynowego zastosowania metod bDNA w klinicznych laboratoriach diagnostyki molekularnej. Opisując postęp metod bDNA, w niniejszym przeglądzie położono nacisk na testy bDNA dla HIV-1 i HCV.

Atesty bDNA pierwszej generacji HIV-1

Dokładne, powtarzalne testy bDNA pierwszej generacji zostały opracowane do wykrywania HIV-1 RNA i HCV RNA w ludzkim osoczu (Quantiplex HIV-1 lub HCV RNA 1.0, Bayer, Tarrytown, NY).9-11 W jednym z pierwszych doniesień na temat testu Quantiplex bDNA nie zaobserwowano reaktywności w próbkach osocza pochodzących od dawców seronegatywnych przy użyciu testu pierwszej generacji

bDNA, co wskazuje na doskonałą swoistość.9 Pozytywne wyniki w teście bDNA zaobserwowano w 83% próbek od 348 pacjentów, którzy byli seropozytywni w kierunku HIV-1.9 Zakres dynamiczny oznaczania ilościowego przy użyciu testu Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 rozciągał się od 104 (dolna granica wykrywalności) do ponad 106 kopii RNA HIV/mL.9,11 Zmiany wiremii od 2 do 3 razy były statystycznie istotne przy użyciu testu bDNA, wskazując, że test Quantiplex HIV-1 RNA 1.0 jest wysoce dokładny i powtarzalny.11 Dla porównania, zmiany wiremii od co najmniej 3,7 do 5,8 razy były konieczne, aby wyniki były statystycznie istotne przy użyciu najwcześniejszych wersji testu RT-PCR.11 Dlatego też bDNA stało się metodą z wyboru w większości badań klinicznych oceniających test wiremii oraz skuteczność kliniczną nowych inhibitorów odwrotnej transkryptazy i proteazy HIV-1.

Czułość metody wykrywania bDNA została zwiększona w teście drugiej generacji HIV-1 (Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 assay, Bayer) poprzez zmianę konstrukcji sond docelowych i wychwytujących oraz poprzez dodanie oligonukleotydów przedwzmacniających. Ulepszona konstrukcja sond docelowych i wychwytujących pozwoliła na zwiększenie rygorystyczności hybrydyzacji, zmniejszając w ten sposób tło testu. Przedwzmacniacze drastycznie zwiększają intensywność sygnału, ponieważ każda cząsteczka przedwzmacniacza posiada wiele regionów do hybrydyzacji z wieloma cząsteczkami bDNA. Ponadto, każda cząsteczka bDNA posiada wiele powtarzających się sekwencji do hybrydyzacji z sondami znakowanymi AP. Sygnał wyjściowy przy użyciu testu Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 wykazywał liniowość od około 500 kopii/ml do 1,6 × 106 kopii/ml (podany zakres dynamiczny wynosił od 500 do 8 × 105 kopii/ml). Czułość testu drugiej generacji HIV-1 bDNA została zwiększona 20-krotnie w porównaniu z testem pierwszej generacji (dolne granice wykrywalności wynosiły odpowiednio 500 kopii/ml i 10 × 104 kopii/ml). W szeroko zakrojonej analizie precyzji porównano wyniki testu początkowego i ponownego testu w teście Quantiplex HIV-1 RNA 2.0. Stwierdzono, że test HIV-1 RNA 2.0 jest wysoce powtarzalny.14 Spośród 174 próbek z wiremią powyżej 5000 kopii/ml, 96% miało różnice mniejsze niż 0,3 log10 w liczbie kopii pomiędzy wynikami początkowymi a wynikami ponownych testów. Spośród 69 próbek z wiremią pomiędzy 500 a 5000 kopii/mL, 86% miało różnice mniejsze niż 0,3 log10 pomiędzy wynikami początkowymi a wynikami ponownego badania. Jednak wśród 5 339 pacjentów, którzy byli badani w rutynowych badaniach klinicznych w ciągu 1 roku, wiremia mniejsza niż 500 kopii/mL była obserwowana w 41,6% próbek.

W związku z tym, test bDNA o wyższej czułości (tj. dolna granica wykrywalności <500 kopii/mL) był potrzebny dla znacznej części pacjentów.

Charakterystyki wydajności testu Quantiplex HIV-1 RNA 2.0 i testu RT-PCR (Amplicor HIV-1 Monitor 1.0 assay, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) zostały porównane przy użyciu rozcieńczeń próbek standardowych, które miały znaną liczbę kopii wirusa HIV-1. Kiedy rozcieńczenia tych samych standardów były testowane w 2 testach, liczby kopii wirusa HIV-1 były generalnie wyższe z testu RT-PCR niż z testu bDNA. Na przykład, zakresy liczby kopii RNA wynosiły od 900 do 7,68 × 105 kopii/ml w teście bDNA i od 3,360 do 1,88 × 106 kopii/ml w teście RT-PCR. Oba testy były liniowe dla podanych zakresów dynamicznych.

Porównanie nachylenia linii regresji liczby kopii HIV-1 vs sygnał wyjściowy sugeruje, że test bDNA miał mniejszy proporcjonalny błąd systematyczny. Zmienność między seriami, przy użyciu próbki standardowej zawierającej 1650 kopii/mL HIV-1, była niższa w teście bDNA niż w teście RT-PCR; współczynniki zmienności dla testów bDNA i RT-PCR wynosiły odpowiednio 24,3% i 34,3%, co wskazuje, że test bDNA był nieco bardziej precyzyjny przy tej liczbie kopii RNA HIV-1. W porównaniu z użyciem standardu 1650 kopii/mL, współczynniki zmienności między seriami były wyższe dla próbki zawierającej 165 kopii RNA HIV-1/mL (44,0% i 42.7% odpowiednio dla testów bDNA i RT-PCR). Wyniki testów były podobne, gdy porównywano równe liczby kopii HIV-1 dla podtypów A do F przy użyciu testu bDNA. Jednakże, w tej wersji RT-PCR, podtypy A, E i F były wykrywane mniej skutecznie niż podtypy B, C i D. Różnice pomiędzy testem bDNA drugiej generacji a testem Amplicor Monitor RT-PCR do ilościowego oznaczania wirusa HIV-1 wskazywały, że wymagana jest spójność metody testowania dla każdego pacjenta w trakcie diagnozowania i leczenia.

Atesty bDNA HCV

Podczas kontynuacji prac nad ulepszonym testem bDNA HIV-1 trzeciej generacji, firma Bayer dostrzegła potrzebę opracowania testu wiremii HCV o pojawiającej się przydatności klinicznej podobnej do testów HIV-1. Do wykrywania HCV, badanie bDNA pierwszej generacji (Quantiplex HCV RNA 1.0 assay, Bayer) posiadało dynamiczny zakres kwantyfikacji w ludzkim osoczu od 3,5 × 105 do 1,2 × 108 kopii HCV RNA/mL. Genotypy od 1 do 6 były wykrywane przy użyciu tego testu, chociaż czułość była niższa dla genotypów 2 i 3 (67% wskaźnik wykrywania: sygnał pozytywny dla 60 z 89 próbek surowicy, o których wiadomo, że zawierają genotypy 2 lub 3 HCV) w porównaniu z genotypem 1 (97% wskaźnik wykrywania: sygnał pozytywny dla 67 z 69 próbek surowicy, o których wiadomo, że zawierają genotyp 1 HCV). Porównanie testu Quantiplex HCV RNA 1.0 i opracowanego w laboratorium badawczym testu RT-PCR dla HCV wykazało większą czułość testu RT-PCR, którego dolna granica wykrywalności wynosiła 2,5 × 104 kopii HCV RNA/mL. Jednak test HCV bDNA miał większą odtwarzalność i był mniej czasochłonny niż opracowany w laboratorium test HCV RT-PCR.

Aby poprawić wskaźnik wykrywalności genotypów 2 i 3 HCV, opracowano test drugiej generacji (Quantiplex HCV RNA 2.0 assay, Bayer).15 Główną zmianą w projekcie testu HCV RNA drugiej generacji było użycie sond do sekwencji w genomie HCV, które były bardziej konserwowane w różnych genotypach. Te konserwowane regiony to sekwencje 5′ untranslated i sekwencje w rdzeniu genu genomu HCV. Wynikiem zmian w sondach docelowych i wychwytujących było radykalne zmniejszenie różnic w wykrywalności wśród genotypów HCV w teście drugiej generacji. Każdy z 6 genotypów HCV miał wysoki wskaźnik wykrywalności i nastąpiła znaczna poprawa w wykrywaniu genotypów HCV 2 i 3 (wykrywalność 93% vs 67% próbek, o których wiadomo, że zawierają genotypy HCV 2 lub 3 w testach HCV 2.0 i HCV 1.0, odpowiednio). Również czułość testu bDNA drugiej generacji była nieznacznie zwiększona w porównaniu z testem HCV 1.0 (dolne granice oznaczalności wynosiły 2,0 × 105 w porównaniu z 3,5 × 105 ).

Trzecia generacja testów bDNA dla HIV-1 i HCV

W testach bDNA pierwszej i drugiej generacji niespecyficzna hybrydyzacja sond oligonukleotydowych do sekwencji niebędących celem ograniczała czułość testu. Krytycznym ulepszeniem technologicznym w testach bDNA trzeciej generacji (Quantiplex HIV-1 RNA 3.0, Bayer) było użycie nienaturalnych zasad, 5′-metylo-2′- deoksyizoguanozyny (isoG) i 5′-metylo-2′-izodeoksycytydyny (isoC), w syntezie wszystkich sond w systemie bDNA, z wyjątkiem przedłużaczy wychwytu, które pośredniczą w wychwycie docelowego wirusowego kwasu nukleinowego na powierzchnię płytki. Ponieważ oligonukleotydy zawierające isoG i isoC nie występują w przyrodzie, niespecyficzna hybrydyzacja jest znacznie zredukowana. Tak więc sondy zmodyfikowane nienaturalnymi zasadami nie tworzą stabilnych hybryd z sondą wychwytującą przy nieobecności docelowego RNA. W początkowym opisie testu trzeciej generacji, granica wykrywalności HIV-1 w próbkach osocza od 11 pacjentów wynosiła 50 kopii na ml.Stanowi to 10-krotną poprawę granicy wykrywalności w porównaniu z testem drugiej generacji. Podczas leczenia wysoce aktywną terapią antyretrowirusową, wiremia HIV-1 zmniejszyła się poniżej granicy wykrywalności u wszystkich 11 pacjentów.

Test VERSANT HIV-1 RNA 3.0 ma zakres dynamiczny od 75 do 5 × 105 kopii HIV RNA/mL. Wersja 3.0 została również zatwierdzona do dolnej granicy wykrywalności równej 50 kopii/mL w kilku innych krajach. Kiedy porównano dopasowane próbki w teście bDNA drugiej generacji HIV-1 (Quantiplex wersja 2.0) i teście RT-PCR Amplicor Monitor 1.0, konsekwentnie uzyskano niższe liczby kopii HIV-1 przy użyciu testu bDNA. Jednakże zaobserwowano ścisłą korelację ilościową w liczbie kopii RNA HIV-1 między testem trzeciej generacji (wersja 3.0) a testem RT-PCR Amplicor Monitor 1.5.18 Wyniki wiremii w teście bDNA w wersji 3.0 i w teście RT-PCR Amplicor były około 2-krotnie wyższe niż w teście w wersji 2.0. Ilościowo podobne wyniki w wersji 3.0 testu bDNA i testu RT-PCR są ważne w opiece nad pacjentem, ponieważ istnieje prawdopodobieństwo, że do badania próbek od tego samego pacjenta w trakcie terapii anty-HIV będą stosowane różne metody. Ostatnie dane sugerują, że ponowny podział na grupy u pacjentów badanych testem RT-PCR może nie być konieczny.

Podobnie jak w przypadku testu bDNA HIV-1 wersja 3.0, w teście bDNA trzeciej generacji dla HCV również zastosowano oligonukleotydy podstawione izoC- i izoG w celu zmniejszenia niespecyficznej hybrydyzacji. Zastosowanie oligonukleotydów podstawionych izoC i izoG zwiększyło czułość testu około 62-krotnie. Dolna granica wykrywalności testu HCV RNA 3.0 wynosiła 3,2 × 103 kopii/ml w porównaniu z 2 × 105 kopii/ml w teście HCV RNA 2.0. Dynamiczny liniowy zakres kwantyfikacji oznaczenia HCV RNA 3.0 rozciągał się od 3,2 × 103 kopii/ml (615 IU/ml) do 4 × 107 kopii/ml HCV RNA (7,7 × 106 IU/ml). Badanie HCV RNA 3.0 charakteryzowało się wysoką swoistością (98,2%) i, podobnie jak badanie drugiej generacji, było równie skuteczne w ilościowym oznaczaniu HCV RNA we wszystkich genotypach. Odchylenia standardowe między seriami i wewnątrz serii dla próbek replikowanych wynosiły odpowiednio 0,2 log10 i 0,14 log10, co wskazuje, że badanie trzeciej generacji było wysoce odtwarzalne.

Oprócz eradykacji HCV w surowicy, ważnym celem terapii anty-HCV jest zmniejszenie poziomu HCV w wątrobie. Przydatność testu HCV RNA 3.0 do wykrywania i ilościowego oznaczania HCV RNA w próbkach biopsji wątroby badano u 25 pacjentów zakażonych jednocześnie HCV i HIV.20 Powtarzalność testu HCV bDNA trzeciej generacji była podobna w przypadku próbek biopsji wątroby i próbek surowicy. Również wykrywanie HCV RNA w próbkach wątroby od pacjentów zakażonych genotypami 1, 3 i 4 za pomocą testu HCV RNA 3.0 było wysoce swoiste i czułe. W tym badaniu przeprowadzonym na 25 pacjentach, wysoki poziom wewnątrzwątrobowego

HCV przed leczeniem korelował z niską częstością odpowiedzi na terapię anty-HCV. Wewnątrzwątrobowe poziomy HCV przed leczeniem były najwyższe u pacjentów zakażonych genotypem 1 HCV. Wyniki tego badania wykazały, że ważne markery progresji choroby HCV, poziomy HCV w wątrobie i w surowicy, mogą być wiarygodnie oznaczane za pomocą analizy bDNA w trakcie leczenia. Metody dla testów bDNA trzeciej generacji obejmują przygotowanie próbki, hybrydyzację i wykrywanie sygnału dla HIV-1 RNA i HCV RNA. Wszystkie 3 testy są wykonywane w mikrostudzienkach na platformie System 340 dla testu HCV RNA 3.0, który nie wymaga oddzielnego etapu ekstrakcji. W wersji 3.0 testu HIV-1 RNA, przygotowanie próbki różni się od metody HCV RNA i jest wykonywane poza platformą System 340. W ostatnim badaniu oceniano adaptację metody HIV-1 RNA w wersji 3.0, w której etap przetwarzania próbki HIV-1 został zmodyfikowany w celu umożliwienia jednoczesnego testowania HCV i HIV-1 na platformie System 340. Metoda HIV-1 została zmodyfikowana poprzez pominięcie 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 63°C w celu lizy wirusów. Zamiast tego, lizę HIV-1 i HCV przeprowadzono na platformie System 340. Metody testowe HCV bDNA pozostały niezmienione w teście łączonym. Swoistość i oznaczanie ilościowe przy użyciu połączonej metody bDNA były zgodne ze specyfikacjami dla poszczególnych testów HIV-1 i HCV. Jednoczesne testowanie w kierunku HIV-1 i HCV usprawniło pracę w laboratorium klinicznym i spowodowało obniżenie kosztów. Ponieważ wykrywanie i oznaczanie ilościowe HIV-1 RNA i HCV RNA ma kluczowe znaczenie dla diagnostyki i oceny odpowiedzi na terapię, możliwość wykonywania jednoczesnych testów dla obu wirusów stanowi znaczący postęp w diagnostyce molekularnej.

.