A Importância de Estratégias Distintas de Busca Alocêntrica e Egocêntrica em Paradigmas de Memória Espacial Hipocampal-Dependente de Roedores: Obtendo mais de seus dados

Memória espacial e paradigmas de navegação

Existe uma grande variedade de testes comportamentais para roedores e humanos que fornecem uma medida de memória espacial e navegação . Geralmente, os testes de memória espacial de roedores utilizam aparelhos de labirinto que têm uma área meta que os animais devem encontrar, aprender e lembrar. Estes objectivos podem ser reforços positivos tais como recompensas alimentares, fugas de estímulos negativos tais como água ou luz brilhante ou um resultado de comportamento instintivo tal como impulso exploratório. Os testes de memória espacial humana, por outro lado, são realizados principalmente em configurações de realidade virtual que criam ambientes tridimensionais controlados com objetivos geralmente explicados ao sujeito pelo pesquisador. Mais recentemente, foram tomadas medidas para combinar aspectos de testes em animais e humanos para aumentar a similaridade e, portanto, a translatabilidade desses testes. Versões de testes de realidade virtual de roedores foram desenvolvidas para humanos , e configurações de realidade virtual e tela tátil para roedores que foram desenvolvidas a partir de equivalentes humanos também se tornaram populares . Distinguindo quadros de referência alocêntricos e egocêntricos e estratégias de busca utilizadas em tarefas de memória espacial para roedores, difere dependendo do tipo de teste. Algumas tarefas são concebidas para encorajar o emprego de uma única estratégia, e assim o desempenho nessa tarefa é reflexo da saliência desse quadro de referência particular. Outras tarefas podem ser completadas com uma combinação de estratégias alocêntricas e egocêntricas, e análises subsequentes ou testes de sonda são necessários para inferir déficits ou preferências nesses quadros de referência. Consideração dos tipos de navegação espacial que estão sendo testados, e passos extras para dissociar essas estratégias são frequentemente negligenciados, apesar da relativa facilidade de implementação de tais medidas. Abaixo discutimos os aparelhos populares de labirinto usados para investigar a memória espacial e vários testes, controles e análises que podem ajudar a distinguir navegação egocêntrica e alocêntrica.

A memória espacial pode ser investigada através de uma variedade de testes em labirintos como o labirinto Y, labirinto de queijos, labirinto de água Morris, labirinto estrelado, labirinto de Barnes, labirinto de braços radiais e labirinto T. Estes labirintos abrangem a investigação de uma série de memórias espaciais, incluindo a memória de longo, curto prazo e de trabalho, assim como a flexibilidade cognitiva. Testes que sondam quadros de referência alocêntricos incluem o uso de pistas visuais estáticas que o roedor pode usar para desenvolver um mapa cognitivo. São feitos esforços para minimizar as sugestões proximais e criar espaços abertos e desobstruídos para evitar estratégias não-alocêntricas. O oposto é verdadeiro para tarefas egocêntricas onde as sugestões visuais são minimizadas ou tornadas irrelevantes (incorrectas ou aleatórias). A forma mais precisa de testar estratégias egocêntricas é realizar um teste no escuro, o que garante a remoção de tacos distais visuais que poderiam ser usados para estratégias alocêntricas. Muitos aparelhos que são usados para investigar a navegação egocêntrica restringem os movimentos a canais estreitos ou braços para criar pontos de escolha distintos onde estratégias egocêntricas são encorajadas .

Construído na forma de um ‘T’ capitalizado, o T-maze(Figura 2A) é um aparelho simples usado para sondar trabalho e memória espacial de curto prazo. Devido à forma do labirinto, apenas duas opções, uma curva de 90 graus à esquerda ou à direita, estão disponíveis para o roedor ao deixar o braço inicial. O T-maze pode ser desprotegido, iscado ou usar estímulos negativos para conduzir a exploração do labirinto. Geralmente, um dos braços é correto (inexplorado, alimento/água recompensado, contendo plataforma de fuga) e é aprendido na presença de memória intacta. Tacos visuais internos e externos podem ser usados para sondar a estratégia de navegação . Em resumo, os animais podem ser treinados com a presença de sinais visuais extra-maze e um sinal visual intra-maze. Atingir o braço da meta pode ser alcançado lembrando-se de virar na direção correta, mover-se para ou evitar a taco intra-maze ou mover-se para a área correta em relação às tacas externas estáticas. Após a aquisição bem sucedida da tarefa, os animais podem ser testados em testes de sondas que envolvem a troca sistemática das tacas ou a direção correta da volta, de modo que agora elas estejam incorretas. De facto, foi demonstrado que os ratos têm uma preferência geral por uma estratégia baseada na direcção no T-maze, sugerindo que este aparelho encoraja a navegação egocêntrica . Usando manipulações visuais semelhantes de tacos no T-maze, foi demonstrado que ratos transgênicos expressando uma mutação relacionada à doença de Alzheimer têm déficits específicos de aprendizagem do local alocêntrico na ausência de uma interrupção geral na aprendizagem e memória, destacando a importância de incluir estes testes de sonda quando possível .

O Y-maze (Figura 2B) funciona muito da mesma forma que um T-maze; entretanto, o aparelho é projetado em forma de Y com três braços iguais a 120 graus um do outro. Testes não testados são populares neste aparelho, confiando na preferência inata do animal para explorar áreas previamente inexploradas. A memória a curto prazo pode ser testada bloqueando o acesso a um dos braços na primeira fase do teste e observando o tempo gasto nesse braço na segunda fase, onde os três braços podem ser acessados. Há um atraso variável entre as fases para controlar a carga de memória de curto prazo da tarefa. Esta nova tarefa de preferência de braço é um teste de alocação de memória espacial, uma vez que os roedores usam tacos intra e extra-maze para se lembrarem da localização do novo braço. A memória de trabalho também pode ser testada permitindo que o animal explore livremente os três braços e observando se eles optaram por entrar no braço mais recentemente explorado ou se eles se alternam e entram no braço mais novo – isso é chamado de alternância espontânea. A alternância espontânea também pode ser investigada no braço T; entretanto, como os braços do braço Y são iguais (e cada um pode se tornar um novo braço inicial), a alternância pode ser continuamente medida sem a constante interação do investigador. A modificação do protocolo para incluir braços iscados e incluir ou remover o uso de tacos proximais e distais permite a investigação de estratégias alocêntricas e egocêntricas .

O labirinto de água de Biel foi desenvolvido por William Biel e é construído de múltiplos labirintos em T que se interligam para criar um labirinto no qual os roedores devem navegar do ‘Start’ para o ‘Goal’ para escapar do labirinto. O labirinto é executado à luz visível, e não são fornecidas indicações distais explícitas; além disso, o labirinto é coberto por um grande recipiente para minimizar o acesso às indicações distais e proximais. Os parâmetros que são usados para medir a navegação egocêntrica incluem erros através de tentativas e latência de fuga. No entanto, este labirinto tinha limitações no design e nível de dificuldade, o mais importante é que ele era executado em luz visível, o que poderia fornecer tacos distais ou proximais a partir da caixa sobreposta. O labirinto de água de Cincinnati (CWM) é uma extensão do labirinto de água de Biel. É um labirinto de água labirinto complexo, que consiste em nove labirintos de água em T interligados (Figura 3). Um roedor experimental deve passar da posição A para a posição B e é motivado pelo seu instinto de sobrevivência para deixar a água. Ele é projetado para empregar estratégias de busca egocêntricas baseadas nas dimensões físicas e no desenho do labirinto que cria nove pontos de escolha (ao invés de seis no labirinto de água de Biel) em interseções onde roedores são necessários para fazer uma curva à esquerda ou à direita. O CWM é construído usando um material acrílico para que as paredes sejam lisas, e não há tacos proximais disponíveis. A largura dos canais assegura que o roedor não possa escalar as paredes do labirinto, e a realização do teste no escuro sob luz infravermelha pode funcionar como um duplo seguro contra o uso de tacos visuais . Geralmente, o número de erros, o número de retorno de partida e a latência de fuga são os principais parâmetros reportados para este labirinto.

O labirinto de braços radiais (RAM) consiste em uma área circular central da qual vários braços irradiam para fora. A memória espacial roedora é medida pela capacidade de lembrar a localização dos braços iscados através do uso de sinais salientes em torno da sala do labirinto (alocêntrico) ou um paradigma egocêntrico que emprega a entrada forçada de braços. Segue-se um exemplo de um paradigma egocêntrico que utiliza a RAM. Neste caso o labirinto tem portas automatizadas que abrem e fecham para permitir a entrada do animal. O animal começa em um braço, e uma vez iniciada a experiência, dois braços adjacentes ao braço inicial são abertos para construir uma forma em Y. Haverá uma recompensa alimentar no final de um braço, determinada para que cada rato seja ou esquerdo ou direito. O braço do labirinto introduzido pelo animal torna-se o novo braço inicial, ao qual o animal fica restrito durante um intervalo entre os ensaios. Depois de um intervalo de intertrial, dois braços adjacentes ao novo braço inicial são abertos, sendo a direção do braço (esquerda ou direita) correta com uma recompensa alimentar. A experiência continua desta forma e requer que o animal navegue no labirinto em referência à sua própria posição. Ao limitar o acesso a apenas três braços (além do braço de partida original) de cada vez, isto assegura contra uma estratégia não egocêntrica a ser usada pelo animal. Por exemplo, se todos os braços da RAM estivessem disponíveis, o animal poderia usar a estratégia em série de entrar em cada braço sequencialmente, a fim de encontrar a recompensa alimentar. Para a RAM, medidas como o número de erros e a classificação do primeiro erro são relatadas para indicar o desempenho da memória. Enquanto a RAM pode ser usada para investigar tanto estratégias de busca egocêntrica quanto alocacional, o labirinto de água Morris sem braço tornou-se o padrão para testes alocêntricos , com a água aberta opaca atuando como uma máscara para ambos os pontos de escolha para aprender uma seqüência definida, e olfato. Em contraste com os desenhos armados de testes egocêntricos, labirintos que visam estratégias espaciais alocêntricas são projetados para serem abertos e livres de objetos/edges intra-maze que podem atuar como pontos de escolha .

Os labirintos de Barnes baseados na preferência por espaços escuros e fechados por roedores. É um labirinto circular aberto com furos ao redor do perímetro (Figura 4). Por baixo de um destes furos está a baliza da ‘caixa de destino’, que proporciona um pequeno espaço fechado para o roedor. Durante o teste o labirinto é inundado por luzes brilhantes, sons e/ou jatos de ar para proporcionar motivação para encontrar a meta. Tacos distantes são fornecidos ao redor da sala para ajudar o roedor a navegar. Número de erros, latência de fuga e estratégias de busca são comumente relatados como uma medida de desempenho da memória espacial . Manipulações visuais de tacos no labirinto de Barnes mostram que tacos distais são mais salientes que tacos proximais, com animais treinados sem tacos distais (com um marcador no local da baliza) mostrando um desempenho diminuído . Assim, esta tarefa tende a encorajar estratégias alocêntricas.

O labirinto de água Morris (MWM)tem sido parte integrante da pesquisa em neurociência como padrão ouro ao testar a memória espacial em roedores desde sua introdução (Morris et al. ). O MWM utiliza uma piscina grande e circular com água opaca e uma plataforma de escape oculta (Figura 5A). Múltiplos tacos distais são colocados ao redor do labirinto para ajudar o roedor a alcançar a plataforma escondida que ele usa para escapar. A maioria dos protocolos são realizados durante vários dias, com várias tentativas por dia, e enquanto a posição da plataforma oculta permanece a mesma, a posição inicial do animal de pesquisa é frequentemente alterada para minimizar estratégias egocêntricas. Entretanto, se a localização inicial for mantida consistente, e o teste for realizado no escuro sem pistas externas, os roedores podem completar o MWM usando uma estratégia egocêntrica. Após o treinamento, a plataforma de fuga é removida, e a memória de referência é testada. Espera-se que os animais passem uma quantidade maior de tempo no quadrante onde a meta anteriormente estava. A localização da meta também pode ser alterada para investigar a aprendizagem de reversão e a flexibilidade cognitiva. A principal motivação do roedor para navegar no labirinto é escapar da água. A principal vantagem do MWM ao testar estratégias de busca alocêntrica é a remoção de tacos visuais e olfativos intra-maze com o uso de água opaca. De facto, o mascaramento de qualquer taco olfactivo disponível é imperativo devido ao poderoso sentido de olfacto dos roedores e ao uso do olfacto na sua navegação. No entanto, a água no MWM também pode ser uma desvantagem, especialmente quando se trabalha com ratos, pois eles não são nadadores naturais na natureza e ficam estressados na água .

O labirinto de queijos (CBM)(Figura 5B) é uma versão seca do MWM e é similarmente um teste de memória espacial de longo prazo, bem como uma medida de flexibilidade cognitiva. O CBM é uma arena circular uniforme com poços que podem ser salvos. Os poços irradiam em linhas uniformemente a partir do centro da placa. As pistas espaciais são colocadas em torno da CBM. Os roedores são privados de alimentos durante a duração da experiência para proporcionar motivação para encontrar a recompensa alimentar. A localização do poço iscado é diferente para cada animal e é mantida constante durante as experiências e dias para cada rato individual. Os animais devem aprender a usar as pistas espaciais colocadas ao redor do labirinto para encontrar o poço iscado desde a área inicial no centro para receber a recompensa e espera-se que usem estratégias de busca alocêntricas. Após a aquisição da localização da meta, a localização da recompensa alimentar é alterada, e o animal deve então adotar uma nova estratégia de aprendizado (reversão). Esta é uma medida de flexibilidade cognitiva e está testando a capacidade do animal de ignorar a posição inicial da recompensa e aprender a nova localização da segunda recompensa. Em comparação com o MWM que se baseia na motivação de sobrevivência, o CBM baseia-se no impulso da fome. Ambas as tarefas envolvem dicas distais para guiar o rato até ao seu objectivo, quer seja a plataforma do MGM ou a recompensa alimentar do MFC. Estas diferentes motivações podem influenciar o processamento cognitivo dos roedores. O MWM tem sido criticado como excessivamente estressante, com o animal de pesquisa tendo que empregar o aprendizado de evitar a fome. A MFC, embora a privação de alimentos possa fornecer um stress semelhante, envolve um reforço positivo através da recompensa alimentar. Há alguns argumentos de que o reforço positivo pode não ser suficiente para encorajar os animais de pesquisa a aprender, em comparação a um teste como o MWM, onde as consequências negativas devem ser evitadas. Pode ser que cada teste forneça um ângulo diferente para o estudo da cognição. O pânico pode ser prejudicial para uma aprendizagem eficaz ou um impulso mais forte em comparação com a privação de alimentos. A principal vantagem do MWM em termos de provocar estratégias alocativas e egocêntricas é que ele é um labirinto alocativo mais limpo. No MWM, o uso de água opaca pela qual os roedores devem nadar minimiza a disponibilidade de pontos de escolha e de tacos olfactivos. Em comparação, a CBM é um labirinto que requer que os roedores não só naveguem utilizando os tacos distais, mas também em torno dos poços. Assim, os roedores podem incorporar estes poços na sua estratégia de navegação – algo que não pode ser feito no MWM. Isto pode ser uma oportunidade para os roedores empregarem estratégias não-alocêntricas, tais como a estratégia em série. Esta questão da detecção dessas estratégias de busca egocêntrica versus alocêntrica é discutida mais detalhadamente na seção seguinte.

O labirinto estrelado (Figura 6), projetado por Rondi-Reig et al. , é um labirinto de água construído propositadamente que permite a distinção entre estratégias de busca egocêntrica e alocêntrica. É um labirinto de água circular composto por cinco canais de água que formam um pentágono central, e cinco canais de água irradiam deste pentágono. As paredes do labirinto têm uma cor uniforme, e a água torna-se opaca. O objetivo do labirinto é encontrar a plataforma oculta para escapar. Tacos extra-maze nas paredes são disponibilizados quando se analisa a navegação alocêntrica. A configuração deste labirinto permite múltiplos protocolos para testar a navegação alocêntrica ou egocêntrica. O primeiro protocolo, ‘a versão de múltiplas estratégias’, é configurado para investigar a estratégia de navegação espontânea que é empregada pelo roedor. O segundo protocolo investiga a navegação egocêntrica configurando o labirinto para que uma seqüência de movimentos de direção envie o roedor para a plataforma de fuga. O protocolo final exige que os roedores utilizem as pistas espaciais fornecidas para escapar dos pontos de partida atribuídos aleatoriamente . Este labirinto é uma grande configuração pois permite a elucidação de estratégias individuais de busca, e dado que é um labirinto de água, ele controla para igual motivação e oportunidade .