Understanding the structural basis of HIV-1 restriction by the full length double-domenę APOBEC3G

Overall structural features of the fl rA3G

Poważną przeszkodą w badaniach strukturalnych białek APOBEC z podwójną domeną fl była słaba rozpuszczalność – formy typu „dzikiego” są często oczyszczane jako niejednorodne oligomery lub duże agregaty przy wyższym stężeniu. W celu uzyskania dobrze rozpuszczalnego fl A3G do badań strukturalnych, zbadaliśmy homologi A3G z różnych gatunków naczelnych i stwierdziliśmy, że A3G z małpy rhesus (rA3G) ma lepszą rozpuszczalność. Dwa zmutowane konstrukty fl rA3G (nazwane FKL i E/Q) dały dobrze zachowujące się białka i kryształy w różnych warunkach (Tabela Uzupełniająca 1), które dyfrakcjonowały odpowiednio do 2,47 i 2,40 Å (Tabele Uzupełniające 1 i 2, Rys. 1). Dodatkowe zmiany w tych dwóch konstruktach poprawiły rozpuszczalność i wydajność rA3G, włączając w to zastąpienie 8-residowej pętli 8 CD1 przez 4-residową pętlę 8 z hA3G-CD2 (jak w obu konstruktach E/Q i FLK, Tabela Uzupełniająca 1, Rys. 1), kolejne mutacje F126Y na pętli 7 CD1, K180S/L184S na CD1 h6 oraz 8-residowa delecja pętli 3 CD2 (jak w konstrukcie FKL, tabela uzupełniająca 1, ryc. 1B). Należy zauważyć, że K128 rA3G, który działa jako bariera dla transmisji międzygatunkowej, jest zmutowany do reszty kwasu asparaginowego (D128), tak jak w ludzkim A3G (hA3G)36. Konstrukty zawierają również katalityczną mutację E259 do Q/A, aby uniknąć potencjalnej toksyczności podczas ekspresji białka rekombinowanego. Zmutowane reszty i ich umiejscowienie w strukturze pokazano na Rys. 1B. W obu strukturach CD1 i CD2 są złożone w samodzielne domeny połączone krótkim 5-rezydowym łącznikiem (reszty od R194 do D198) (Rys. 1a, b). Obie struktury, pomimo ogólnego podobieństwa strukturalnego (Rys. 1a, b), wykazują oczywiste różnice w konformacji CD2 i orientacji upakowania pomiędzy CD1 i CD2 (Rys. 1c, Supplementary Fig. 2A).

Obie struktury rA3G FKL i E/Q mają tę samą kanoniczną strukturę CD1 i dobrze się na siebie nakładają (Rys. 2B Suplementu, rmsd 0,445 Å). Znacznie większe różnice konformacyjne w każdej z domen CD2 powodują, że rmsd superpozycji wynosi 0,862 Å. Podczas wyrównywania struktur FKL i E/Q poprzez ich domenę CD1, domena CD2 struktury E/Q wykazuje rotację o ~29° w porównaniu z domeną CD2 struktury FKL, powodując przesunięcie domeny E/Q CD2 o ~15 Å w dół i ~8 Å w kierunku CD1, co skutkuje znacznie bliższym upakowaniem interakcji z CD1 (Suplementary Figure 2 A). Ogólny interfejs upakowania CD1-CD2 ma powierzchnię zakopaną ~623 Å2 dla struktury FKL i ~700 Å2 dla struktury E/Q. Ciaśniejsze upakowanie CD1-CD2 w strukturze E/Q prowadzi tylko do nieco większej powierzchni zakopanej niż w strukturze FKL, prawdopodobnie z powodu ponownego złożenia i brakującej gęstości interfejsu lokalizującego elementy strukturalne (h2-pętla3) jego CD2.

Dwa typy interakcji domen CD1 i CD2

Podczas gdy struktura FKL pokazuje kanoniczne zagięcie jej domeny CD2 (Supplementary Fig. 2C), struktura E/Q pokazuje znaczące zmiany w konformacji CD2 (Supplementary Fig. 2D), z głównymi zmianami na helisie 2 (h2), pętli 3, pętli 4 i centrum aktywnym Zn. Długa helisa h2 CD2 w strukturze FKL (Supplementary Fig. 2C) stała się krótką 310 helisą (h2′) w strukturze E/Q (Supplementary Fig. 2D), co spowodowało powstanie nieuporządkowanego 14-rezydowego odcinka obejmującego części pętli 3 i h2 (reszty od A246 do E259) (Supplementary Fig. 1A). Przejście do krótkiej 310 h2 i wydłużonej struktury przypadkowej cewki jest konieczne, aby uniknąć zderzenia w tej ciasno upakowanej konformacji (Rys. 1e). Jednakże, zaburza to również konformację centrum aktywnego Zn CD2 w regionach h2 i pętli 3, które stają się nieuporządkowane, co skutkuje brakiem koordynacji Zn (Suplementary Fig. 2D). Brak koordynacji Zn jest obserwowany tylko w jednym innym APOBEC, w strukturze CD2 APOBEC3F (A3F)46,47. Jednakże struktury A3F-CD2 zawierające Zn lub nieobecne są zasadniczo identyczne, które również dobrze dopasowują się do kilku innych struktur APOBEC (Suplementary Fig. 2E), podczas gdy E/Q CD2 jest unikalna ze względu na refoldowane pętle h2 3 i 4 oraz konformację Zn-centrum (Supplementary Fig. 2E, F).

Chociaż możliwe jest, że utrata Zn i ponowne złożenie CD2 w strukturze E/Q może być wynikiem mutacji w tym konstrukcie, zbadaliśmy, czy wariant E/Q ma wadliwą aktywność katalityczną. Odwrócenie E259Q w konstrukcie E/Q z powrotem do katalitycznego E259 WT (konstrukt E/Q*) przywróciło wariantowi pełną aktywność w teście deaminacji z użyciem lizatów ekspresyjnych komórek HEK293T (Supplementary Fig. 3). Dodatkowo, E/Q* niosący pojedyncze mutacje F126Y, K180S/L184S lub CD2Δloop3 (jak w strukturze FKL) jest aktywny, chociaż aktywność konstruktu FKL* (z E259A przywróconym do E259) z połączonymi mutacjami jest mniejsza niż E/Q* i WT. Wyniki te sugerują, że nawet jeśli skrystalizowana struktura E/Q, pozbawiona Zn w domenie CD2, reprezentuje katalitycznie nieaktywny stan strukturalny A3G, to odwrócenie reszty katalitycznej z powrotem do E259 może w pełni przywrócić aktywność deaminazy porównywalną z WT. Połączone mutacje w FKL częściowo wpływają na jego aktywność katalityczną.

Z powodu ~29° różnicy we względnym kącie rotacji w pakowaniu między każdą domeną w strukturach FKL i E/Q, szczegółowe interakcje molekularne między CD1 i CD2 różnią się między tymi dwiema strukturami. Domeny CD1 i CD2 w strukturze FKL oddziałują ze sobą głównie poprzez h3, h4 i pętlę 7 domeny CD1 oraz h1, h2, β2 i pętlę 3 domeny CD2 (Rys. 1a, d). W strukturze E/Q obie domeny oddziałują ze sobą głównie poprzez h3, h4 i h6 CD1 z h2′, β2, pętlą 4 i pętlą 10 CD2 (Rys. 1b, e). W rezultacie około 40% reszt oddziałujących między CD1 i CD2 różni się w obu strukturach (pełna lista oddziałujących reszt znajduje się na Rys. 4), a nawet jeśli te same reszty uczestniczą w tym oddziaływaniu, to często tworzą one różne kontakty wiążące ze względu na zmianę kąta upakowania między obiema domenami. Zdolność do upakowania domen CD1 i CD2 z różnymi kątami i interakcjami reszt wskazuje na pewien stopień plastyczności w układzie domen fl A3G.

Pełnej długości dimer rA3G i cechy obszaru dimeryzacji

Konstrukt E/Q krystalizowano w różnych warunkach pH i soli (Tabela uzupełniająca 1), ale konsekwentnie wykazywał tę samą strukturę i dimeryzację poprzez interakcje CD1-CD1 (ryc. 2a, b), głównie poprzez bezpośrednie upakowanie kilku reszt na h6 (K180, L184, A187), pętli 1 (I26) i pętli 7 (F126, W127) z obu podjednostek (Supplementary Fig. 5A, B). Co ciekawe, interakcje te są identyczne z tymi, które wcześniej odnotowano dla samej domeny rA3G-CD118, pomimo włączenia mutacji K128D, która jest krytyczna dla zmiany rA3G z niewrażliwej na HIV-1 Vif na wrażliwą na degradację. Warto zauważyć, że taka dimeryzacja fl rA3G prowadzi jedynie do niewielkiego zwiększenia największego wymiaru z 85 Å monomeru do 95 Å dimeru (Rys. 2a, b).

Szczegółowe badanie reszt ustawionych po obu stronach obszaru interfejsu dimerycznego ujawnia dwie istotne cechy. Po pierwsze, w sumie 18 dodatnich/polarnych i hydrofobowych reszt jest ustawionych wokół dimerowego złącza rA3G w sposób odpowiedni do interakcji z jednoniciowymi kwasami nukleinowymi, takimi jak RNA (wstawka B na Rys. 2). Te 18 reszt jest zorganizowane w dwa zestawy, z pierwszym zestawem zgodnie z ruchem wskazówek zegara, zaczynając od górnego monomeru (na zielono), R24, H181, N177, N176, K180, i kontynuując do dolnego monomeru (na jasnoniebiesko) W127, Y125, Y124 i S28, a następnie z lustrzanym zestawem tych samych reszt. Po drugie, w wyniku dimeryzacji, reszty R24 i pobliskie dodatnie reszty K180 i H181 każdego monomeru są ustawione blisko siebie w przestrzeni, z odległością około 7 Å pomiędzy dwiema resztami R24. Takie rozmieszczenie przestrzenne znacznie zwiększa lokalne potencjały elektrostatyczne (EP) z około +1,9 kT/e jako monomeru do +8,3 kT/e jako dimeru (Rys. 2c i wkładka C, Rys. 2d i wkładka D). Obecność dobrze ustawionych reszt odpowiednich do wiązania jednoniciowych kwasów nukleinowych, jak również wzmocnione dodatnie EP (PEP) wokół obserwowanego połączenia dimerycznego silnie sugerują, że ten obszar może wiązać RNA jako dimer i sugerują, że zaburzenie tego interfejsu dimeryzacji A3G może wpływać na wiązanie RNA poprzez zakłócenie wzmocnionego PEP (Rys. 2c) do niskiego PEP jak w formie monomerycznej (Rys. 2d). 2d).

Wpływ mutacji dimeru na asocjację RNA i multimeryzację

Nasze poprzednie badania nad samą domeną CD1 sugerowały, że reszty FWKL (F126, W127, K180, L184) mogą być zaangażowane zarówno w dimeryzację, jak i wiązanie RNA, albo przez bezpośrednią interakcję z RNA, albo pośrednio przez generowanie powierzchni wiążącej RNA przez dimeryzację18. Inspekcja struktury dimeru fl rA3G ujawnia, że podczas gdy reszty FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) bezpośrednio uczestniczą w interakcjach dimeryzacyjnych (Supplementary Fig. 5A), tylko W127 jest dostępna dla pi-stackingu lub wiązania wodorowego z zasadą kwasu nukleinowego, co sugeruje, że to W127 ma krytyczną podwójną rolę w dimeryzacji lub/i wiązaniu RNA, co zostało również zasugerowane przez wcześniejsze badania mutacyjne15,18,40,48.

Pętla 7 rA3G znajduje się w pobliżu interfejsu dimeryzacji i zawiera zestaw hydrofobowych reszt (Y124, Y125, i F126), które pakują się z i prawdopodobnie stabilizują W127 (Uzupełniające Rys. 5B). Aby odpowiedzieć na pytanie, czy dimeryzacja jest potrzebna do asocjacji RNA, a także rozważyć możliwą podwójną rolę W127, zaprojektowaliśmy zestaw mutantów interfejsu dimerycznego rA3G, które pozostawiały pętlę 7 niezmienioną (Tabela uzupełniająca 3, Rys. uzupełniające 5A, B). W związku z tym, zmutowane zostały tylko reszty interfejsu poza pętlą 7, generując mutanty rM10, rM11 i rM15 (Tabela Uzupełniająca 3). Jako kontrolę włączyliśmy również mutant rM9 ze zmianami zarówno na pętli 7 jak i h6 CD1 (F126A-W127A-A187Y), który miał spowodować podobny fenotyp jak wcześniej zgłoszony mutant FWKL samego CD118; tj. zaburzenie zarówno dimeryzacji jak i asocjacji RNA. Prawie dziki typ rA3G (WT) z przełączeniem pętli zwiększającej rozpuszczalność na pętli 8 CD1 i odpowiadający mu katalitycznie nieaktywny mutant (konstrukt E/Q) również zostały uwzględnione (Tabela Uzupełniająca 3). Zbadano asocjację RNA i status oligomeryzacji tych mutantów po rekombinowanej ekspresji w E. coli.

Po oczyszczeniu kolumny powinowactwa z lizatów komórek E. coli, asocjację RNA białka fuzyjnego sumo-rA3G analizowano przez denaturującą mocznikową-PAGE (Fig. 3a-c). Podczas gdy WT i mutant E/Q (pasy 7, 8 na Rys. 3b, c) miały podobną asocjację RNA, wszystkie mutanty z interfejsem dimerowym (rM10, rM11, rM15 w pasach 2, 3, 5, odpowiednio, na Rys. 3b, c) miały znacznie zmniejszoną asocjację RNA. 3b, c) miały znacznie zmniejszoną asocjację RNA (pas 7) przed lub po potraktowaniu RNazą A, przy czym rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) i mutant kontrolny rM9 wykazywały niewiele wykrywalnego RNA po przejściu przez ten sam proces oczyszczania (pasy 1, 2, 5). Chromatografia wykluczenia rozmiaru (SEC) ujawniła, że rM10 i rM15, jak również kontrolny mutant rM9, eluowały głównie jako monomer przed i po traktowaniu RNazą A (Rys. 3d, e; Uzupełniające Rys. 6A, B), potwierdzając zaburzenie dimeryzacji/multimeryzacji. Tak więc, wyniki te sugerują, że w warunkach eksperymentalnych mutowanie reszt w obrębie interfejsu nie tylko przerywa dimeryzację, ale także wpływa na asocjację RNA, nawet gdy pętla 7 jest niezmieniona, prawdopodobnie z powodu utraty wzmocnionego PEP w wyniku przerwania dimeru (Rys. 2c, d).

Ponieważ nie mogliśmy wykonać tego samego typu badania biochemicznego, aby ocenić podobne mutacje w ludzkim A3G (hA3G) z powodu jego słabej rozpuszczalności, wygenerowaliśmy mutanta chimery rA3G-hA3G (chimera h6), w którym rA3G CD1 h6 jest zastąpiony hA3G CD1 h6 (patrz Tabela Uzupełniająca 3). Ta chimera h6 zachowywała się podobnie jak rA3G WT podczas oczyszczania pod względem dimeru/multimeryzacji przed lub po potraktowaniu RNazą A (Supplementary Fig. 7A, B), jak również asocjacji RNA, szczególnie po potraktowaniu RNazą A (Supplementary Fig. 7C, D). Warto zauważyć, że jak pokazano na Suplementarnym Rys. 7A, B, podczas gdy białko chimery H6 również przesunęło się do frakcji dimerów (D) i monomerów (M) po traktowaniu RNazą A (żel SDS-PAGE na Suplementarnym Rys. 7D), jego profil SEC wykazuje bardziej heterogeniczne piki niż profil rA3G WT, prawdopodobnie dlatego, że białko chimeryczne ma trzy reszty (Y181, I183, I187) z hA3G, które są bardziej hydrofobowe niż te w rA3G (H181, T183, A187), a zatem mniej stabilne/rozpuszczalne. Wyniki te sugerują możliwość, że CD1 h6 może być wymienny między rA3G i hA3G, co prowadzi do obecności tego samego obszaru PEP, który ma zasadniczo ten sam zestaw reszt powierzchniowych na obu białkach.

Wpływ mutacji PEP na asocjację RNA i multimeryzację

Potem zbadaliśmy, czy wzmocniona powierzchnia PEP utworzona wokół złącza dimeru (Rys. 2. wkładka b) jest ważna dla asocjacji RNA. Cztery dodatnie/biegunowe reszty skupione wokół R24 zostały zmutowane, aby wygenerować rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, Tabela Uzupełniająca 3). Uwzględniono również mutant zawierający sam R24T. Asocjacja RNA z rM12 była zmniejszona w porównaniu do R24T i WT (pasy 4, 6, 7 na Rys. 3b, c), co wskazuje na rolę tych reszt w obszarze PEP w zwiększaniu wiązania RNA. Jednakże, w porównaniu do rM9 (F126A/W127A/A187Y), rM12 nadal wykazywał znaczną ilość asocjacji RNA przed i po traktowaniu RNazą A (ścieżki 1, 4 na Rys. 3b, c), prawdopodobnie z powodu częściowego zaburzenia wiązania RNA do obszaru PEP, ale nie do innych obszarów rA3G. Nieoczekiwanie, analiza SEC ujawniła, że rM12 miał główny pik monomeryczny nawet przed traktowaniem RNazą A (Rys. 3d, e, Uzupełniające Rys. 6A, B), wskazując na zaburzenie dimeryzacji/multimeryzacji bez bezpośredniej mutacji interfejsu dimeryzacji. Ten negatywny wpływ mutacji PEP na asocjację RNA i dimeryzację/multimeryzację został dodatkowo potwierdzony przez dwa kolejne mutanty rA3G zawierające mutacje PEP, rM13 i rM14 (Tabela Dodatkowa 3, Rys. Dodatkowy 7). Te dwa mutanty wykazywały różne poziomy zaburzeń asocjacji RNA (Supplementary Fig. 7A) i dimeryzacji/multimeryzacji nawet przed traktowaniem RNazą A w badanych warunkach (profile SEC i żele na Supplementary Fig. 7C).

Interesująco, mimo że pojedynczy mutant R24T i WT wykazywały podobne ilości związanego RNA wykrywane przez żele RNA na Fig. 3b, c, szczegółowa analiza SDS-PAGE ich frakcji szczytowych SEC przed traktowaniem RNazą A ujawniła, że większość białka R24T rozprowadzonego do frakcji rozprzestrzenionych wokół monomerycznego piku (M) lokalizacji (Supplementary Fig. 6A), co jest sprzeczne z WT, który jest głównie rozprowadzany we frakcjach o objętości pustej (V). Wyniki te wskazują na zmianę zachowania RNA w zakresie asocjacji i multimeryzacji z pojedynczą mutacją R24T w obszarze PEP, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami mutacji R24A14,30,38,40. Łącznie, wyniki te pokazują, że w tych warunkach testowych, reszty w obrębie wzmocnionego obszaru PEP połączenia dimerowego (R24/S28/N176/N177) odgrywają ważną rolę w pośredniczeniu w asocjacji RNA, a asocjacja RNA przez te reszty jest odwrotnie wymagana do stabilizacji dimeryzacji i późniejszej multimeryzacji wyższego rzędu.

Wpływ mutacji PEP/dimeru na wiązanie RNA/DNA in vitro

Struktury fl rA3G ujawniają dodatkowe obszary z dodatnio naładowanymi resztami poza wzmocnionym obszarem PEP, jak pokazano na Rys. 2c. Podczas gdy te dodatnio naładowane reszty poza obszarem PEP mogą nie odgrywać głównej roli w tworzeniu stabilnych kompleksów A3G-RNA, jak zaobserwowano w lizatach komórek E. coli, mogą one nadal przyczyniać się do wiązania zdefiniowanych substratów ssRNA i ssDNA. Aby to sprawdzić, każda oczyszczona próbka białka była poddawana intensywnej obróbce RNazą w celu usunięcia jak największej ilości związanego RNA, a powinowactwo wiązania do 50 nt ssRNA lub oligomerów ssDNA było badane przy użyciu testu przesunięcia w żelu. Wszystkie mutanty wykazywały wiązanie do 50 nt ssRNA lub ssDNA, a oszacowane stałe dysocjacji (Kd, Tabela uzupełniająca 3) wskazywały, że większość mutantów miała zmniejszone wiązanie w porównaniu z WT i E/Q. Wyniki te wskazują, że w tym odtworzonym systemie, w którym obecne były wysokie stężenia białek i kwasów nukleinowych, te różne mutanty interfejsu dimeru rA3G i obszaru PEP są nadal zdolne do wiązania się z RNA i ssDNA przez inne reszty poza obszarem PEP na złączu dimeru.

Ogółem, zmniejszenie wiązania tych mutantów jest bardziej dotkliwe dla wiązania ssDNA niż wiązania RNA. Co ciekawe, test deaminazowy z użyciem oczyszczonych białek tych mutantów rA3G (rM9-rM12 i rM15) ujawnił, że te mutanty interfejsu dimeru i mutanty wiążące RNA wszystkie wykazały zmniejszoną aktywność deaminazy w porównaniu z WT (Supplementary Figure 8). Obniżone wiązanie ssDNA tych mutantów może odpowiadać, przynajmniej częściowo, za różne poziomy redukcji aktywności deaminazy. Jednakże, stopień obniżonego wiązania ssDNA nie wydaje się mieć ścisłej korelacji z poziomem zaburzenia aktywności deaminazy. Na przykład, rM12 wykazywał najniższe wiązanie ssDNA (Tabela Uzupełniająca 3), ale nie jest tym z najmniejszą aktywnością deaminazy (Uzupełniające ryc. 8).

Wpływ mutacji PEP / interfejsu dimerów na restrykcję HIV

Mutacja W127A na ludzkim A3G (hA3G) jest znana z zakłócania pakowania wirionów, a tym samym restrykcji HIV, prawdopodobnie przez zniesienie wiązania RNA pośredniczonego przez tę resztę. Jednak badania, w których indukowano pakowanie mutantów hA3G W127 poprzez fuzję peptydową Vpr, zidentyfikowały braki w ograniczaniu HIV15. Aby uzyskać dalszy wgląd w mechanizm ograniczania HIV-1 przez hA3G, zaprojektowaliśmy dodatkowe mutanty hA3G, kierując się strukturą rA3G i danymi mutacyjnymi. Intencją tych mutacji hA3G (Tabela Uzupełniająca 4) było zaburzenie wewnątrzcząsteczkowych oddziaływań CD1-CD2 (M2, M3, M4) (Uzupełniające ryc. 9A, B), zaburzenie wiązania RNA wokół złącza dimeru przez mutację rosnącej liczby polarnych / naładowanych reszt (M12, M13, M14) lub zaburzenie oddziaływań białko-białko dimeru przez mutację rosnącej liczby zakopanych reszt (M6, M10, M11) (Uzupełniające ryc. 9C).

Jak oczekiwano, WT hA3G nie miał aktywności restrykcyjnej HIV-1 w obecności Vif, ale w pełni ograniczał HIV-1 w nieobecności Vif, a konstrukt M1 (D128K) oporny na Vif w pełni ograniczał infekcję HIV z lub bez Vif (Fig. 4a-c). Z drugiej strony, mutant M9 zawierający W127A (z mutacjami F126A/W127A/I187Y, Supplementary Fig. 9C), o którym wiadomo, że zakłóca zarówno wiązanie RNA, jak i dimeryzację, nie miał aktywności restrykcyjnej niezależnie od obecności Vif (Fig. 4a-c). Jest to zgodne z wcześniejszą literaturą stwierdzającą, że W127 jest ważny dla aktywności restrykcyjnej HIV ze względu na jego zdolność wiązania RNA, która jest niezbędna do pakowania wirionów hA3G i niezależnego od deaminacji ograniczenia odwrotnej transkrypcji14,15. Rzeczywiście, mimo że jego wrażliwość na degradację Vif wydawała się być zmniejszona (Supplementary Fig. 10A), ~ 5 do 10-krotnie mniej białka mutanta M9 zostało zapakowane do wirionu w obecności lub nieobecności Vif w porównaniu do WT hA3G (Fig. 4a, b). Te wyniki WT i kontrolnych mutantów M1 i M9 hA3G wykazały pełną aktywność lub brak aktywności w naszym badaniu.

W przypadku mutantów zaprojektowanych w celu wpływania na wewnątrzcząsteczkowe interakcje CD1-CD2, wiele reszt w pobliżu lub w obrębie interfejsu między domenami po stronie CD2 zostało zmutowanych dla M2 i M3 oraz po stronie CD1 dla M4 (Supplementary Fig. 9A, B). M2 i M3 miały znacznie niższą aktywność restrykcyjną HIV-1 przy braku Vif (ryc. 4c). M2 niosący mutacje na pętlach 1 i 3 CD2 wokół interfejsu z CD1 wykazywał całkowitą utratę aktywności katalitycznej (ryc. 4e), prawdopodobnie dlatego, że niektóre z tych zmutowanych reszt, takie jak H216, są ważne dla interakcji ssDNA z substratem49. M3 niosący mutacje na interfejsie CD2 z CD1, począwszy od reszt łącznikowych R194/H195 (Supplementary Fig. 9A, B), miał tylko ~10% aktywności deaminazy WT (Fig. 4e), prawdopodobnie z powodu utraty właściwej interakcji CD2 z CD1, co wpływa na skoordynowane wiązanie substratu ssDNA dla wydajnej aktywności katalitycznej. M4 niosąca liczne mutacje wokół interfejsu międzydomenowego na CD1 wykazywała właściwości podobne do WT, wskazując, że mutacje te nie mają oczywistego wpływu na zdolność restrykcyjną. Co ciekawe, ta mutacja miała pełną aktywność katalityczną (Rys. 4e), sugerując pewną plastyczność pomiędzy interakcjami interfejsu CD1-CD2 dla funkcji.

M12 i M13 zostały zaprojektowane tak, aby zakłócić tylko wiązanie RNA do obszaru PEP na złączu dimeru, a M14 zawiera większość mutacji M12 i M13 plus cztery dodatkowe reszty R/K (K52/K63/R69/K76), aby wyeliminować pozostałą jedyną dodatnio naładowaną powierzchnię na A3G-CD1 (Uzupełniające Rys. 9C). Co zaskakujące, wszystkie te mutanty wykazywały ~70% aktywności restrykcyjnej HIV-1 w nieobecności Vif (ryc. 4c). Chociaż trudno było określić wrażliwość na Vif ze względu na utrzymujący się niski poziom ekspresji M12, M13 i M14 w teście wrażliwości na Vif (Supplementary Fig. 10A), wszystkie trzy mutanty, podobnie jak WT, nie wykazywały aktywności restrykcyjnej HIV-1 w obecności Vif (Fig. 4c), sugerując, że w rzeczywistości były one nadal wystarczająco wrażliwe na degradację mediowaną przez Vif. Przyczyną tylko 70% aktywności restrykcyjnej HIV-1 dla M12-14 nie był ich niższy poziom białka w stanie ustalonym wykryty w lizatach komórek HEK293T (Fig. 4a, b), ponieważ transfekcja mniejszej ilości plazmidu ekspresyjnego WT w celu uzyskania podobnego poziomu ekspresji komórkowej jak M12-M14 nadal powodowała ~ 4-krotnie większą restrykcję HIV-1 niż WT (Uzupełniające Fig. 10B). Jest to zgodne z niezależną od deaminacji aktywnością restrykcyjną, ponieważ te trzy mutanty miały zaburzoną aktywność deaminacji (Fig. 4d, e). Szczególnie M14 miał całkowitą utratę aktywności deaminazy (Rys. 4e). Zgodny z tym był wskaźnik mutacji tła M14 oparty na wynikach sekwencjonowania prowirusowego DNA (Tabela uzupełniająca 5). A jednak wykazywała ona ~70% aktywności restrykcyjnej wobec HIV-1. Wyniki te wyraźnie pokazują, że reszty zmutowane w M12-14 w celu zakłócenia wiązania RNA w PEP i pobliskich obszarach na CD1 wykazały tylko częściowy defekt w ograniczaniu HIV, wskazując, że zachowały pewien poziom enkapsydacji wirionu i restrykcji HIV-1, co jest w przeciwieństwie do roli wiązania RNA pośredniczonego przez mutacje zawierające W127 w mutancie M9, który jest krytyczny dla pakowania wirionu i restrykcji HIV (ryc. 4a-c).

Te mutanty, których celem było zaburzenie tylko interakcji dimer białko-białko z rosnącą liczbą mutacji, są od M6 do M11 (tabela uzupełniająca 4, uzupełniająca ryc. 9C). M6 i M7 wykazywały jedynie częściową utratę aktywności restrykcyjnej przy braku Vif, pomimo 95% utraty aktywności katalitycznej dla M7 z powodu dodatkowych trzech mutacji na CD2 (ryc. 4e). Zatem mutacje w M6 i M7 nie są krytyczne dla restrykcji HIV. M10 wykazywał cięższy fenotyp w restrykcji HIV-1 przy braku Vif, mimo że zachował pewną aktywność katalityczną (ryc. 4e), co sugeruje, że mutacje na M10 są ważne dla pakowania wirionów i restrykcji HIV. M11 jest podobny do M10 pod względem aktywności deaminazy, ale z mniej poważnym fenotypem pod względem aktywności restrykcyjnej i integracji (Fig. 4c, d). Jest możliwe, że M11 zachował większą zdolność wiązania RNA niż M10 (z rM10-11 analizy mutantów rA3G, Rys. 3a-e), co skutkuje mniej ciężkim fenotypem. Łącznie wyniki te wykazały, że mutowanie reszt w obrębie samego interfejsu dimeru białko-białko nadal zachowuje aktywność ograniczającą HIV na obniżonych poziomach (ryc. 4c), a zaburzenie aktywności deaminazy tych mutantów (ryc. 4e) może częściowo odpowiadać za zmniejszenie aktywności ograniczającej HIV. To znowu jest w przeciwieństwie do mutanta M9, który nie wykazywał aktywności restrykcyjnej HIV (Fig. 4a-c).

.