Wrażliwość na antybiotyki bakterii wskaźnikowych Escherichia coli i Enterococci spp. isolated from ducks in Morogoro Municipality, Tanzania

Methods

Study area and duck sampling

This cross sectional study was conducted in Morogoro Municipality between November 2014 and March 2015 where 100 Muscovy ducks (Carina moschata) were sampled from 26 backyard flocks . Badane kaczki zostały losowo wybrane z każdego stada, gdzie próbką objęto 5-10% wielkości stada . Wśród badanych ptaków było 86 samic i 14 samców. Przed pobraniem próbek za pomocą kwestionariusza (plik dodatkowy 1) zebrano podstawowe informacje na temat zarządzania, żywienia, stosowania i usuwania niewykorzystanych antybiotyków. Wybrane kaczki zostały ręcznie skrępowane i sterylny wacik został wprowadzony do kloaki w celu pobrania materiału kałowego. Próbki przechowywano w chłodnym pudełku z lodem i przewożono do laboratorium na Uniwersytecie Rolniczym Sokoine w celu analizy. Dla zachowania spójności, dwóch badaczy po przeszkoleniu przez technologów laboratoryjnych w zakresie pobierania próbek od ptaków pobierało próbki od wszystkich 100 kaczek.

Isolacja i identyfikacja E. coli i Enterococci spp.

Próbki kału posiano na agarze MacConkey (Oxoid, Basingstoke, UK) i inkubowano przez 24 godziny w warunkach tlenowych w celu izolacji E. coli. Podejrzane kolonie były dalej identyfikowane na podstawie morfologii kolonii, barwienia metodą Grama i testów biochemicznych. W celu izolacji Enterococci spp. próbki były posiewane na agar Slanetz-Bartley (Oxoid, Basingstoke, UK) i inkubowane przez 48 h w warunkach tlenowych, a następnie identyfikowane na podstawie morfologii kolonii i testów biochemicznych. Podczas izolacji i identyfikacji, E. coli ATCC25922 i Enterococcus faecium ATCC 2912 były włączone jako szczepy kontrolne.

Wrażliwość na antybiotyki

Wszystkie izolaty E. coli i Enterococci były badane pod kątem wrażliwości na antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową i interpretowane zgodnie z CLSI . Badanie wrażliwości na antybiotyki przeprowadzono w stosunku do niektórych antybiotyków, które są powszechnie stosowane w medycynie ludzkiej w Tanzanii. Cztery antybiotyki dla E. coli testowano we wskazanych stężeniach: ampicylina 10 µg, cefotaksym 30 µg, trimetoprim-sulfametoksyna 25 µg i tetracyklina 30 µg. Enterokoki badano wobec ampicyliny 10 µg, erytromycyny 15 µg, rifampiny 5 µg, tetracykliny 30 µg i trimetoprimu-sulfametoksyny 25 µg. Wszystkie krążki z antybiotykami pochodziły z firmy Oxoid, Basingstoke, Wielka Brytania.

Uwagi etyczne

Zezwolenie na przeprowadzenie tego badania zostało udzielone przez Morogoro Municipal Livestock Officer, a zgoda etyczna na badanie została wydana przez Komisje Etyczną Sokoine University of Agriculture, Tanzania. Zgodę ustną uzyskano od każdego z rolników przed pobraniem próbek.

Wyniki

Z 100 wyhodowanych próbek kału 91% miało E. coli, z których 64 (70,3%) wykazało oporność na różne testowane antybiotyki (Tabela 1). Wielokrotne oporności na antybiotyki wykazywane przez E. coli wynosiły: 28 (30,8%) izolatów na cztery antybiotyki, 35 (38,5%) na trzy antybiotyki, 13 (14,3%) na dwa antybiotyki, 11 (12,1%) izolatów na jeden antybiotyk. Ze wszystkich próbek wyizolowano Enterococcus, z czego 42% wykazywało oporność na różne badane antybiotyki. Pięć procent izolatów Enterococcus było opornych na wszystkie antybiotyki, 13% na cztery antybiotyki, 21% na trzy antybiotyki, 26% na dwa antybiotyki i 28% na jeden badany antybiotyk. Wyniki dotyczące zarządzania kaczkami i ich możliwego dostępu do pozostałości antybiotyków podsumowano w tabeli 2. Spośród 26 rolników, z którymi przeprowadzono wywiady, 92,3% prowadziło ekstensywną hodowlę kaczek, w której miały one dostęp do miejsc wyrzucania. Nie podawano kaczkom żadnych leków weterynaryjnych, ale respondenci informowali o leczeniu innych zwierząt przy użyciu tetracyklin/oksytetracyklin.

Dyskusja

W bieżącym badaniu stwierdzono, że wskaźnik izolacji E. coli wynosił 91%, podczas gdy wszystkie kaczki były siedliskiem Enterokoków, a izolaty miały wysoki wskaźnik oporności na wiele antybiotyków. Badanie to rzuca światło, że bakterie wskaźnikowe pochodzące od kaczek wolnożyjących w Tanzanii mogą być wykorzystywane w badaniach nad opornością na antybiotyki. Sugeruje to, że problem oporności na antybiotyki jest powszechny nawet wśród bakterii izolowanych od zwierząt, które nie są poddawane antybiotykoterapii. Ma to wpływ na zdrowie publiczne, ponieważ kaczki żerują na paszy wokół obszarów zagrodowych i rozrzucają swoje odchody na wszystkie strony, a oporne bakterie mogą znaleźć drogę do łańcucha pokarmowego i wpływać na ludzi lub oporny gen może zostać przeniesiony do bakterii patogennych .

Oszacowana częstość występowania oporności na antybiotyki w E. coli wyizolowanej podczas tego badania jest porównywalna z opornością zgłoszoną w Malezji . W Nigerii odnotowano niską częstość występowania wynoszącą 8,6%, prawdopodobnie ze względu na stosowanie różnych antybiotyków, takich jak ofloksacyna, kwas nalidyksowy i gentamycyna. Wysoka częstość występowania oporności na antybiotyki zaobserwowana podczas tego badania prawdopodobnie powoduje, że kaczki są stale narażone na pozostałości antybiotyków pochodzących ze zrzutów od zwierząt i ludzi z powodu szerokiego zastosowania. Badania wykazują, że antybiotyki stosowane w żywieniu zwierząt są słabo wchłaniane w jelitach, a związki macierzyste są wydalane z kałem. Jest to poparte kilkoma badaniami, które wykazały wysoki poziom pozostałości antybiotyków w ściekach i odpadach zwierzęcych. Dlatego też normalna flora kaczek padlinożernych jest stale narażona na pozostałości antybiotyków, co powoduje rozwój oporności, jak zaobserwowano podczas tego badania.

Oporność E. coli na ampicylinę była najwyższa (81%) w porównaniu z innymi antybiotykami stosowanymi w badaniu, podobnie jak w poprzednim raporcie na Słowacji, gdzie odnotowano oporność na poziomie 87,8%. Ogólnie, badania wykazują, że 60-70% izolatów E. coli rozwinęło oporność na ampicylinę. Może to być spowodowane zbyt częstym stosowaniem ampicyliny w praktyce człowieka, której pozostałości są potencjalnym źródłem skażenia środowiska, w którym kaczki poszukują paszy. W przypadku sulfametoksyny, odnotowana oporność wynosiła 76%, tak jak poprzednio przez Van Tuat . Oporność przeciwbakteryjna wykazana przez tetracyklinę w tym badaniu wynosiła 59%, podczas gdy na Słowacji wynosiła 37,5%, a w Nigerii 75%. Co ciekawe, E. coli wykazała również oporność na cefotaksym na poziomie 63%, antybiotyk, który nie jest powszechnie stosowany w leczeniu zwierząt w Tanzanii. Kaczki mogą mieć dostęp do pozostałości cefotaksymu na wysypiskach, gdzie znajdują się ludzkie odchody i wyrzucone resztki leków (Tabela 2). Jednakże, wysoka oporność na cefotaksym została zaobserwowana u bakterii wyizolowanych z kanalizacji różnych placówek służby zdrowia .

W badaniu zaobserwowano również wielokrotną oporność E. coli na więcej niż jeden antybiotyk. Wyniki te były zbyt wysokie w porównaniu z badaniami przeprowadzonymi w Wietnamie, gdzie wielokrotna oporność E. coli na antybiotyki wynosiła 16,7% na cztery antybiotyki, na trzy antybiotyki 20%, a na dwa antybiotyki 23,3%. Takie występowanie oporności na wiele leków sugerowało, że zwierzęta hodowlane odgrywały rolę rezerwuarów opornych bakterii do skażenia środowiska. Stwierdzono, że populacje bakterii wyizolowane z jelit zwierząt narażonych na działanie antybiotyków były pięciokrotnie bardziej narażone na oporność na dany antybiotyk. Bakterie nieoporne zwykle nabywają pozachromosomalne plazmidy oporności na antybiotyki (plazmidy R) od bakterii opornych, gdy są w bliskim kontakcie. Do obserwowanej oporności może przyczyniać się nieracjonalne stosowanie antybiotyków, które powoduje odprowadzanie znacznych ilości pozostałości do środowiska. Innymi czynnikami powodującymi rozwój oporności może być łatwa dostępność i powszechne stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania w leczeniu wstępnym zakażeń nawet w placówkach służby zdrowia. Brak egzekwowania przepisów dotyczących stosowania antybiotyków jako części programów kontroli zakażeń mógł w znacznym stopniu wpłynąć na wzór wyników oporności.

Enterokoki są naturalnymi komensalami jelit ludzi i zwierząt. Wszystkie badane kaczki miały w swoich jelitach Enterococci spp., które wykazywały 42% wskaźnik oporności na różne testowane antybiotyki. Niemniej jednak, wyniki badań wykazały wysoką oporność na rifampinę (62%), ampicylinę (62%) i tetracyklinę (42%). Oporność wielolekową zaobserwowano również u ponad 65% izolatów. Jak wcześniej stwierdzono, obserwowana oporność bakterii na różne antybiotyki testowane przy braku stosowania leków u kaczek może być spowodowana pozostałościami odprowadzanymi do środowiska, w którym kaczki padlinożerne mogą łatwo ulec ekspozycji na antybiotyki i inne oporne bakterie. Kiedy oporne bakterie są w kontakcie z nieopornymi, może dojść do wymiany materiałów genetycznych i nabycia opornego genu. W innych badaniach odnotowano, że Enterococci spp. wyizolowane od kaczek wykazywały oporność na makrolidy i antybiotyki linkozamidowe. Niemniej jednak, Enterococci spp. są wewnętrznie oporne na kilka grup antybiotyków, w tym cefalosporyny i aminoglikozydy. Ponadto, wiele szczepów zawiera przenośne elementy genetyczne umożliwiające nabycie oporności na różne antybiotyki, np. tetracyklinę. Inne badania antybiotykooporności u Enterococci spp. wyizolowanych od kaczek przeprowadzono z zastosowaniem antybiotyku wankomycyny. Dalsze badania wrażliwości Enterococci spp. na wankomycynę są sugerowane w przyszłości, ponieważ antybiotyk ten jest obecnie powszechnie stosowanym lekiem w medycynie ludzkiej w Tanzanii.

Badania ankietowe dodatkowo potwierdzają obserwacje laboratoryjne dotyczące wysokiego wskaźnika oporności wykazywanego przez E. coli i Enterococcus spp. Zaobserwowano, że antybiotyki są szeroko stosowane w leczeniu zwierząt i ludzi. Niezależnie od niestosowania leków weterynaryjnych u nużeńców, ekstensywny system zarządzania padliną naraża je na kontakt ze środowiskiem z pozostałościami antybiotyków i innymi bakteriami pochodzącymi od zwierząt i ludzi, którzy przyjmowali antybiotyki. Potwierdzają to wyniki badań, z których wynika, że obserwowane oporności dotyczyły antybiotyków powszechnie stosowanych u ludzi i zwierząt (tab. 2). Bakterie opornościowe izolowano z różnych źródeł, w tym ze ścieków i środowiska. Pozostałości i pojemniki po lekach były przypadkowo usuwane w otaczającym gospodarstwo domowe środowisku, co mogło narażać kaczki na kontakt z antybiotykiem. Dlatego system intensywnego zarządzania kaczkami może pomóc zminimalizować niepotrzebne narażenie ptaków na pozostałości antybiotyków.

Wnioski

Ogólnie, oporność na antybiotyki wykazana przez E. coli i Enterococcus spp. w tym badaniu była wysoka. Wskazuje to na rolę, jaką odgrywają zwierzęta hodowlane i kurczęta, które stale przyjmują antybiotyki, jako potencjalne pierwotne źródła genów oporności na antybiotyki dla bakterii izolowanych od kaczek. Izolowanie wieloantybiotykoopornych E. coli i Enterococcus spp. od kaczek służy jako potencjalni nosiciele szczepów opornych na antybiotyki dla ludzi i stanowi poważny problem dla zdrowia publicznego.

Ograniczenia

W badaniu tym wykorzystano tylko 100 próbek kaczek pobranych z Morogoro Municipality, co ogranicza uogólnienie wyników, które mają być wykorzystane jako reprezentatywne dla statusu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe E. coli i Enterococcus spp. u kaczek w Tanzanii. Również liczba testowanych antybiotyków była niewielka. Badanie wrażliwości bakterii na antybiotyki metodą dyfuzyjno-krążkową może być gorsze od metody mikrorozcieńczeń bulionowych. W badaniu nie określono również genotypów oporności u E. coli i Enterococcus spp. na różne rodzaje antybiotyków. Niemniej jednak, obecność innych zwierząt w miejscu, w którym pobierano próbki od kaczek działa jako czynnik zakłócający wskaźniki oporności obserwowane u bakterii izolowanych od kaczek.