Top Five Methods for Primary Antibody Labeling

W każdym zastosowaniu, które wykorzystuje przeciwciała do wykrywania sygnału (np. Western blotting, ELISA, immunohistochemia lub FACS), istnieją dwa podejścia do znakowania przeciwciał: znakowanie bezpośrednie i pośrednie. Standardowy Western blotting wykorzystuje etykietowanie pośrednie, ponieważ używa się przeciwciała pierwotnego do wykrycia antygenu docelowego, a następnie przeciwciała wtórnego, do którego dołączona jest cząsteczka detekcyjna.

W niektórych sytuacjach lepszym rozwiązaniem może być pominięcie przeciwciała wtórnego i wszystkich związanych z nim kroków oraz bezpośrednie etykietowanie przeciwciała pierwotnego. Przypadki, które wymagają bezpośredniego znakowania przeciwciała pierwotnego, obejmują:

• Występuje niespecyficzne wiązanie przeciwciała wtórnego
• Używasz przeciwciał pierwotnych o niestandardowych przeciwciał pierwotnych – w tym przypadku może być trudno znaleźć dobre przeciwciała wtórne
• Przy multipleksowaniu z przeciwciałami pochodzącymi z tego samego gatunku
• Kiedy trzeba skrócić czas eksperymentu przez wyeliminowanie inkubacji przeciwciał wtórnych i związanych z tym etapów mycia

Parametry przeciwciał

Wybrane przeciwciało można znakować nie tylko barwnikami fluorescencyjnymi, ale także białkami fluorescencyjnymi, enzymami i kolorowymi cząsteczkami. Wszystkie one są zwykle przyłączane przez końcową grupę lizynową, więc musisz unikać buforów zawierających aminy (na przykład Tris) i cząsteczek na wszystkich etapach. W przeciwnym razie będziesz w większości oznaczał cząsteczki swojego buforu! Należy również unikać powszechnie stosowanego w buforach konserwantu azydku sodu, ponieważ będzie on zakłócać reakcję znakowania.

Przeciwciało do znakowania powinno mieć stężenie nie mniejsze niż 0,5 mg/ml i >90% czystości. Im mniej przeszkadzających białek i cząsteczek zawierających grupy aminowe znajduje się w preparacie przeciwciała, tym skuteczniejsza będzie reakcja znakowania. Ale nawet jeśli Twoje przeciwciało pływa w glicynie i BSA, zawsze możesz usunąć przeszkadzające substancje przez dializę. Można również poprawić czystość przeciwciała, przepuszczając je przez kolumnę z białkiem A lub nawet przygotować własną kolumnę do oczyszczania powinowactwa z odpowiednim antygenem.

Główne wewnętrzne metody znakowania przeciwciał

Metoda estrów NHS (sukcynimidylowych)

Ta metoda jest przydatna do koniugacji przeciwciał z szeroko dostępnymi barwnikami fluorescencyjnymi, takimi jak pochodne rodaminy. Zazwyczaj jest ona przeprowadzana w buforze fosforanowym z późniejszym oddzieleniem na kolumnie od nieznakowanego barwnika. Główną wadą jest to, że estry są niestabilne, ponieważ są wrażliwe na wilgoć. Znakowane przeciwciało powinno być użyte natychmiast po zakończeniu reakcji.

Metoda Izotiocyjanianu

Możesz użyć tej metody do wytworzenia izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), który jest bardzo popularny w przygotowywaniu białek fluorescencyjnych i przeciwciał. Jeśli pracowałeś z mikroskopią fluorescencyjną, miałeś do czynienia z FITC. Dostępne są również izotiocyjanianowe analogi różnych standardowych barwników.

Izotiocyjanian jest bardziej stabilny niż NHS, ale jest trudniejszy do wytworzenia i twoja reakcja znakowania będzie prawdopodobnie mniej wydajna przy tej metodzie. Podobnie jak w przypadku NHS, nadmiar barwnika powinien być usunięty po reakcji przez chromatografię.

Metoda karbodiimidowa

Związki karbodiimidowe przekształcają grupy karboksylowe na białkach w reaktywne półprodukty, które mogą reagować z lizynami. Wysoka reaktywność karbodiimidów oznacza, że mogą one być stosowane do znakowania przeciwciał za pomocą stosunkowo obojętnych materiałów, takich jak cząsteczki magnetyczne lub złote. Najpowszechniej stosowanym karbodiimidem jest EDC. NHS jest czasami dodawany do reakcji, aby wspomóc tworzenie względnie stabilnych produktów pośrednich.

Metoda jest prosta, ale podobnie jak NHS, EDS jest higroskopijny, więc należy użyć przeciwciała bezpośrednio po znakowaniu.

Metoda dwóch znaczników

Tutaj znakuje się przeciwciało innym białkiem, które służy jako katalizator, na przykład HRP lub fosfatazą alkaliczną. Ponieważ obie cząsteczki zawierają liczne grupy aminowe, bezpośrednie sieciowanie (jak w przypadku metody NHS) doprowadziłoby do powstania polimerów tej samej cząsteczki. Dlatego łączenie należy wykonać w dwóch oddzielnych etapach. Przeciwciało należy usieciować z cząsteczką X, a katalizator z cząsteczką Y. Należy starannie wybrać X i Y, ponieważ powinny one oddziaływać ze sobą, tworząc koniugat. Na przykład, można wybrać maleimid jako X i tiol jako Y.

Choć wynikowy koniugat będzie bardziej stabilny niż to, co uzyskuje się metodą NHS, metoda ta będzie wymagała trzy razy więcej pracy; oddzielne etapy znakowania i oczyszczania dla przeciwciała, katalizatora i reakcji koniugacji. Dobrą wiadomością jest to, że można kupić wstępnie oznakowane cząsteczki katalityczne, a następnie odpowiednio oznakować przeciwciało.

Metoda nadjodanowa

Ta metoda jest przydatna do wytwarzania specyficznych koniugatów HRP-przeciwciało. Periodate aktywuje HRP poprzez tworzenie cząsteczek aldehydu, które oddziałują z resztami lizyny. Samo HRP ma tylko kilka reszt lizynowych, więc polimeryzacja enzymatyczna nie jest istotnym problemem. Wiązania między HRP i przeciwciałem są odwracalne, chyba że są stabilizowane przez dodanie cyjanohydryku sodu.

To było moje zestawienie najlepszych domowych metod znakowania przeciwciał. Na rynku jest wiele komercyjnych zestawów z podobną chemią, które mogą znacznie ułatwić Ci życie. Jeśli Twoje laboratorium ma pieniądze.

Czy masz inną metodę znakowania przeciwciał, którą chciałbyś się z nami podzielić? Skontaktuj się z nami, pisząc w sekcji komentarzy.

Literatura:

Meyer JP, Adumeau P, Lewis JS, Zeglis BM. Kliknij Chemia i Radiochemia: The First 10 Years. Bioconjug Chem. (2016) 27(12):2791-2807. doi: 10.1021/acs.bioconjchem.6b00561. Epub 2016 Nov 22.

.