PLOS ONE
Diskuse
Většina chemoterapeutik je specificky navržena tak, aby zasahovala do syntézy DNA, buněčného metabolismu a buněčného dělení. Vzhledem k tomuto způsobu účinku se očekává, že tyto léky způsobí několik typů mutací . Mutagenita chemoterapeutik vůči normálním buňkám je jedním z nejzávažnějších problémů chemoterapie vzhledem k možnosti vyvolání sekundárních malignit a abnormálních reprodukčních výsledků, jako je Downův, Klinefelterův a Turnerův syndrom. Proto je nezbytné stanovit mutagenní účinek chemoterapeutik na normální buňky. Mikrojádrový test se široce používá k měření neopraveného poškození genomu a zvýšená frekvence MN předpovídá riziko vzniku rakoviny u lidí . Vzhledem k tomu, že MN mohou být důsledkem zlomů chromozomů (klastogenicita) nebo zaostávajících chromozomů (aneugenicita), má detekce MN potenciál být použita jako screening pro indukci numerických chromozomálních aberací, pokud jsou zahrnuty testy, které umožňují identifikaci celých chromozomů uvnitř MN, jako je například test FISH.
Klastogenní aktivita epirubicinu během mitózy in vivo byla zaznamenána pomocí testu MN v kostní dřeni . V současné době nebyl původ epirubicinem indukovaných MN dosud určen. Cílem této studie proto bylo prozkoumat schopnost epirubicinu indukovat aneuploidii v somatických a zárodečných buňkách myších samců. K určení účinnosti metody byly jako pozitivní kontroly použity dva modelové mutageny, kolchicin a mitomycin C, o nichž je známo, že mají aneugenní, resp. klastogenní účinky. Zjištěné výsledky MNPCE a rozložení signálů na MN u kontroly a dvou pozitivních mutagenů v této studii dobře odpovídají publikovaným údajům , . Tyto údaje potvrdily citlivost použitého experimentálního protokolu při detekci genotoxických účinků.
Výsledky testu MN ukázaly, že epirubicin vyvolává v myší kostní dřeni in vivo na dávce závislé zvýšení tvorby MN (obr. 1) a zvýšení počtu centromericky negativně a centromericky pozitivně zbarvených MN, což svědčí o indukci klastogenity i aneugenity (obr. 2). Klastogenní i aneugenní potenciál epirubicinu v somatických buňkách může vést ke vzniku sekundárních nádorů. Výsledky klastogenity potvrzují výsledky předchozích studií in vivo, kdy bylo po léčbě epirubicinem pozorováno zvýšení tvorby MN a strukturálních chromozomálních aberací v somatických buňkách myší v podobném dávkovém rozmezí . Výsledky těchto studií se rovněž shodují s dříve popsanou indukcí mikrojader epirubicinem v myších nádorových buňkách in vitro , v erytrocytech inkubovaných slepičích vajec a v lidské lymfoblastoidní buněčné linii TK6 . Kromě toho byla dříve zaznamenána indukce strukturálních a numerických chromozomálních aberací také u pacientů s rakovinou, kteří dostávali chemoterapii obsahující epirubicin . Předchozí studie také ukázaly, že epirubicin vyvolává strukturální chromozomální aberace v kultivovaných buňkách HeLa , strukturální i numerické chromozomální aberace a výměny sesterských chromatid v buněčné linii čínského křečka a chromozomální aberace v kulturách lymfocytů periferní krve žen s rakovinou prsu léčených režimem obsahujícím epirubicin in vitro .
Studie u lidí ukázaly, že některé režimy chemoterapie zvyšují četnost aneuploidií v zárodečných buňkách , což naznačuje, že u těchto pacientů může být vyšší riziko abnormálních reprodukčních výsledků, zejména v reprodukčním věku. Proto je obecným zájmem snížit riziko vzniku aneuploidií, odhalit aneuploidie zárodečných buněk a pochopit příčinné mechanismy. V této studii byly aneuploidie v zárodečných buňkách stanoveny pomocí testu spermie-FISH se sondami DNA specifickými pro myší chromozomy 8, X a Y, z nichž každý byl označen jinou barvou. Pro určení spolehlivosti metod byl jako pozitivní kontrolní látka použit kolchicin, o němž je známo, že je převážně aneugenický, a výsledky pozitivní a negativní kontroly byly ve stejném rozmezí jako výsledky dřívějších studií , -. Tyto údaje potvrdily citlivost experimentálního protokolu při detekci aneuploidogenních účinků testovaných sloučenin.
Epirubicin je nejaktivnější v S a G2 fázi buněčného cyklu; má však určitou detekovatelnou aktivitu ve všech fázích buněčného cyklu . Často se uvádí, že chemické látky s aneugenickými vlastnostmi mohou měnit průběh buněčného dělení v meiotických i mitotických buňkách . V této studii byla pomocí testu inkorporace BrdU hodnocena doba vývoje od meiotického dělení ve spermatocytech až po epididymální spermie. Výsledky jasně ukazují, že epirubicin prodloužil dobu meiotických dělení v myších spermatocytech na 48 h (obr. 3). Tato pozorování tedy potvrzují předchozí zjištění, že epirubicinem indukovaná inhibice funkce topoizomerázy II v různých fázích buněčného cyklu zpomaluje progresi buněčného cyklu a způsobuje zastavení buněk ve fázi G2/M . Takové zastavení G2/M může být způsobeno indukcí mechanismu kontrolního bodu G2, který umožňuje opravu poškozené DNA před přechodem buněk do další fáze buněčného cyklu .
Informace in vivo o účincích epirubicinu na nedisjunkci během meiózy jsou omezené, ale některé jiné antracykliny, jako je doxorubicin a jeho derivát idarubicin, zabraňují chromozomální segregaci a vyvolávají významné zvýšení četnosti disomických a diploidních spermií . Studie in vitro navíc ukázala, že léčba kultur čínských křečků epirubicinem vyvolává numerické aberace v podobě hypodiploidie a hyperdiploidie . Kromě toho průtoková cytometrická a histologická analýza spermatogeneze myší ukázala zvýšení variačního koeficientu v histogramu DNA jako měřítka aneuploidie a zvýšení počtu diploidních spermií po léčbě epirubicinem . V souladu s výše citovanými zprávami tento experiment ukázal, že expozice epirubicinu způsobila významné zvýšení frekvence disomických a diploidních spermií v závislosti na dávce a že indukce aneuploidie byla lineárně závislá na dávce mezi 0 a 12 mg/kg epirubicinu (obr. 4). Tato pozorování in vivo jsou také v souladu s dřívější zprávou in vitro na lidských lymfocytech kultivovaných ze zdravých jedinců a pacientů s rakovinou, u nichž expozice doxorubicinu způsobila zvýšení trizomie chromozomů 7 a 17 . Ganapathi a kol. dále uvedli, že lidské leukemické buňky HL-60, které nesou monosomii 8 jako jedinou karyotypovou změnu, získaly po expozici doxorubicinu markery 7q21 . Kromě toho cytogenetické nálezy ukázaly trizomii 8 u pacientů, kteří podstoupili kurzy systémové chemoterapie s antracyklinem . Monosomie 7, 7q- a nebalancovaná translokace zahrnující chromozom 7 byly pozorovány u pacientů, kteří dostávali chemoterapii obsahující antracykliny . Kromě toho byly s chemoterapeutiky obsahujícími antracyklin spojeny strukturální chromozomální aberace chromozomů 1, 9 a 16 .
Mezi dalšími třídami inhibitorů topoizomerázy II byl dříve u myších spermatocytů studován etoposid , . Výsledky těchto studií naznačují, že etoposid působí jako genotoxická látka a po ošetření pachytenických buněk vyvolává aneuploidie především v meiotických zárodečných buňkách. Na druhé straně Kallio a Lähdetie, zjistili, že citlivost k etoposidu u myší byla největší během diplotenické diakinézy primárních spermatocytů, snížená během pozdního pachytenu a nízká během preleptotenických stadií; což je velmi odlišný vzorec než u chemických látek alkylujících DNA. Tito autoři předpokládali, že etoposid způsobuje selhání rozlišení rekombinovaných chromozomových ramen, což pravděpodobně souvisí se zástavou buněčného cyklu a spuštěním apoptotické dráhy. Marchetti et al. ve svých podrobných cytogenetických studiích uvedli, že pachyten je nejcitlivější fází spermatogeneze pro indukci strukturálních chromozomových aberací a aneuploidií. Vzhledem k tomu, že údaje Schmida et al. a údaje Kallia a Lähdetieho mohly prokázat, že etoposid prodlužuje meiotický buněčný cyklus, zdá se možné, že účinky pozorované Marchettim et al. v prvních štěpných děleních ve skupině s 24,5denním pářením mohly být ve skutečnosti indukovány v pozdějším stadiu, tj. během meiotické diakinézy, MMI nebo MMII namísto pachytenu, jak autoři předpokládali.
V současné studii jsme plánovali studii spermií-FISH, abychom zjistili, zda by subakutní léčba nízkými dávkami inhibitoru topoizomerázy II epirubicinu měla účinek, protože do léčby epirubicinem by byla zahrnuta dřívější stadia profáze. Jednotlivé dávky 0,25, 0,5 a 1 mg/kg epirubicinu byly aplikovány ve 12 po sobě následujících dnech a vzorky spermií byly odebrány 23 dní po poslední léčbě epirubicinem. Celková dávka 12 mg/kg epirubicinu aplikovaná na celou profázi meiózy významně zvýšila frekvenci disomických a diploidních spermií, zatímco celková dávka 3 a 6 mg/kg doxorubicinu byla negativní (obr. 5). Naproti tomu jednorázová dávka 6 mg/kg epirubicinu aplikovaná na spermatocyty během MMI/MMII poskytla pozitivní výsledek (obr. 4). Tyto údaje naznačují, že dřívější fáze profáze přispívají k aneuploidii vyvolané epirubicinem u mužských zárodečných buněk relativně méně.
V této studii bylo zjištěno, že epirubicin způsobil znatelné zvýšení počtu autodiploidních spermií (XX88 a YY88). Po léčbě epirubicinem byly autodiploidní spermie vzniklé zástavou MMII častější než diploidní spermie vzniklé zástavou během MMI (XY88). Druhé meiotické dělení bylo tedy citlivější na léčbu epirubicinem než první meiotické dělení. Závěr, že druhá meiotická dělení byla citlivější na léčbu epirubicinem než první meiotická dělení, podporují také pozorované frekvence disomických pohlavních chromozomů. Spermie se signály XX8 nebo YY8 byly častější než spermie se signály XY8. Tato pozorování potvrzují, že test FISH spermií na disomii nebo diploidii je schopen odhalit účinky vyvolané během obou meiotických dělení a porovnat citlivost obou meiotických dělení, jak bylo dříve uvedeno , .
Při tomto testu FISH spermií bylo zjištěno, že nejnižší pozitivní dávka způsobující disomii nebo diploidii spermií byla 6 mg/kg epirubicinu. Studie MN kostní dřeně myší však ukázaly, že expozice 3 mg/kg epirubicinu vedla k významnému zvýšení MNPCE. Toto pozorování naznačuje, že MN v kostní dřeni jsou indukovány při nižších dávkách než disomie nebo diploidie ve spermiích. Kostní dřeň je tedy citlivější tkání. Testy však měří různé koncové body. Ztráta a zlom chromozomů se měří v testu MN a nedisjunkce se zjišťuje v testu spermií-FISH. Předkládané údaje proto potvrzují obecné paradigma hodnocení nebezpečnosti, podle něhož je pozitivní výsledek MN testu v kostní dřeni ukazatelem genotoxického potenciálu sloučeniny v zárodečných buňkách. Pro účely posouzení rizik je však důležitá kvantifikace aneuploidie v zárodečných buňkách.
Inhibitory topoizomerázy DNA mají jasnou tendenci způsobovat dvouřetězcové zlomy DNA, které mají za následek především vznik centromerně negativních MN . Podobně prokázání, že epirubicin je účinným inhibitorem topoizomerázy II, naznačuje, že epirubicin vyvolává své klastogenní účinky tímto mechanismem. Metabolity epirubicinu mohou také aktivovat buňky ke zvýšení intracelulární produkce reaktivních forem kyslíku, jejichž stabilní a difúzní formy mohou poškozovat jadernou DNA . Pokud jsou buněčné opravné mechanismy přetíženy, může primární poškození DNA vést ke strukturálním nebo numerickým chromozomálním aberacím a nakonec způsobit nádory . Tuto domněnku podporuje skutečnost, že jedinci, u nichž se po léčbě prvního zhoubného novotvaru vyvinul druhý zhoubný novotvar, měli nižší schopnost opravovat dvouřetězcové zlomy DNA než ti, u nichž se druhý zhoubný novotvar nevyvinul, měřeno intenzitou γH2AX . Indukce centromer pozitivních MN epirubicinem naznačuje, že může existovat jiný mechanismus, kterým epirubicin vyvolává svůj genotoxický účinek. Toto pozorování podtrhuje význam použití modifikace FISH testu MN pro určení původu indukovaných MN. Potenciální mechanismus, kterým může epirubicin vyvolat svůj aneugenický účinek, je inhibice topoizomerázy II, která může vést k chybné segregaci chromozomů během buněčného dělení. K tomu dochází proto, že topoizomeráza II je nezbytná pro správné oddělení sesterských chromatid během buněčného dělení, přičemž v případě její nepřítomnosti dochází k nedisjunkci i zlomům DNA , . Epirubicin tedy může být schopen inhibovat dvě klíčové role topoizomerázy II; její schopnost správně segregovat nově replikované chromozomy a také její funkci při opětovném vyrovnávání přechodných dvouřetězcových zlomů DNA.
Shrnutím bylo pomocí testu FISH s centromerickou sondou DNA pro erytrocyty MN prokázáno, že epirubicin je nejen klastogenní, ale také aneugenní v somatických buňkách in vivo. Pomocí testu inkorporace BrdU bylo prokázáno, že meiotické zpoždění způsobené epirubicinem je přibližně 48 h. Pomocí analýzy spermií-FISH bylo prokázáno, že epirubicin vyvolává aneuploidie během meiózy, které mají za následek disomické spermie, stejně jako úplné meiotické zastavení, které vytváří diploidní spermie. Převaha autodiploidních (XX88, YY88) a disomických (XX8 nebo YY8) spermií naznačuje, že druhé meiotické dělení je citlivější na epirubicin než první meiotické dělení. Výsledky rovněž naznačují, že dřívější profázové fáze přispívají k aneuploidii vyvolané epirubicinem relativně méně. Klastogenní i aneugenní potenciál epirubicinu může být příčinou vzniku sekundárních nádorů a abnormálních reprodukčních výsledků u onkologických pacientů a zdravotnického personálu vystaveného lékovým režimům, které obsahují epirubicin. Ačkoli má epirubicin menší systémovou a kardiální toxicitu než doxorubicin a jiné antracykliny se stejným spektrem protinádorového účinku , má aneuploidogenní a cytotoxické účinky v nenádorových buňkách. Tento aneuploidogenní účinek léku může být zodpovědný za výskyt abnormálních reprodukčních výsledků a sekundárních nádorů, které jsou u některých pacientů s rakovinou zaznamenány někdy po úspěšné léčbě jejich primárního nádoru chemoterapií obsahující epirubicin.
.