Zegary biologiczne

Naprzemienność dnia i nocy cyklu ziemi jest tak wiarygodne, że nie jest zaskakujące, że zwierzęta, rośliny i bakterie dostosować swoje zachowanie i fizjologię (dla przeglądu, patrz ref. 1). Rytmy okołodobowe są wszechobecną adaptacją wszystkich organizmów do najbardziej przewidywalnych wyzwań środowiskowych. Rytm biologiczny, który utrzymuje się w stałych warunkach i ma okres ≈1 dzień jest nazywany „circadian” (circa, „wokół”; dian, „dzień”).

Do niedawna, cząsteczki leżące u podstaw oscylacji pozostały nieznane. Perturbacje takich oscylacji przez inhibitory syntezy RNA lub białka sugerują, że takie cząsteczki są zaangażowane (2).

An podejście, które odniosło sukces w rozwikłaniu mechanizmów jest użycie zmian genetycznych. Pierwszym i drugim mutantem zegarowym odkrytym u muszki owocowej, Drosophila melanogaster, są geny okresu i bezczasu (3-5).

W muszce owocowej obfitość mRNA i produktów białkowych genów okresu i bezczasu cyklicznie zmienia się przez ≈24 godziny w określonych miejscach mózgu muszki (6). Maki Kaneko et al. mówili o tych putative pacemaker cells w mózgu muszki owocowej, używając tych molekularnych oscylacji jako markera (7). W dorosłej głowie, badania białek wykazały, że per ulega rytmicznej ekspresji w specyficznych miejscach, neuronach bocznych zlokalizowanych pomiędzy mózgiem centralnym a płatami wzrokowymi. Neurony boczne są uważane za komórki rozrusznikowe dla rytmu aktywności lokomotorycznej dorosłej muchy.

Kaneko i wsp. (7) wykazali, że produkty per i tim są wykrywalne w ograniczonej liczbie neuronów w mózgu larwalnym. Wzorzec ekspresji w kilku takich komórkach jest cykliczny. Wśród tych neuronów, pięć bocznie położonych komórek wykazuje ekspresję. PERIOD (PER) od wczesnego stadium larwalnego, co sugeruje, że mogą one być odpowiedzialne za utrzymywanie w czasie larwalnej eklozji i aktywności lokomoterapeutycznej. Innym interesuj±cym odkryciem jest skupisko neuronów z cykliczn± ekspresj± per i tim w antyfazie do neuronów bocznych. Wyniki te sugerują obecność wielu oscylatorów zaangażowanych w rytmy różnych procesów fizjologicznych lub behawioralnych w jednym organizmie. Kaneko i wsp. (7) opisali również anatomiczną charakterystykę schematów okablowania neuronów rozrusznikowych, wykorzystując zależną od promotora per ekspresję genu reporterowego. Takie molekularne podejście anatomiczne powinno przynieść nowy wgląd w funkcjonalne mapowanie tego systemu mózgowego. Co więcej, porównanie między komórkami zegara ssaków i much powinno wyjaśnić ewolucyjny związek między tymi systemami.

Kontrola okołodobowa transkrypcji stanowi punkt wyjścia do analizy cis-działających elementów regulacyjnych i czynników trans-działających, przez które zegar może regulować wiele ekspresji genów kontrolowanych przez zegar (6). Przyjmuje się, że te przypuszczalne cis-aktywne elementy regulacyjne, nazwane „time-box” (8), znajdują się w regionie promotora i enhancera genów kontrolowanych przez zegar. Ponadto, kontrolowany przez zegar element responsywny (6) lub time-box może regulować endogenne zjawiska fizjologiczne zachodz±ce w warunkach stałego rytmu okołodobowego. Ostatnio, możliwy kandydat na time-box został zidentyfikowany w regionie promotorowym genu period u Drosophila (9). Chociaż zaproponowano, że per pośredniczy w cyklu mRNA poprzez represję transkrypcyjną, bezpośrednia interakcja pomiędzy per a DNA jest bardzo mało prawdopodobna ze względu na brak domeny wiążącej DNA w PER. Grupa Hardina szeroko analizowała region promotorowy genu per w badaniach z użyciem transgenicznych muchówek z genem fuzyjnym per-lacZ (9). Zidentyfikowali oni okołodobowy enhancer transkrypcyjny w obrębie 69-bp fragmentu DNA zawierającego E-box upstream genu per, który jest odpowiedzialny za nocną aktywację ekspresji genu per. E-box jest znanym miejscem wiązania dla klasy czynników transkrypcyjnych basic helix-loop-helix.

Ostatnio najsilniejszym kandydatem na czynnik trans-działający w oscylatorze jest Clock, sklonowany przy użyciu strategii forward-genetic (10). Takahashi’s grupa (10) wyizolowane i analizowane locomoter działalności circadian zmutowanych szczepów myszy. Mutant Clock wykazywał długi okres staj±c się arytmicznym po kilku dniach przebywania w stałej ciemno¶ci. Takahashi i współpracownicy (10) z powodzeniem sklonowali odpowiedzialny za to gen i zidentyfikowali mutację w regionie kodującym białko genu Clock. Co ciekawe, białko Clock zawiera domenę wiążącą białko z białkiem (PAS), która znajduje się w genie per Drosophila oraz motyw basic helix-loop-helix służący do wiązania DNA. Co więcej, Takahashi i współpracownicy (10) byli w stanie całkowicie uratować długi okres i arytmiczny fenotyp myszy mutantów zegara poprzez transfer normalnego genu clock.

Ravi Allada i wsp. opisali wspólne składniki molekularne skupiające się na Clock, który jest odpowiedzialny za generowanie rytmu okołodobowego zarówno u much, jak i u ludzi (11). Allada i jego koledzy (11) badali chemicznie zmutowane muchy szukając mutantów, które zmieniają lub znoszą rytmiczność okołodobową aktywności locomoter i znaleźli nowy arytmiczny mutant, początkowo nazwany Jrk. Muszki Jrk wykazuj± niski poziom białek okresu i bezczasu z powodu obniżonego poziomu transkrypcji. Zidentyfikowano gen, który wykazuje uderzaj±c± konserwację sekwencji z genem rytmu okołodobowego ssaków, Clock; dlatego Allada i wsp. (11) nazwali ten gen dClock. Podobnie jak zegar mysi, zegar Drosophila zawiera podstawowe domeny helix-loop-helix i PAS, jak również domenę aktywacji transkrypcyjnej.

Ostatnie prace zarówno ssaków jak i much sugerują, że partnerzy białkowi CLOCK są również ewolucyjnie konserwowani (nazwani BMAL) (12, 13). Wykazano, że dimery CLOCK-BMAL wiążą się z regionem promotorowym genów period i timeless oraz transaktywują oba geny u muszek. Co więcej, ekspresja PERIOD-TIMELESS (PER-TIM) hamuje indukcję reportera przez CLOCK-BMAL. W ten sposób zaproponowano model ujemnego sprzężenia zwrotnego (ryc. 1).

W ssakach, SCN w podwzgórzu jest uważany za główny stymulator zjawisk rytmu okołodobowego, jak wykazano w wielu badaniach anatomicznych i fizjologicznych (14). Ostatnio, trzy homologi Drosophila period gene zostały zgłoszone w myszy i człowieka (15). Pomimo istnienia trzech homologów period u ssaków, które wykazują oscylację okołodobową mRNA w jądrze nadskrzyżowaniowym w mózgu myszy, nie odnotowano żadnych implikacji funkcjonalnych w zachowaniu lokomotywy okołodobowej.

Aby wyjaśnić, czy ssaków per homolog może być zaangażowany w rytm okołodobowy zachowania locomoter ssaków, grupa Ishida sklonował szczura per homolog i dokonał arytmii SCN-lesioned szczurów do monitorowania rytmów okołodobowych w tkankach obwodowych (16).

Aby sprawdzić, czy rytmiczna ekspresja szczurzego PERIOD 2 (RPER2) mRNA jest obserwowana w tkankach innych niż SCN, przeprowadzono analizę Northern blot na tkankach z oka, mózgu, serca, śledziony płuc, wątroby i nerek. Co ciekawe, wszystkie badane tkanki wykazywały rytmiczną ekspresję RPER2 mRNA, chociaż stosunek nocy do dnia był inny w każdej tkance. RPER2 zachowuje się jak ssaków homolog Drosophila okres genu (16), ponieważ jego circadian ekspresji był wysoki w nocy w całej szerokiej gamy tkanek, jak okres jest w Drosophila.

Because SCN jest uważany za zegar circadian rozrusznik u ssaków, grupa Ishida (16) przetestował, czy wielu tkanek circadian ekspresji RPER2 mRNA jest dotknięty przez SCN uszkodzenia. Co zaskakujące, rytmiczny charakter wielotkankowej ekspresji RPER2 został całkowicie zniesiony przez uszkodzenie SCN. Wielotkankowa ekspresja RPER2 jest zatem pod kontrolą SCN. Jest to pierwszy raport, który wskazuje, że wielotkankowy rytm okołodobowy jest regulowany przez zegar mózgu ssaka, SCN podwzgórza. Dane te sugerują również, że ssak per homolog (RPER2) może być zaangażowany w rytm okołodobowy zachowania locomoter u ssaków, ponieważ utrata circadian ekspresji RPER2 mRNA w całym ciele wystąpił, gdy circadian aktywność locomoter szczurów została utracona. Aby wyja¶nić ten problem, należy wytworzyć zwierzęta transgeniczne posiadaj±ce mutację typu loss-of-function lub gain-of-function w genie RPER2. Fakt, że rytmiczna ekspresja RPER2 mRNA w kilku tkankach całkowicie zależy od SCN sugeruje, że pewne sygnały s± potrzebne do koordynacyjnego utrzymania rytmu całego organizmu (ryc. 2). Badanie nad przeszczepem SCN również sugeruje znaczenie czynników humoralnych z SCN (17). Takie czynniki humoralne z SCN mogą być istotne dla generowania okołodobowej, rytmicznej ekspresji genu RPER2 w tkankach obwodowych. Wydaje się więc, podobnie jak w przypadku biologii rozwoju, że kluczowe cząsteczki tego zegara biologicznego są dobrze konserwowane pomiędzy muchami i ssakami. Wspólny mechanizm zegara molekularnego od bakterii (18) do człowieka może być przewidziany w najbliższej przyszłości.

.