Pochopení strukturního základu restrikce HIV-1 pomocí dvojité domény v plné délcedoménou APOBEC3G

Celkové strukturní vlastnosti fl rA3G

Hlavní překážkou při strukturních studiích fl proteinů APOBEC s dvojitou doménou byla špatná rozpustnost – formy divokého typu jsou často purifikovány buď jako nehomogenní oligomery, nebo jako velké agregáty při vyšší koncentraci. Abychom získali dobře rozpustný fl A3G pro strukturní stanovení, provedli jsme screening homologů A3G z různých druhů primátů a zjistili jsme, že A3G z opice rhesus (rA3G) má lepší rozpustnost. Dva mutační konstrukty fl rA3G (označované jako FKL a E/Q) poskytly dobře zachovalé proteiny a krystaly za různých podmínek (doplňková tabulka 1), které difraktovaly na 2,47 a 2,40 Å, (doplňkové tabulky 1 a 2, doplňkový obr. 1). Další změny v těchto dvou konstruktech zlepšily rozpustnost a výtěžnost rA3G, včetně nahrazení 8-reziduální smyčky 8 CD1 4-reziduální smyčkou 8 z hA3G-CD2 (stejně jako v obou konstruktech E/Q a FLK, Doplňková tab. 1, Doplňkový obr. 1). 1), dále mutace F126Y na smyčce 7 CD1, K180S/L184S na CD1 h6 a 8residue delece smyčky 3 CD2 (jako v konstruktu FKL, Doplňková tabulka 1, Doplňkový obr. 1B). Je třeba poznamenat, že K128 u rA3G, který funguje jako bariéra pro mezidruhový přenos, je mutován na zbytek kyseliny asparagové (D128) jako u lidského A3G (hA3G)36 . Konstrukty rovněž obsahují katalytickou mutaci E259 na Q/A, aby se zabránilo potenciální toxicitě při rekombinantní expresi proteinu. Mutované zbytky a jejich umístění na struktuře jsou uvedeny na doplňkovém obr. 1B. V obou strukturách jsou CD1 a CD2 složeny do samostatných domén spojených krátkým 5reziduálním linkerem (zbytky R194 až D198) (obr. 1a, b). Obě struktury navzdory celkové strukturní podobnosti (obr. 1a, b) vykazují zjevné rozdíly v konformacích CD2 a v orientaci balení mezi CD1 a CD2 (obr. 1c, doplňkový obr. 2A).

Obě struktury rA3G FKL a E/Q mají stejnou kanonickou strukturu CD1 a dobře se na sebe překrývají (doplňkový obr. 2B, rmsd 0,445 Å). Mnohem větší konformační rozdíly v jednotlivých doménách CD2 vedou k superpozici rmsd 0,862 Å. Při zarovnání struktur FKL a E/Q prostřednictvím jejich domény CD1 vykazuje doména CD2 struktury E/Q rotaci ~29° ve srovnání s doménou CD2 struktury FKL, což způsobuje posun domény CD2 struktury E/Q o ~15 Å směrem dolů a ~8 Å směrem k doméně CD1 a vede k mnohem těsnější interakci balení s doménou CD1 (doplňkový obr. 2 A). Celkové rozhraní mezi CD1 a CD2 má plochu pohřbeného povrchu ~623 Å2 pro strukturu FKL a ~700 Å2 pro strukturu E/Q. Těsnější zabalení CD1-CD2 ve struktuře E/Q vede pouze k mírně větší ploše pohřbeného povrchu než u struktury FKL, pravděpodobně kvůli přeložení a chybějící hustotě rozhraní lokalizujícího strukturní prvky (h2-smyčka3) jeho CD2.

Dva typy interakcí domén CD1 a CD2

Zatímco struktura FKL ukazuje kanonické skládání své domény CD2 (doplňkový obr. 2C), struktura E/Q vykazuje významné změny v konformaci CD2 (doplňkový obr. 2D) s hlavními změnami na šroubovici 2 (h2), smyčce 3, smyčce 4 a Zn-aktivním centru. Dlouhý h2 CD2 ve struktuře FKL (doplňkový obr. 2C) se ve struktuře E/Q (doplňkový obr. 2D) změnil na krátkou 310 šroubovici (h2′), což má za následek neuspořádaný 14-reziduální úsek zahrnující části smyčky 3 a h2 (zbytky A246 až E259) (doplňkový obr. 1A). Posun ke krátké 310 h2 a prodloužené struktuře náhodné cívky je nutný, aby se zabránilo střetu v této konformaci těsného balení (obr. 1e). Tím se však také naruší konformace Zn-aktivního centra CD2 v oblastech h2 a smyčky 3, které se stanou neuspořádanými, což vede k tomu, že nedochází ke koordinaci Zn (Doplňkový obr. 2D). Absence Zn-koordinace je pozorována pouze u jednoho dalšího APOBEC, struktury CD2 APOBEC3F (A3F)46,47 . Struktury A3F-CD2 s obsahem Zn nebo bez něj jsou však v podstatě identické, což se dobře shoduje i s několika dalšími strukturami APOBEC (doplňkový obr. 2E), zatímco E/Q CD2 je unikátní svými přeloženými h2-smyčkami 3 a 4 a konformací se Zn-centrem (doplňkový obr. 2E). 2E, F).

Přestože je možné, že ztráta Zn a přeložení CD2 ve struktuře E/Q mohou být důsledkem mutací v tomto konstruktu, zkoumali jsme, zda má varianta E/Q defektní katalytickou aktivitu. Reverze E259Q v konstruktu E/Q zpět na WT katalytickou E259 (konstrukt E/Q*) vrátila variantě plnou aktivitu v deaminačním testu s použitím expresních lyzátů buněk HEK293T (doplňkový obr. 3). Kromě toho je E/Q* nesoucí jednotlivé mutace F126Y, K180S/L184S nebo CD2Δloop3 (jako ve struktuře FKL) aktivní, i když aktivita konstruktu FKL* (s E259A vrácenou zpět na E259) s kombinovanými mutacemi je nižší než E/Q* a WT. Tyto výsledky naznačují, že i když krystalizovaná struktura E/Q, postrádající Zn v doméně CD2, představuje katalyticky neaktivní strukturní stav A3G, navrácení katalytického zbytku zpět na E259 může plně obnovit její deaminázovou aktivitu srovnatelnou s WT. Kombinované mutace v FKL částečně ovlivňují její katalytickou aktivitu.

Vzhledem k rozdílu ~29° v relativním úhlu rotace v balení mezi jednotlivými doménami ve strukturách FKL a E/Q se detailní molekulární interakce mezi CD1 a CD2 v obou strukturách liší. Domény CD1 a CD2 ve struktuře FKL spolu interagují především prostřednictvím h3, h4 a smyčky 7 CD1 a h1, h2, β2 a smyčky 3 CD2 (obr. 1a, d). Ve struktuře E/Q interagují obě domény především prostřednictvím h3, h4 a h6 CD1 s h2′, β2, smyčkou 4 a smyčkou 10 CD2 (obr. 1b, e). V důsledku toho se přibližně 40 % interagujících zbytků mezi CD1 a CD2 v obou strukturách liší (viz úplný seznam interagujících zbytků na doplňkovém obr. 4), a i když se této interakce účastní stejná rezidua, často vytvářejí různé vazebné kontakty v důsledku změny úhlu balení mezi oběma doménami. Schopnost zabalit domény CD1 a CD2 s různými úhly a interakcemi zbytků naznačuje určitý stupeň plasticity v uspořádání domén fl A3G.

Dimer rA3G v plné délce a vlastnosti dimerizační oblasti

Konstrukt E/Q byl krystalizován za různých podmínek pH a soli (Doplňková tabulka 1), ale konzistentně vykazoval stejnou strukturu a dimerizaci prostřednictvím interakcí CD1-CD1 (obr. 1). 2a, b), především prostřednictvím přímého nabalování několika zbytků na h6 (K180, L184, A187), smyčce 1 (I26) a smyčce 7 (F126, W127) z obou podjednotek (doplňkový obr. 5A, B). Je zajímavé, že tyto interakce jsou totožné s interakcemi, které byly dříve popsány pouze pro doménu rA3G-CD118 , a to i přes zahrnutí mutace K128D, která je kritická pro změnu rA3G z HIV-1 Vif necitlivé na citlivou k degradaci. Stojí za povšimnutí, že taková dimerizace fl rA3G vede pouze k malému zvětšení největšího rozměru z 85 Å monomeru na 95 Å dimeru (obr. 2a, b).

Detailní zkoumání zbytků zarovnaných na obou stranách oblasti dimerního rozhraní odhaluje dva významné rysy. Za prvé, celkem 18 pozitivně/polárních a hydrofobních zbytků je kolem dimerního spojení rA3G uspořádáno způsobem vhodným pro interakci s jednovláknovými nukleovými kyselinami, jako je RNA (vložka B na obr. 2). Těchto 18 zbytků je uspořádáno do dvou sad, přičemž první sada ve směru hodinových ručiček začíná od horního monomeru (zeleně) R24, H181, N177, N176, K180 a pokračuje ke spodnímu monomeru (světle modře) W127, Y125, Y124 a S28 a poté zrcadlovou sadou stejných zbytků. Za druhé, díky dimerizaci jsou R24 a blízké pozitivní zbytky K180 a H181 každého monomeru umístěny těsně v prostoru, přičemž vzdálenost mezi dvěma zbytky R24 je přibližně 7 Å. Toto prostorové uspořádání výrazně zvyšuje lokální elektrostatické potenciály (EP) z přibližně +1,9 kT/e jako monomeru na +8,3 kT/e jako dimeru (obr. 2c a vložka C, obr. 2d a vložka D). Přítomnost dobře zarovnaných zbytků vhodných pro vazbu jednovláknových nukleových kyselin, jakož i zvýšený kladný EP (PEP) kolem pozorovaného dimerního spojení silně naznačují, že tato oblast může vázat RNA jako dimer, a naznačují, že narušení tohoto dimerizačního rozhraní A3G může mít vliv na vazbu RNA prostřednictvím narušení zvýšeného PEP (obr. 2c) na nízký PEP jako v monomerní formě (obr. 2c). 2d).

Vliv mutace dimeru na asociaci a multimerizaci RNA

Naše předchozí studie týkající se samotné domény CD1 naznačila, že zbytky FWKL (F126, W127, K180, L184) na rozhraní dimeru se mohou podílet jak na dimerizaci, tak na vazbě RNA, a to buď přímou interakcí s RNA, nebo nepřímo vytvářením vazebného povrchu RNA prostřednictvím dimerizace18. Kontrola struktury dimeru fl rA3G ukazuje, že zatímco zbytky FWKLA (F126, W127, K180, L184, A187) se přímo účastní dimerizačních interakcí (doplňkový obr. 5A), pouze W127 je přístupný pro pi-stacking nebo vodíkovou vazbu s bází nukleové kyseliny, což naznačuje, že právě W127 má kritickou dvojí roli v dimerizaci a/nebo vazbě na RNA, což naznačily i předchozí mutační studie15,18,40,48 .

Smyčka 7 rA3G se nachází v blízkosti dimerizačního rozhraní a obsahuje sadu hydrofobních zbytků (Y124, Y125 a F126), které se pakují s W127 a pravděpodobně jej stabilizují (doplňkový obr. 5B). Abychom zjistili, zda je dimerizace nutná pro asociaci RNA, a abychom také zvážili možnou dvojí roli W127, navrhli jsme sadu mutantů dimerního rozhraní rA3G, které ponechaly smyčku 7 beze změny (Doplňková tabulka 3, Doplňkové obr. 5A, B). Mutovány tak byly pouze pohřbené zbytky rozhraní mimo smyčku 7, čímž vznikly mutanty rM10, rM11 a rM15 (Doplňková tabulka 3). Jako kontrolu jsme zařadili také mutant rM9 se změnami na smyčce 7 i h6 CD1 (F126A-W127A-A187Y), který měl vést k podobnému fenotypu jako dříve popsaný mutant FWKL samotného CD118; tj. k narušení dimerizace i asociace RNA. Zařazen byl také téměř divoký typ rA3G (WT) s přepnutím smyčky zvyšující rozpustnost na smyčce 8 CD1 a jeho odpovídající katalyticky neaktivní mutant (konstrukt E/Q) (doplňková tabulka 3). Byla zkoumána asociace RNA a stav oligomerizace těchto mutantů po rekombinantní expresi v E. coli.

Po purifikaci na afinitní koloně z buněčných lyzátů E. coli byla analyzována asociace RNA fúzního proteinu sumo-rA3G pomocí denaturační močovina-PAGE (obr. 3a-c). Zatímco WT a mutant E/Q (dráhy 7, 8 na obr. 3b, c) měly podobnou asociaci RNA, všechny mutanty s dimerním rozhraním (rM10, rM11, rM15 v dráhách 2, 3, 5, resp. na obr. 3b, c) měly podobnou asociaci RNA. 3b, c) měly výrazně sníženou asociaci RNA (pruh 7) před nebo po ošetření RNázou A, přičemž rM10 (T183D-L184D-A187Y), rM15 (I26A-K180S-L184S-A187E) a kontrolní mutant rM9 vykazovaly málo detekovatelnou RNA poté, co prošly stejným procesem purifikace (pruhy 1, 2, 5). Chromatografie s vyloučením velikosti (SEC) odhalila, že rM10 a rM15, stejně jako kontrolní mutantní rM9, se eluovaly převážně jako monomer před a po ošetření RNázou A (obr. 3d, e; doplňkový obr. 6A, B), což potvrzuje narušení dimerizace/multimerizace. Tyto výsledky tedy naznačují, že za experimentálních podmínek mutace zbytků pohřbených v rozhraní nejen narušuje dimerizaci, ale také ovlivňuje asociaci RNA, i když je smyčka 7 nezměněna, pravděpodobně v důsledku ztráty zvýšeného PEP v důsledku narušení dimeru (obr. 2c, d).

Protože jsme nemohli provést stejný typ biochemického testu k posouzení podobných mutantů u lidského A3G (hA3G) kvůli jeho špatné rozpustnosti, vytvořili jsme mutantní chiméru rA3G-hA3G (h6 chiméra), ve které je rA3G CD1 h6 nahrazen hA3G CD1 h6 (viz doplňková tabulka 3). Tato chiméra h6 se během purifikace chovala podobně jako rA3G WT, pokud jde o dimer/multimerizaci před ošetřením RNázou A nebo po něm (doplňkové obr. 7A, B) a také o asociaci RNA, zejména po ošetření RNázou A (doplňkové obr. 7C, D). Stojí za povšimnutí, že jak je ukázáno na Doplňkových obr. 7A, B, zatímco protein H6 chiméry se po ošetření RNázou A také posunul do dimerní (D) a monomerní (M) frakce (SDS-PAGE gel na Doplňkových obr. 7A, B), protein H6 se po ošetření RNázou A posunul do dimerní (D) a monomerní (M) frakce. 7D), jeho SEC profil vykazuje heterogennější píky než profil rA3G WT, pravděpodobně proto, že chimérický protein má tři zbytky (Y181, I183, I187) z hA3G, které jsou hydrofobnější než zbytky v rA3G (H181, T183, A187), a tudíž méně stabilní/rozpustné. Tyto výsledky naznačují možnost, že CD1 h6 může být zaměnitelný mezi rA3G a hA3G, což vede k přítomnosti stejné oblasti PEP, která má v podstatě stejný soubor povrchových zbytků na obou proteinech.

Vliv mutace PEP na asociaci a multimerizaci RNA

Poté jsme zkoumali, zda je pro asociaci RNA důležitý zvýšený povrch PEP vytvořený kolem dimerního spojení (obr. 2. Vložka b). Čtyři pozitivní/polární zbytky soustředěné kolem R24 byly mutovány za účelem vytvoření rM12 (R24T-S28A-N176A-N177D, doplňková tabulka 3). Byl zahrnut také mutant obsahující pouze R24T. Asociace rM12 s RNA byla snížena ve srovnání s R24T a WT (dráhy 4, 6, 7 na obr. 3b, c), což naznačuje úlohu těchto zbytků v oblasti PEP při zvyšování vazby RNA. Ve srovnání s rM9 (F126A/W127A/A187Y) však rM12 stále vykazoval značné množství vazby RNA před a po ošetření RNázou A (dráhy 1, 4 na obr. 3b, c), pravděpodobně v důsledku částečného narušení vazby RNA na oblast PEP, ale ne na jiné oblasti rA3G. Analýza SEC nečekaně odhalila, že rM12 měl hlavní monomerní pík i před ošetřením RNázou A (obr. 3d, e, doplňkový obr. 6A, B), což naznačuje narušení dimerizace/multimerizace bez přímé mutace dimerizačního rozhraní. Tento negativní vliv mutace PEP na asociaci RNA a dimerizaci/multimerizaci byl dále potvrzen dalšími dvěma mutanty rA3G obsahujícími mutace PEP, rM13 a rM14 (Doplňková tabulka 3, Doplňkový obr. 7). Tyto dva mutanty vykazovaly různou míru narušení asociace RNA (Doplňkový obr. 7A) a dimerizace/multimerizace ještě před ošetřením RNázou A za testovaných podmínek (profily SEC a gely na Doplňkovém obr. 7C).

Zajímavé je, že přestože jediný mutant R24T a WT vykazovaly podobné množství asociované RNA zjištěné pomocí gelů RNA na obr. 7A a WT na obr. 7C. 3b, c, podrobná analýza SDS-PAGE jejich frakcí s píkem SEC před ošetřením RNázou A odhalila, že většina proteinu R24T je distribuována do frakcí rozložených kolem místa monomerního píku (M) (Doplňkový obr. 6A), což je v rozporu s WT, který je většinou distribuován ve frakcích s prázdným objemem (V). Tyto výsledky naznačují změnu asociačního a multimerizačního chování RNA s jedinou mutací R24T v oblasti PEP, což je v souladu s předchozími studiemi mutací R24A14,30,38,40. Celkově tyto výsledky ukazují, že za těchto testovacích podmínek hrají zbytky v rozšířené PEP oblasti dimerního spojení (R24/S28/N176/N177) důležitou roli při zprostředkování asociace RNA a asociace RNA přes tyto zbytky je naopak nutná pro stabilizaci dimerizace a následnou multimerizaci vyššího řádu.

Vliv mutací PEP/diméru na vazbu RNA/DNA in vitro

Struktury fl rA3G odhalují další oblasti s kladně nabitými zbytky mimo zvýšenou oblast PEP, jak ukazuje obr. 2c. I když tato kladně nabitá rezidua mimo oblast PEP nemusí hrát hlavní roli při tvorbě stabilních komplexů A3G-RNA, jak bylo pozorováno z buněčných lyzátů E. coli, mohou přesto přispívat k vazbě definovaných substrátů ssRNA a ssDNA. K ověření této skutečnosti byl každý purifikovaný vzorek proteinu podroben rozsáhlému ošetření RNázou, aby se odstranilo co nejvíce navázané RNA, a vazebná afinita k 50 nt ssRNA nebo ssDNA oligomerům byla testována pomocí testu gelového posunu. Všechny mutanty vykazovaly vazbu na 50 nt ssRNA nebo ssDNA a odhadnuté disociační konstanty (Kd, doplňková tabulka 3) ukázaly, že většina mutantů měla sníženou vazbu ve srovnání s WT a E/Q. Tyto výsledky naznačují, že v tomto rekonstituovaném systému, kde byly přítomny vysoké koncentrace proteinů a nukleových kyselin, jsou tyto různé mutanty rA3G na rozhraní dimeru a v oblasti PEP stále schopny vázat RNA a ssDNA prostřednictvím jiných zbytků mimo oblast PEP na spojení dimeru.

Obecně je snížení vazby těchto mutantů závažnější pro vazbu ssDNA než pro vazbu RNA. Zajímavé je, že deaminázový test s použitím purifikovaných proteinů těchto mutantů rA3G (rM9-rM12 a rM15) ukázal, že všechny tyto mutanty na rozhraní dimerů a mutanty vázající RNA vykazují sníženou deaminázovou aktivitu ve srovnání s WT (doplňkový obrázek 8). Snížená vazba ssDNA u těchto mutantů by mohla alespoň částečně vysvětlit různé úrovně snížení deaminázové aktivity. Nezdá se však, že by stupeň snížené vazby ssDNA striktně koreloval s úrovní narušení deaminázové aktivity. Například rM12 vykazoval nejnižší vazbu ssDNA (Doplňková tabulka 3), ale není to ten s nejnižší deaminázovou aktivitou (Doplňkový obr. 8).

Vliv mutací rozhraní PEP/dimer na restrikci HIV

Je známo, že mutace W127A na lidském A3G (hA3G) narušuje balení virionu, a tím i restrikci HIV, pravděpodobně zrušením vazby RNA zprostředkované tímto zbytkem. Studie, které vyvolaly balení mutantů hA3G W127 pomocí fúze peptidů Vpr, však zjistily nedostatky v restrikci HIV15. Abychom získali další poznatky o mechanismu restrikce HIV-1 pomocí hA3G, navrhli jsme další mutanty hA3G na základě struktury rA3G a mutačních údajů. Záměrem těchto mutací hA3G (doplňková tabulka 4) bylo narušit intramolekulární interakce CD1-CD2 (M2, M3, M4) (doplňkový obr. 9A, B), narušit vazbu RNA kolem dimerního spojení mutací zvyšujícího se počtu polárních/nabitých zbytků (M12, M13, M14) nebo narušit interakce protein-protein dimeru mutací zvyšujícího se počtu pohřbených zbytků (M6, M10, M11) (doplňkový obr. 9A, B). 9C).

Podle očekávání neměl WT hA3G žádnou restrikční aktivitu vůči HIV-1 v přítomnosti Vif, ale plně omezoval HIV-1 v nepřítomnosti Vif a konstrukt M1 (D128K) rezistentní vůči Vif plně omezoval infekci HIV s Vif i bez něj (obr. 4a-c). Naproti tomu mutant M9 obsahující W127A (s mutacemi F126A/W127A/I187Y, doplňkový obr. 9C), o němž je známo, že narušuje vazbu RNA i dimerizaci, neměl žádnou restrikční aktivitu bez ohledu na přítomnost Vif (obr. 4a-c). To je v souladu s předchozí literaturou, která uvádí, že W127 je důležitý pro restrikční aktivitu HIV kvůli své schopnosti vázat RNA, která je nezbytná pro balení virionu hA3G a restrikci reverzní transkripce nezávislou na deaminaci14,15 . Skutečně, i když se zdálo, že jeho citlivost k degradaci Vif je snížena (doplňkový obr. 10A), v přítomnosti nebo nepřítomnosti Vif bylo do virionu zabaleno ~5- až 10krát méně mutantního proteinu M9 ve srovnání s WT hA3G (obr. 4a, b). Tyto výsledky WT a kontrolních mutantů M1 a M9 hA3G prokázaly v naší studii plnou nebo nedostatečnou aktivitu

U mutantů navržených tak, aby ovlivňovaly intramolekulární interakce CD1-CD2, bylo u M2 a M3 mutováno několik zbytků v blízkosti nebo uvnitř mezidoménového rozhraní na straně CD2 a u M4 na straně CD1 (doplňkový obr. 9A, B). M2 i M3 měly v nepřítomnosti Vif výrazně nižší restrikční aktivitu HIV-1 (obr. 4c). M2 nesoucí mutace na smyčkách CD2 1 a 3 kolem rozhraní s CD1 vykazovala úplnou ztrátu katalytické aktivity (obr. 4e), pravděpodobně proto, že některá z těchto mutovaných reziduí, například H216, jsou důležitá pro interakci se substrátem ssDNA49. M3 nesoucí mutace na rozhraní CD2 s CD1, počínaje linkerovými zbytky R194/H195 (doplňkový obr. 9A, B), měla pouze ~10 % WT deaminasové aktivity (obr. 4e), pravděpodobně v důsledku ztráty správné interakce CD2 s CD1, která ovlivňuje koordinovanou vazbu ssDNA substrátu pro účinnou katalytickou aktivitu. M4 nesoucí více mutací v okolí interdoménového rozhraní na CD1 vykazovala podobné vlastnosti jako WT, což naznačuje, že tyto mutace nemají zjevný vliv na restrikční schopnost. Zajímavé je, že tato mutace měla plnou katalytickou aktivitu (obr. 4e), což naznačuje určitou plasticitu mezi interakcemi na rozhraní CD1-CD2 pro funkce.

M12 a M13 byly navrženy tak, aby narušily pouze vazbu RNA na oblast PEP na spojnici dimerů, a M14 obsahuje většinu mutací M12 a M13 plus čtyři další R/K zbytky (K52/K63/R69/K76), aby se odstranil zbývající jediný kladně nabitý povrch na A3G-CD1 (doplňkový obr. 9C). Překvapivě všechny tyto mutanty vykazovaly ~70% restrikční aktivitu HIV-1 v nepřítomnosti Vif (obr. 4c). Přestože bylo obtížné kvantifikovat citlivost na Vif kvůli přetrvávající nízké úrovni exprese M12, M13 a M14 v testu citlivosti na Vif (doplňkový obr. 10A), všechny tři mutanty, podobně jako WT, nevykazovaly v přítomnosti Vif žádnou restrikční aktivitu HIV (obr. 4c), což naznačuje, že byly ve skutečnosti stále dostatečně citlivé na degradaci zprostředkovanou Vif. Důvodem pouze 70% restrikční aktivity HIV-1 u M12-14 nebyly jejich nižší hladiny proteinů v ustáleném stavu zjištěné v buněčných lyzátech HEK293T (obr. 4a, b), protože transfekce menšího množství expresního plazmidu WT k dosažení podobných hladin buněčné exprese jako u M12-M14 stále vedla k ~4krát vyšší restrikci HIV-1 oproti WT (doplňkový obr. 10B). To je v souladu s restrikční aktivitou nezávislou na deaminaci, protože tyto tři mutanty měly narušenou deaminační aktivitu (obr. 4d, e). Zejména u M14 došlo k úplné ztrátě deaminázové aktivity (obr. 4e). Tomu odpovídala i míra mutací v pozadí u M14 na základě výsledků sekvenování provirové DNA (Doplňková tabulka 5). A přesto vykazovala ~70% restrikční aktivitu HIV-1. Tyto výsledky jasně ukazují, že zbytky mutované v M12-14, které narušují vazbu RNA v PEP a blízkých oblastech na CD1, vykazovaly pouze částečný defekt v restrikci HIV, což naznačuje, že si zachovaly určitou úroveň zapouzdření virionu a restrikce HIV-1, což je v kontrastu s úlohou vazby RNA zprostředkované mutacemi obsahujícími W127 v mutantu M9, která je kritická pro zapouzdření virionu a restrikci HIV (obr. 1). 4a-c).

Tyto mutanty určené k narušení pouze interakcí protein-proteinový dimer se zvyšujícím se počtem mutací jsou od M6 po M11 (doplňková tabulka 4, doplňkový obr. 9C). M6 a M7 vykazovaly pouze částečnou ztrátu restrikční aktivity v nepřítomnosti Vif, a to i přes 95% ztrátu katalytické aktivity u M7 v důsledku dalších tří mutací na CD2 (obr. 4e). Mutace v M6 a M7 tedy nejsou pro restrikci HIV kritické. M10 vykazovala závažnější fenotyp při restrikci HIV-1 v nepřítomnosti Vif, i když si zachovala určitou katalytickou aktivitu (obr. 4e), což naznačuje, že mutace na M10 jsou důležité pro balení virionu a restrikci HIV. M11 je podobná M10 v deaminázové aktivitě, ale s méně závažným fenotypem z hlediska restrikční aktivity a integrace (obr. 4c, d). Je možné, že si M11 zachovala větší schopnost vázat RNA než M10 (z analýzy rM10-11 mutantů rA3G, obr. 3a-e), což vedlo k méně závažnému fenotypu. Celkově tyto výsledky ukázaly, že samotná mutace zbytků uvnitř pohřbeného rozhraní protein-protein-dimer stále zachovává restrikční aktivitu HIV na snížené úrovni (obr. 4c) a narušení deaminázové aktivity těchto mutantů (obr. 4e) může částečně vysvětlovat snížení restrikční aktivity HIV. To je opět v kontrastu s mutantem M9, který nevykazoval žádnou restrikční aktivitu HIV (obr. 4a-c).

.