ADAR
C Enzyme-Substrate Recognition
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Sabe-se pouco sobre como os ADARs interagem com seus substratos específicos e como os domínios de ligação do RNA e o domínio catalítico trabalham juntos durante a reação de edição. Em contraste com a maquinaria de edição de RNA C-to-U que emprega um motivo de sequência primária próximo ao local de edição como determinante crítico para o reconhecimento do substrato (Niswender, 1998), as enzimas ADAR carecem de qualquer especificidade de sequência intrínseca aparente. Na verdade, quando apresentadas com moléculas de RNA completamente de cadeia dupla, ADAR1 bem como ADAR2 irão deaminar quase de forma promíscua até 50-60% de todas as adenosinas na sequência (Nishikura, 2010). No entanto, a presença de loops, desajustes e inchaços dentro de uma estrutura de substrato de RNA aumenta a seletividade do local e, como visto para alguns alvos fisiológicos ADAR, a intrincada dobra de RNA de tal substrato parece restringir o acesso para ligação ao RNA e catálise produtiva frequentemente a uma única adenosina (Nishikura, 2010). Portanto, a maior parte da especificidade do alvo da edição A-to-I pode residir dentro da dobra tridimensional do substrato. Entretanto, estudos estruturais recentes baseados em NMR de domínios de ligação do RNA da proteína ADAR em complexos com substratos mínimos de RNA indicam que domínios individuais de ligação do dsRNA também podem estar envolvidos em contatos específicos de seqüência que poderiam contribuir para a seletividade de certos alvos de RNA sobre outros (Stefl et al, 2006, 2011).
Uma outra propriedade dos ADARs que pode ter implicações no reconhecimento e interação do substrato é a percepção de que para a desaminação produtiva e de alta atividade, as proteínas ADAR estão formando um dímero no substrato (Jaikaran et al., 2002; Cho et al., 2003; Gallo et al., 2003; Poulsen et al., 2006). Potencialmente, tanto homo- como heterodímeros entre as proteínas ADAR podem se formar (Chilibeck et al., 2006) e, portanto, representar outra camada de regulação influenciando o reconhecimento específico do substrato, bem como a atividade de edição do RNA. Como até o momento não há nenhum alvo conhecido de edição para ADAR3 e esta proteína não apresenta nenhuma atividade enzimática nos ensaios padrão de deaminase (Melcher et al., 1996a; Chen et al., 2000), seu papel tem sido sugerido como sendo de natureza regulatória através da heterodimerização com os outros ADARs.
Relacionado à formação de dímeros ADAR para atividade geral de edição é a observação de que certos eventos de edição de RNA que ocorrem dentro do mesmo substrato exibem acoplamento positivo ou negativo. Por exemplo, adenosinas diretamente vizinhas umas das outras ou aquelas localizadas no mesmo lado da estrutura duplex do RNA (cerca de 11 nt de distância dentro do RNA da forma A) freqüentemente mostram acoplamento em edição por ADARs provavelmente devido à sua proximidade do local catalítico da enzima no espaço (Koeris et al., 2005; Enstero et al., 2009).
Embora essas percepções, ainda não é possível prever atualmente um local de edição de RNA baseado na seqüência primária do RNA. Isto se deve principalmente à natureza complexa das estruturas terciárias de RNA e ao seu comportamento dinâmico. Mesmo considerando que os domínios vinculados ao dsRNA podem ser capazes de discriminar certos motivos de seqüência primária sobre outros, pequenas alterações na seqüência primária circundante ou na estrutura secundária e terciária podem modular ou mesmo anular os contatos específicos da seqüência. Como resultado, tentativas de conceber algoritmos de busca combinando várias das características moleculares (incluindo probabilidade de emparelhamento de bases, ambiente de seqüência, conservação de seqüência) que são conhecidas por influenciar a probabilidade de edição ou atividade, a fim de prever potenciais locais de edição, resultaram em longas listas de posições candidatas em mRNAs, mas poucos locais novos, locais seletivos e de modificação de alto nível foram validados como alvos in vivo de boa fé (Clutterbuck et al., 2005; Levanon et al., 2005; Gommans et al., 2008; Sie e Maas, 2009). A dicotomia entre a detecção de milhares de prováveis locais de edição baseados em características moleculares em pré-mRNAs e a escassez de locais de recodificação de alto nível sugere que ou os algoritmos de previsão sofrem de uma alta taxa de falsos positivos e a maioria dessas posições candidatas não são editadas por ADARs, ou a detecção experimental de edição de RNA é o problema e para muitos locais de edição real os tecidos errados são testados (edição específica do tipo célula) ou são testados no ponto errado (edição regulada). Alternativamente, os níveis de edição in vivo da maioria dos sites são tão pequenos que os métodos de detecção atuais não são suficientemente sensíveis para provar ou refutar a edição.