A Aproximação Mais Precisa à Detecção de Amiloides e Subtipagem: Combinando Coloração Vermelha e Imunohistoquímica do Congo in situ

Abstract

Amyloidose é o resultado de várias doenças de abordagem diferente. É vital para subtipo os depósitos amilóides a fim de estabelecer e finalmente tratar a doença subjacente de forma adequada. Além da coloração clássica com vermelho Congo, outros procedimentos como a coloração imuno-histoquímica são necessários para a classificação. Aqui, apresentamos uma abordagem mais precisa usando a coloração vermelha/imunohistoquímica dupla do Congo facilmente aplicável em diagnósticos de rotina. Foram necessárias modificações da técnica de coloração vermelha Congo e dos procedimentos imunohistoquímicos para combinar ambos os procedimentos de coloração em uma lâmina. A avaliação foi feita usando microscopia convencional de luz e fluorescência. Encurtando o tempo de coloração do vermelho Congo para 10 s e modificando o bloqueio endógeno da peroxidase, foi possível obter resultados precisos para avaliar a coloração dupla Congo red/imunohistoquímica usando um microscópio de fluorescência. Seções de 2 μm ao invés de 4 μm de espessura foram superiores para avaliação, uma vez que aumentaram a especificidade da coloração. A combinação de vermelho Congo e imunohistoquímica como coloração dupla in situ em uma lâmina é uma abordagem viável no diagnóstico de amiloidose. Ela permite focar nas áreas fluorescentes do vermelho Congo vermelho-positivo ao avaliar a imunohistoquímica, evitando assim a assinatura de resultados falso-positivos. Adicionalmente, aumenta a relação sinal/ruído dos cortes imunohistoquímicos corados em microscopia convencional.

© 2016 S. Karger AG, Basel

Introdução

Amyloidose é a descrição morfológica da deposição de proteínas dobradas erradamente que podem ser encontradas em muitos tipos diferentes de tecido . As proteínas que formam amilóide são derivadas de uma infinidade de fontes, que vão desde tumores, como neoplasias de plasmócitos ou carcinomas medulares da tiróide, até infecções crônicas, ou são vistas como resultado do envelhecimento. Em casos raros, a amiloidose é devida a distúrbios de desdobramento proteico herdados geneticamente. A importância clínica da amiloidose vai desde o achado incidental em autópsias até doenças que ameaçam a vida. Ao examinar amostras de tecidos, é importante que os patologistas tenham em mente a semelhança dos depósitos de amiloides, pois esta pode ser a primeira pista para uma doença grave subjacente ainda desconhecida. É importante ressaltar que, embora existam resultados promissores em relação às terapias que visam os próprios depósitos amilóides, as abordagens de tratamento na amiloidose ainda visam principalmente a desordem subjacente e, na maioria dos casos, esta, por sua vez, pode e deve ser determinada com base na subtipização amilóide.

A coloração histoquímica clássica para a amiloidose é o vermelho Congo, como introduzido por Bennhold em 1922; a típica birefringência “verde maçã” usando polarização foi descrita pela primeira vez em 1927. A fim de aumentar a sensibilidade e especificidade da coloração vermelha do Congo, vários métodos têm sido usados, incluindo a avaliação de secções do Congo manchadas de vermelho pela luz fluorescente, devido às propriedades fluorescentes conhecidas do vermelho Congo. Recentemente, abordagens usando uma técnica de polarização de hematoxilina-eosina reforçada digitalmente foram propostas para detecção de amilóide, sendo particularmente úteis na identificação de amilóide em casos com tecido escaneado disponível.

O padrão ouro para subtipagem de amilóide é a imunohistoquímica, incluindo vários protocolos bem estabelecidos; entretanto, há algumas falhas, especialmente considerando a menor especificidade dos anticorpos contra a cadeia de luz lambda amiloidogênica. Uma nova abordagem para subtipagem especialmente raras variantes de amiloidose é a espectrometria de massa; infelizmente, devido a questões de custo e disponibilidade, este promissor método não tem sido amplamente utilizado até agora, com uma falha adicional sendo sua óbvia limitação em casos com tecido escancarado disponível ou com quantidade limitada de amilóide depositado. Outra conquista recente é o uso de microscopia imunoeletrônica de aspirados de gordura abdominal para subtipagem de depósitos amilóides; entretanto, este é um método sofisticado.

Estudos posteriores posteriores focalizaram-se na combinação de fluorescência e imunohistoquímica. Aqui, apresentamos evidências adicionais para a praticabilidade de tal abordagem e relatamos um protocolo facilmente traduzível em rotina, o que nos permitiu abordar com precisão a subtipização amilóide em tecidos fixados em formol e incluídos em parafina. A coloração dupla vermelho/imunohistoquímica do Congo permite focar nas áreas vermelho-positivas do Congo ao avaliar a imunohistoquímica e aumenta a relação sinal/ruído dos cortes imunohistoquímicos na avaliação microscópica convencional por luz, melhorando tanto a especificidade e sensibilidade do procedimento como reduzindo a quantidade de tecido necessária para o diagnóstico.

Materiais e Métodos

Selecção de Casos

Espécimens com diagnóstico comprovado de amiloidose do nosso arquivo foram utilizados para estabelecer a nova técnica. Eles estão listados na tabela 1 incluindo os passos para os quais o respectivo tecido foi utilizado.

Atuações de coloração vermelha do Congo

A coloração vermelha do Congo foi inicialmente realizada de acordo com o protocolo estabelecido no nosso instituto: o tecido fixado em formol e incluído em parafina é cortado em secções de 6-μm de espessura, desparafinizado e tingido com vermelho Congo durante 30 min – 2.5 g de vermelho Congo (Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha) e 1 g de hidróxido de potássio (Merck Millipore) dissolvido em 500 ml de etanol a 80%; depois disso, as seções são enxaguadas com água da torneira antes de serem contrabalançadas com hematoxilina (Merck Millipore) por 4 min. Em uma próxima etapa, as seções são diferenciadas em solução 0,5% de HCl/etanol e enxaguadas novamente com água da torneira por 10 min antes de serem desidratadas e montadas.

Para nosso estudo, o protocolo foi modificado em relação ao tempo de coloração vermelha do Congo para ver, o que pode ter impacto em tempos de coloração mais curtos na coloração imunohistoquímica subsequente. Seções com espessura de 2 e 4 μm também foram testadas.

Coloração imunohistoquímica e bloqueio endógeno de peroxidase

As condições de coloração imunohistoquímica para os vários subtipos de amilóide estão listadas na tabela 2. Como sugerido pelo fabricante, dois clones diferentes foram usados para a detecção das cadeias de luz amilóide kappa e lambda, respectivamente. A imunohistoquímica foi realizada após o procedimento de coloração vermelha do Congo. Brevemente, lâminas desparafinizadas e bloqueadas com peroxidase endógena (ver mais tarde) foram incubadas em cavalo normal (para coloração amilóide AA) ou soro de cabra normal (para todas as outras colorações)/soro fisiológico com TBS (900 μl soro/60 ml TBS) durante 30 min à temperatura ambiente (ambos os soros do Vector Lab., Burlingame, Califórnia, EUA) e depois incubado durante a noite com o anticorpo primário a 4°C, enxaguado e incubado com solução anti-rato biotinilada IgG (para coloração amilóide AA) ou biotinilada IgG (para todos os outros procedimentos de coloração) (300 μl IgG/900 μl soro normal de cavalo ou cabra/60 ml de TBS; ambos IgG formam Vector Lab.) durante 30 min à temperatura ambiente; finalmente, foram enxaguados e incubados com um kit avidina-biotina-peroxidase (Vectastain do Vector Lab.) durante 30 min e visualizados aplicando 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC; de Dako, Glostrup, Dinamarca) como cromogénio (10-20 min sob controlo óptico instantâneo) e hematoxilina de Meyer (de Medite, Dietikon, Suíça). O AEC foi preferido desde experimentos anteriores que mostraram melhores resultados sinal-ruído para a visualização do AEC em comparação com a visualização da diaminobenzidina. Como o AEC é solúvel em água e álcool, as lâminas foram cobertas com Medi-Mount (de Medite, Burgdorf, Alemanha) durante 30 minutos antes da laminagem.

Desde o tratamento habitual para o bloqueio endógeno da peroxidase dos tecidos (solução de 3% H2O2 em etanol a 70%) após completar a coloração vermelha do Congo levou à perda de congofilia, Foram testados outros métodos para o bloqueio endógeno da peroxidase, como por exemplo: movendo esta etapa antes da coloração vermelha do Congo e a substituição de 70% de etanol por água destilada.

Avaliação

Os cortes de coloração dupla Congo red/imunohistoquímica foram primeiramente avaliados usando um microscópio de luz convencional para estimar se o respectivo produto imunohistoquímico cromogênico foi visualizado como esperado, pior ou melhor comparado com a coloração de rotina diagnóstica (sem a coloração vermelha do Congo). Posteriormente, um microscópio de fluorescência com filtro de rodamina (Zeiss Axioskop 40; Zeiss, Göttingen, Alemanha) foi usado para avaliar a fluorescência do corante vermelho Congo. Áreas que mostraram uma fluorescência intensiva específica foram ainda avaliadas por microscopia de luz para ver se depósitos amilóides também podiam ser detectados por imunohistoquímica nessas áreas.

Resultados

Passo 1: Modificações do Protocolo de Coloração Vermelha do Congo

Tempos de coloração Several para o corante vermelho do Congo foram testados. Isto foi necessário uma vez que a capacidade dos anticorpos para ligar antígenos foi reduzida pelo procedimento de coloração vermelha do Congo e a intensidade total do vermelho Congo tornou a avaliação concomitante difícil, uma vez que um cromogénio vermelho (AEC) com uma cor semelhante à do vermelho Congo foi usado para imuno-histoquímica. Aplicando o tempo de coloração original de 30 min, a birefringência pôde ser detectada para depósitos amilóides usando um filtro polarizado em microscopia convencional de luz. Quando a coloração para o vermelho Congo durou apenas 5, 10 ou 20 s, sinais positivos sempre puderam ser detectados quando se utilizou o filtro de rodamina de um microscópio de fluorescência, enquanto a microscopia convencional só ocasionalmente mostrou congofilia e birefringência utilizando o filtro polarizado (fig. 1). Para análises posteriores, o tempo de coloração vermelha do Congo foi preferencialmente reduzido para 10 s para evitar coloração excessiva; 10 s foi escolhido por razões de praticabilidade (mais fácil de cumprir em relação a 5 s) no laboratório húmido.

Passo 2: Modificações dos Protocolos Imunohistoquímicos para Combinação da Coloração Congo Red e Imunohistoquímica em Uma Lâmina

Num primeiro passo, a coloração imunohistoquímica foi realizada em cortes separados para confirmar a antigenicidade dos tecidos utilizados para este estudo, que mostrou resultados satisfatórios de coloração usando os protocolos de rotina estabelecidos, conforme detalhado no quadro 2.

Ao combinar a coloração vermelha do Congo (tempo de coloração vermelha do Congo de 10 s) com a coloração imunohistoquímica nos mesmos cortes, notou-se que a congofilia desapareceu após completar os procedimentos imunohistoquímicos utilizando o tratamento comum para o bloqueio endógeno da peroxidase dos tecidos (solução de 3% H2O2 em etanol a 70%) desde que o corante vermelho do Congo foi lavado. Portanto, numa terceira etapa, o tratamento para o bloqueio endógeno da peroxidase foi modificado. O bloqueio endógeno da peroxidase utilizando o método convencional, mas aplicando-o antes da coloração vermelha do Congo, bem como a substituição do etanol a 70% por água destilada, ao realizar o bloqueio endógeno da peroxidase após a coloração vermelha do Congo, levou a resultados satisfatórios, tanto para a avaliação da coloração vermelha do Congo como para a coloração imunohistoquímica. De forma a manter o fluxo de trabalho habitual do laboratório húmido, o método de substituição do etanol por água destilada foi ainda aplicado. A tentativa de omitir o bloqueio endógeno da peroxidase diminuiu moderadamente os resultados sinal-ruído para a visualização de CEA (assumindo que as enzimas endógenas desbloqueadas utilizaram CEA e, por um lado, ligeiramente manchadas de fundo e, por outro, privaram o complexo ABC-peroxidase do cromogênio para uma visualização adequada) e, portanto, não foi mais explorado. A qualidade da coloração imunohistoquímica após a coloração com vermelho Congo foi a mesma da coloração imunohistoquímica sem coloração prévia com vermelho Congo; assim, concluímos que a realização de imunohistoquímica em cortes prescritos com vermelho Congo durante 10 s não leva a perda de antigenicidade ou a resultados de coloração inespecíficos.

Passo 3: Modificações das espessuras de secção

Finalmente, examinamos o papel de diferentes espessuras de secção (2 e 4 μm). Em geral, a especificidade e a avaliação da coloração imunohistoquímica (relação sinal/ruído) foi melhor nos cortes mais finos; além disso, houve menos artefatos em relação ao descolamento do tecido das lâminas durante os procedimentos de coloração. Todos os casos apresentaram os mesmos resultados obtidos durante a subtipagem diagnóstica inicial dos depósitos amilóides.

Exemplos de Implementação da Abordagem Descrita em Procedimentos Diagnósticos de Rotina

Figuras 2 e 3 ilustram dois casos de rotina, nos quais a subtipização amilóide pôde ser realizada utilizando o novo algoritmo proposto neste estudo; aplicando apenas a técnica convencional, não foram obtidos resultados interpretáveis.

Discussão

Aqui, apresentamos e validamos um procedimento combinado de dupla coloração vermelho/imunohistoquímica do Congo, que permite focalizar as áreas vermelho-positivas do Congo ao avaliar a imunohistoquímica, melhorando assim a especificidade da subtipização amilóide in situ. Também ajuda a poupar tecido, o que é um problema à medida que o material de biópsia se torna cada vez mais limitado devido à mudança de abordagens diagnósticas utilizando núcleos de agulha fina e forcipes de biópsia.

Em contraste com outras técnicas de avaliação propostas com foco na avaliação de imagens digitalizadas sofisticadas, nossa abordagem pode ser facilmente incorporada ao diagnóstico de rotina. Os pré-requisitos incluem apenas a modificação da coloração vermelha estabelecida do Congo, a imunohistoquímica amilóide disponível, bem como um microscópio de fluorescência com um filtro de rodamina. Idealmente, devem ser usados microscópios equipados tanto para microscopia de fluorescência quanto para microscopia de luz convencional, pois isso simplifica o processo de verificação nas mesmas áreas (fluorescentes) de interesse da deposição amilóide ao avaliar a imunohistoquímica por meio de um simples interruptor de fonte de luz e filtro. No entanto, dois microscópios diferentes também poderiam ser usados, mas em casos difíceis, a obtenção de uma foto das respectivas áreas em microscopia de fluorescência e luz poderia ser sugerida para facilitar a avaliação.

Em concordância com estudos anteriores, poderíamos mostrar que o vermelho Congo não interfere ou perturba a imunohistoquímica. Além disso, em comparação com as espessuras de secção de 4-6 μm utilizadas na maioria dos estudos até agora, poderíamos demonstrar que a utilização de secções mais finas de 2 μm, que são vantajosas para a imunohistoquímica (melhor relação sinal/ruído, menos artefactos de descolamento), também pode levar a resultados satisfatórios em relação à coloração vermelha do Congo, se lida por um microscópio fluorescente.

Existiram vários trabalhos recentes propagando o uso da fluorescência para avaliação de depósitos amilóides e demonstrando sua superioridade sobre a microscopia de luz polarizada por ser mais específica e mais sensível . Neste estudo, refinamos e otimizamos esta abordagem de diversas maneiras, trabalhando em um protocolo adaptado em relação ao tempo de coloração, procedimentos de coloração, bem como espessura de seção. Essas mudanças finalmente permitiram realizar uma coloração dupla in situ tanto para a detecção de depósitos amilóides sensíveis e específicos quanto para a subtipização desses depósitos, o que é crucial para distinguir a doença subjacente que leva aos depósitos amilóides. Nossa abordagem de dupla coloração não só permite detectar sensivelmente a amilóide por fluorescência e, ao mesmo tempo, categorizar especificamente esses depósitos, mas também para poupar material evitando seções em série, nas quais os depósitos de amilóide, por vezes minúsculos, podem já ter sido cortados. Desde o estabelecimento desta dupla coloração, já utilizamos esta abordagem em vários casos, nos quais não foi possível chegar a um diagnóstico final por outros métodos. As Figuras 2 e 3 ilustram dois destes casos.

No entanto, pode ainda haver espaço para uma perfeição adicional. Como os sistemas de detecção baseados em imunoalcalina-fosfatase que não necessitam de bloqueio endógeno da peroxidase não são actualmente utilizados no nosso fluxo de trabalho imunohistoquímico, a substituição dos sistemas de detecção baseados em imunoperoxidase pelos primeiros pode melhorar ainda mais os resultados e diminuir o fluxo de trabalho do laboratório.

Para concluir, apresentamos uma abordagem optimizada e refinada para a coloração vermelha/imunohistoquímica dupla do Congo. Esta abordagem é benéfica em relação à especificidade, custos e quantidade de tecido necessário. As suas exigências são mínimas e devem permitir uma utilização generalizada.

Avalores

Thomas Menter é apoiado pela Fundação Nuovo-Soldati de Investigação do Cancro, Vaduz, Liechtenstein.

Declaração de Ética

O estudo envolve apenas material humano de arquivo do Instituto de Patologia da Basileia e foi aprovado pelo Comité de Ética da Northwestern and Central Switzerland (EKNZ 2014-252). Nenhum animal foi envolvido.

Declaração de divulgação

Os autores declaram não ter conflitos de interesse.