Walidacja przeciwciał

Zasoby „Centra zasobów technicznych „Zasoby techniczne przeciwciał „Walidacja przeciwciał

Nie wszystkie przeciwciała są ważne dla każdego eksperymentu i warunków, Muszą one być zwalidowane dla konkretnego zastosowania i gatunku. Obecnie nie istnieją standardowe sposoby „walidacji przeciwciał”, co może mieć ogromny wpływ na odtwarzalność i wiarygodność eksperymentów. Czasopisma i agencje przyznające dotacje podjęły kroki w celu wypełnienia tej luki. Wiele z nich stawia obecnie wymagania dotyczące wyraźnego określenia sposobu walidacji przeciwciała dla określonego zastosowania. Niestety, nie ma powszechnie akceptowanych kryteriów walidacji przeciwciał. Tak więc, to od każdego badacza zależy walidacja każdego przeciwciała pod kątem zamierzonego zastosowania.

Podstawowa walidacja

Standardowe metody walidacji przeciwciał obejmują western blot, ELISA, cytometrię przepływową i IHC. Większość badaczy dobrze czuje się z tymi wypróbowanymi i sprawdzonymi metodami. Proces walidacji może być czasochłonny, ponieważ badacz lub producent musi zwalidować przeciwciało dla każdej aplikacji. Trudność ta jest potęgowana, ponieważ warunki każdego badania są inne. Na przykład, test western blot zależy od denaturacji białek. Tak więc, przeciwciało zwalidowane metodą western blot może działać dobrze w warunkach denaturowania, ale może nie rozpoznawać antygenów w ich natywnej konformacji (tj. ELISA).1 Podobnie, przeciwciało zwalidowane dla natywnego powinowactwa do białka może nie wiązać tego samego antygenu po denaturacji lub utrwaleniu.

Powyższe metody odgrywają niezbędną rolę w walidacji przeciwciał. Jednakże, nie możemy polegać wyłącznie na tych metodach, ponieważ nie reprezentują one stale rozszerzających się zastosowań. Poziom zaufania zwalidowanych przeciwciał można zwiększyć poprzez włączenie innych technik walidacji.

Stare techniki, nowe zastosowania

Aby zaradzić niedociągnięciom podstawowej walidacji przeciwciał, grupa naukowców zebrała się ostatnio, aby „zaproponować zestaw standardowych wytycznych dotyczących walidacji przeciwciał”.2 Sugerują oni, aby oprócz podstawowych metod walidacji przeciwciał, badacze zaczęli opierać się na filarach koncepcyjnych. Należą do nich strategie genetyczne, strategie niezależnych przeciwciał i ekspresja oznaczonych białek.2

• Strategie genetyczne: CRISPR-Cas9 and More

  Strategie genetyczne składają się z technik takich jakCRISPR-Cas9, RNAi i siRNA knockdown, stosowanych w połączeniu z testem wykrywania białka. Metody te wykrywają wszelkie niespecyficzne wiązania przez dane przeciwciało po znokautowaniu lub wyłączeniu odpowiedniego genu. Jeśli przeciwciało jest specyficzne, wówczas w wybijanych lub wyłączanych liniach komórkowych nie powinien być wykrywany żaden lub powinien być wykrywany zmniejszony sygnał z przeciwciała.

• Podejście niezależnego przeciwciała

  Inną metodą, która może wykryć niespecyficzne wiązanie, jest stosowanie niezależnych przeciwciał. Podejście niezależnych przeciwciał wykorzystuje dwa różne (niezależne) przeciwciała, które wiążą ten sam antygen, ale różne epitopy. Dlatego te dwa przeciwciała powinny wykazywać ten sam wzór wykrywania i brak wiązania poza celem.2 Ta technika wymaga wielu próbek do testowania, aby kontrolować zmienną ekspresję białka docelowego, co może stać się kosztowne i czasochłonne.2 Ponadto technika walidacji opiera się na dostępności wielu przeciwciał, które rozpoznają różne epitopy na tym samym białku docelowym. GenScript oferuje łączenie epitopów w usługach mAb MonoExpress™, które obejmują „niezależne przeciwciała” dla antygenów białkowych.

• Ekspresja znakowanych białek

  Analiza wykrywania znakowanych białek docelowych może również zapewnić sposób pomiaru niespecyficznego wiązania przeciwciał. W tej metodzie, białka docelowe są modyfikowane albo znacznikiem powinowactwa (np. FLAG) albo białkiem fluorescencyjnym (np. GFP). Następnie, podobnie jak w przypadku podejścia z niezależnymi przeciwciałami, wzór wykrywania walidowanego przeciwciała jest porównywany z wzorem wykrywania przeciwciała specyficznego dla znacznika. Chociaż prosta, jednym z problemów związanych z tą metodą jest zapewnienie, że znakowane białka są wyrażane na poziomie endogenicznym, ponieważ „nadekspresja może maskować wykrywanie zdarzeń wiązania poza celem”.2

  Przeciwciała rekombinowane jako alternatywa dla przeciwciał monoklonalnych?

  Niedawne wezwanie do działania dotyczące walidacji przeciwciał sugerowało, że badacze używają wyłącznie przeciwciał rekombinowanych, a nie przeciwciał poliklonalnych lub nawet monoklonalnych. Przeciwciała monoklonalne są produkowane przy użyciu linii komórkowych hybridoma. Niestety, linie komórkowe hybridoma mogą obumierać, tracić swoje geny kodujące przeciwciała lub nie rosnąć po wyjęciu z zamrożonego magazynu.3 Ponadto, przeciwciała monoklonalne produkowane przez hybridoma mogą wiązać się z więcej niż jednym celem. Dlatego też, określenie sekwencji przeciwciała kodowanego przez hybrydomę i rekombinowana produkcja przeciwciała pokonuje te problemy. Ponadto, ze względu na określoną sekwencję, rekombinowane przeciwciała mogą zapewnić kolejną warstwę walidacji w porównaniu do stosowania wyłącznie powyższych technik.3

  Te dodatkowe metody walidacji proponują „dostarczyć dowodów, że przeciwciało wiąże swój cel, a w większości przypadków powinny również umożliwić ocenę potencjalnej reaktywności krzyżowej w testowanych warunkach”.2 Jednak stare i nowe strategie będą prawdopodobnie musiały być wykonywane w połączeniu, aby prawidłowo zwalidować przeciwciało.

Wybór odpowiedniej metody walidacji przeciwciał

Wobec wszystkich tych kwestii związanych z przeciwciałami, jak wybrać odpowiednią metodę?

Po pierwsze, należy zdecydować, w jakim badaniu będzie używane przeciwciało. Na przykład, metoda CRISPR-Cas9 nie obejmuje modyfikacji białka docelowego i potwierdza, że przeciwciało nie wykazuje reaktywności krzyżowej z innymi białkami. Można więc użyć tej techniki do walidacji przeciwciał dla szerokiej gamy badań, w tym western blot, IHC, immunocytochemii (ICC), cytometrii przepływowej, ELISA, immunoprecypitacji (IP), immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i badań białek w fazie odwróconej.2 Jednakże, z powodu trudności z ekspresją zmodyfikowanego białka, walidacja przeciwciała przy użyciu ekspresji znakowanego białka jest sugerowana tylko dla western blot, IHC, ICC i cytometrii przepływowej.

Po drugie, badacz musi być świadomy ograniczeń próbki takich metod walidacji. Na przykład, zarówno techniki CRISPR-Cas9/KO, jak i techniki ekspresji znakowanych białek nie mogą być stosowane do walidacji przeciwciał w próbkach tkanek ludzkich i płynów ustrojowych, takich jak osocze i surowica.2 Dzieje się tak, ponieważ nie można przeprowadzać manipulacji genetycznych u ludzi, w przeciwieństwie do linii komórkowych.

Na koniec, niezależnie od przeciwciała i odpowiedniej metody walidacji stosowanej przez dostawcę przeciwciał, badacz musi przeprowadzić co najmniej jedną strategię walidacji w swoim konkretnym zastosowaniu lub kontekście próbki.2

Walidacja każdego przeciwciała dla konkretnego zastosowania i gatunku jest kluczem do uzyskania powtarzalnych i wiarygodnych wyników. Informacje te pomogą w podjęciu decyzji co do wyboru odpowiednich metod do zastosowania w danym laboratorium. Aby uzyskać dalszą pomoc w zakresie walidacji przeciwciał lub innych zastosowań, odwiedź stronę GenScript Antibody Technical Resources.

Zastosowano na podstawie zawartości utworzonej przez BitesizeBio w imieniu GenScript.