Alcalóides esporfinos de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
ARTIGO
Alcalóides esporfinos de Ocotea macrophylla (Lauraceae)
Ludy Cristina Pabon*; Luis Enrique Cuca
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Bogotá, KR 30 45 03, Colômbia. AA 14490
ABSTRACT
Quatro alcalóides aporfinos da madeira de Ocotea macrophylla (Lauraceae) foram isolados e caracterizados como (S)-3-methoxy-nordomesticine (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-3-metoxi-nordoméstico (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordoméstico (3) e (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordoméstico (4); alcaloides 2-4 estão sendo relatados pela primeira vez. A estrutura dos compostos isolados foi determinada com base nos seus dados espectrais e por comparação dos seus dados espectrais com os valores descritos na literatura. A fração alcaloide e o composto 1 mostraram atividade antifúngica contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici e também o composto 1 mostrou atividade antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis também.
Keywords: Ocotea macrophylla; alcalóides aporfinos; Lauraceae.
INTRODUÇÃO
O gênero Ocotea (Lauraceae) inclui mais de 350 espécies encontradas no continente americano e na África Austral.1,2 Na Colômbia, existem 35 espécies de Ocotea distribuídas por todo o país, principalmente nas florestas andinas.3 Na medicina tradicional, algumas espécies de Ocotea mostraram aplicações diferentes. O. quixos é usado como desinfetante, anestésico local e antidiarréico.4 O. lancifolia é usado como antiparasitário, e O. caparrapi é usado para tratar picadas de insetos, picadas de cobras, bronquite e tumores cancerígenos.5,6
Quimicamente, o gênero Ocotea é conhecido principalmente como fonte de metabólitos tipo furofuran7 e tetrahidrofuran lignans,8 bicyclooctane9 e benzofuran neolignans,10 e benzylisoquinoline11 e alcalóides aporfina.5 Em estudos anteriores, quatro alcalóides aporfinos da madeira de Ocotea macrophylla foram isolados e identificados como nantenina, glaucina, isocoridina e desidronantenina.12,13 Neste trabalho, descrevemos o isolamento e determinação estrutural de três novos alcalóides aporfínicos 2-4 além de (S)-3-metoxina-não doméstico 1 e os relatos das atividades antibacterianas e antifúngicas dos compostos.
RESULTA E DISCUSSÃO
O extrato etílico do caule de O. macrophylla foi submetido a uma extração ácido-base para obtenção de uma fração alcalóide, que foi posteriormente submetida a fracionamento e purificação por métodos cromatográficos, levando ao isolamento de quatro alcalóides: (S)-3-metoxi-nord domesticina (1), (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxi-3-metoxi-nordomesticina (2), (S)-N-formil-3-metoxi-nordomesticina (3) e (S)-N-metoxicarbonil-3-metoxi-nordomesticina (4). As estruturas dos alcalóides 1-4 são mostradas na Figura 1 e os dados espectroscópicos na Tabela 1.
O sinal em δH 6.30 (1H, s) não mostrou conectividade no experimento HMQC, indicativo da presença de um grupo OH fenólico, suportado por IR. A análise do espectro HMBC permitiu a localização de substitutos, de acordo com as correlações observadas entre os sinais em δH 5,94 e 5,95 (para o grupo metilenodioxi) com os sinais em δC 145,9 (C-9) e 146.2 (C-10), e estes dois últimos sinais com os prótons em δH 6,70 (H-8) e 7,90 (H-11), respectivamente, sugerindo a presença de um grupo metilenodioxi nas posições 9 e 10 e dois hidrogênios no anel aromático em uma orientação para. A presença do grupo hidroxila na posição 1, foi determinada usando correlações entre os sinais em δH 6.30 e δC 116.5, atribuídos ao C-11b. A localização dos grupos metoxil nas posições C-2 e C-3, foram atribuídas de acordo com a correlação dos hidrogênios em δH 3,96 e 3,86 com os carbonos em δC 138,4 (C-2) e δC 147,8 (C-3), respectivamente.
A configuração absoluta de C-6a foi atribuída como S, pois tem um efeito Algodão negativo a 280 nm e um efeito Algodão positivo a 240 nm na curva CD.17 Adicionalmente, isto foi confirmado pelo valor positivo de rotação óptica 25D = +51,7 (c 0,38, CHCl3).18 Portanto, o alcaloide 1 foi determinado como (S)-3-methoxy-nordomesticine, um alcaloide aporfino relatado anteriormente de Nectandra sinuata19 também pertencente à família Lauraceae. Este relatório corrige e completa dados espectroscópicos para este composto.
Alkaloid 2 foi obtido como um óleo amarelo que dá uma reação positiva ao reagente Dragendorff e seu valor de rotação óptica foi 25D 25D = +33,3 (c 0,60, CHCl3). O espectro UV e IR de 2 foram semelhantes aos de 1, exceto pelo aparecimento, em ambos os espectros, de absorções devidas a um grupo carbamato a 282 nm e a 1688 cm-1, respectivamente.20 Os espectros 1H e 13C NMR mostraram um perfil semelhante a 1. No 1H NMR apareceram dois novos sinais em δH 4,29 (2H, m) e 1,29 (3H, m), bem como o deslocamento do sinal H-5, devido à presença de um grupo desprotegido na proximidade. O experimento COSY mostrou a correlação dos sinais δH 4.29 e 1.29, que indicam a presença de um grupo etílico que, devido ao seu deslocamento, sugeriu estar ligado a uma heteroatomácea. Os espectros 13C NMR e DEPT mostraram o aparecimento de três novos sinais em δC 158,8 (C), 61,0 (CH2) e 14,8 (CH3), sinais típicos de um grupo etoxicarbonilo ligado a um átomo de nitrogênio. A configuração absoluta de C-6a foi determinada como S, pois mostrou os mesmos efeitos do algodão como 1. Portanto, o composto alcalóide 2 foi identificado como (S)-N-etoxicarbonil-3-metoxicarbonil-3-methoxy-nord domesticina. Seu espectro ESIMS deu um pico iônico pseudomolecular a m/z 414 + correspondente à fórmula molecular de C22H22NO7, e as fragmentações foram devidas à perda de CH3OH e CH3CH2OH a m/z 382 + e m/z 368 +, respectivamente. O espectro ESI do modo iônico negativo apresentou picos em m/z 412 – e m/z 383 ., sendo o último a perda de um grupo etílico. Este tipo de alcalóides com substitutos N-etoxicarbonilo foram isolados de Lindera angustifolia (Lauraceae).21
Alcalóide 3, foi obtido como óleo amarelo, com um valor de rotação óptica de 25D 25D = +7,5 (c 0,53 CHCl3). O espectro IR foi semelhante ao dos alcalóides 1 e 2. Adicionalmente, observou-se a presença de absorções a 2830, 2700, 1739 cm-1, característica para o grupo formil. No modo HRESIMS negativo foi observado o íon pseudomolecular – em m/z 369.1133, correspondente à fórmula molecular de C20H20NO6. O modo de íon negativo dos espectros ESI-MS mostrou a perda de um grupo formil a m/z 339 … O perfil da RMN foi semelhante aos dos alcalóides 1 e 2. No 1H NMR apareceram sinais diferentes pertencentes a uma mistura de dois isômeros na razão 3:1. A comparação do isômero maior com o alcalóide 1 na RMN, mostrou o mesmo padrão de substituição do anel aromático, além do aparecimento de dois novos sinais em δH 8,25 (1H, s) no 1H e em δC 161,9 no 13C do grupo formil a 3. Esta funcionalidade sobre o nitrogênio levou à formação de isômeros rotacionais, que foram descritos anteriormente para os alcalóides com um grupo N-formil e N-acetil.22 A configuração absoluta foi determinada como S, da mesma forma que para 1 e 2. Portanto, este alcalóide 3 foi identificado como (S)-N-formil-3-metoxi-nordoméstico.
Alquilóide 4 foi obtido como um sólido branco com ponto de fusão de 222-223 ºC (MeOH), e com rotação óptica de 25D 25D = +47,0 (c 0,55 CHCl3). A análise dos dados da RMN de 4 revelou que ela tem o mesmo esqueleto básico de 2, mas tem um éster metílico de acordo com os sinais em δH 3,76 (3H, s) e δC 52,6 para 4 no lugar dos sinais para o grupo etílico em 2. HRESIMS mostrou um íon pseudomolecular – em m/z 398,1233 correspondente à fórmula molecular C22H22NO7. Portanto, o alcalóide 4 foi identificado como (S)-N-methoxicarbonil-3-metoxino-nordoméstico.
A atividade antifúngica foi avaliada através do método de difusão em disco contra Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici,23 um fungo fitopatogênico que afeta os cultivos de tomate, causando enormes perdas para os agricultores. A fração alcalóide foi ativa contra F. oxysporum em 250 μg/μL. A atividade inibitória contra o crescimento dos fungos foi moderada em 5 μg/μL para (S)-3-methoxy-nordomesticine 1, enquanto que os outros alcalóides foram ineficazes, sugerindo que a presença de substitutos de retirada de elétrons no átomo de nitrogênio diminui a atividade antifúngica.
Embora poucos relatórios de avaliação da atividade de aporfinas antifúngicas tenham sido encontrados, estes são ativos contra espécies como a Candida albicans,24,25 mas inativos contra patógenos fúngicos como o herbário Cladosporium.26 Estes resultados são um novo relatório de avaliação da atividade antifúngica destes alcalóides, onde se enfatiza que o tipo de substituintes do nitrogênio das aporfinas tem um efeito sobre a atividade antifúngica que elas apresentam.
A atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de difusão radial relatado por Lerhrer27 contra duas cepas padrão de Gram (+): Staphylococcus aureus 6538 e Enterococcus faecalis 29212 e três Gram (-): Escherichia coli 25922 e Salmonella tiphymurium, estirpes MS7953 e 14028s. O alcaloide 1 (2,5 μg) mostrou atividade antimicrobiana contra as duas bactérias Gram positivas avaliadas com valores de 30 AU como mostrado na Tabela 2.
Foi relatada para a mistura racêmica do composto 3-metoxi-nord domesticina, sua atividade contra E. coli (MIC= 256 μg/mL) e S. aureus (MIC= 512 μg/mL),28 porém neste caso o composto 1 não é ativo contra E. coli.
Simplesmente como na atividade antifúngica, os resultados mostram que a natureza do substituto no nitrogênio influencia a atividade antibacteriana (Tabela 2).
EXPERIMENTAL
Procedimentos gerais
Ponto de fusão foi determinado usando Mel-temp Fisher Johns, Dispositivo de Laboratório. Os espectros UV foram gravados em um espectrômetro Perkin Elmer Lambda 2S e CD em um espectrômetro JASCO J-720. Os espectros IR foram obtidos em um Perkin Elmer FT-IR Panagon 500 series 1000 como uma película fina. As rotações ópticas foram gravadas no polarímetro Schmidt-Haensch. Espectros NMR de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz), assim como espectros 2D (COSY, HMQC e HMBC) foram realizados em um espectrômetro Bruker Avance 400 MHz usando o CDCl3 como referência interna. Os HRMS foram determinados em um espectrômetro de massa Shimadzu LCMS-IT-TOF com ESI em modo íon positivo e modo íon negativo. A cromatografia em coluna (CC) foi realizada com sílica gel (70-230 e 230-400 mesh, Merck), e a cromatografia analítica foi realizada utilizando sílica gel 60 PF254 (0,25 mm).
Material de planta
As hastes de O. macrophylla foram coletadas em julho de 2006 de Nocaima, Colômbia, por W. Delgado. O espécime botânico foi identificado por A. Jara, e um exemplar de voucher (COL-517191), e foi depositado no Herbário Nacional Colombiano da Universidade Nacional da Colômbia, Bogotá, Colômbia.
Extração e isolamento
Caule seco e motorizado (2,0 kg) de Ocotea macrophylla foram extraídos com EtOH por maceração à temperatura ambiente e concentrados em vácuo para obter um extrato (102,6 g). Uma amostra (48,9 g) deste extrato foi solubilizada em água usando ultra-som e acidificada com 5% HCl a pH 2,0. A suspensão ácida foi então filtrada e basificada com NaOH a 20% até pH 8,0, e sucessivamente extraída com clorofórmio. A fração clorofórmio (3,01 g) foi submetida à cromatografia em coluna com sílica gel e eluída com um gradiente de éter de petróleo: AcOiPr (4:6 a 0:10) e AcOiPr:MeOH (10:0 a 0:10), obtendo-se quatro frações (I-IV). A fracção I (347 mg) foi cromatografada repetitivamente por coluna (CC) em sílica gel e eluída com n-hexano:AcOiPr (9:1-8:2), CHCl3, e Tol:AcOiPr 7:3. Isto produziu alcalóides 1 (7 mg) e 2 (4 mg). A fração II (250 mg) foi submetida à cromatografia em coluna em silicagel e eluída com CHCl3:AcOEt (85:15), depois submetida à CC em Sephadex LH-20 (CH3OH) para produzir alcalóide 3 (8 mg). A fração IV (1433 mg) foi purificada por cromatografia de coluna repetitiva em sílica gel usando CH2Cl2:MeOH 97:3 e CH2Cl2 como sistemas de eluição. Finalmente, lavagens sucessivas com MeOH produziram alcalóide 4 (98 mg).
Ensaio antifúngico
F. oxysporum foi obtido da coleção de culturas da Universidade de Cundinamarca (Departamento de Agronomia, Laboratório de Fitopatologia). O PDA foi usado como meio para ensaios de atividade antifúngica. O meio de cultura foi inoculado com 100 μL de uma solução de 105 esporos. As amostras foram preparadas em soluções de diferentes concentrações, correspondendo a 50, 25 e 10 μg/μL da fração alcalóide e 5, 2,5 1,0, 0,5, 0,2 e 0,1 μg/μL dos alcalóides puros. Dez microlitros de amostras foram aplicados sobre os discos de papel filtro e colocados sobre o meio inoculado. As placas foram seladas e deixadas em uma incubadora por 3 dias a 25 °C. As zonas claras surgindo contra um fungo em crescimento indicaram a quantidade mínima de fracção ou alcalóide necessária para inibir o crescimento dos fungos. Foram feitas três réplicas para cada tratamento. Benomil (benzimidazol – 5 μg) foi usado como controle positivo, e acetona serviu como controle negativo.23
Avaliações antifúngicas
Atividade antibacteriana foi avaliada pelo método de difusão radial adaptado da metodologia previamente publicada por Lehrer.27 Os compostos foram avaliados contra duas cepas de Gram (+): Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Streptococcus fecalis ATCC 29212 e três cepas de Gram (-): Escherichia coli ATCC 25922 e Salmonella tiphymurium, ATCC 14028s e Salmonella tiphymurium MS7953. Uma colônia isolada de cada cepa, foi depositada em 3 mL de tripticase de soja (TSB) para as cepas Gram (+) e Luria Broth (LB) para as cepas Gram (-), e foi incubada a 37 °C com agitação, até que os microorganismos estivessem na fase logarítmica. O sobrenadante foi removido e o sedimento obtido foi ressuspenso em tampão fosfato (PBS), seguido de lavagens com PBS e centrifugação. Finalmente, o sedimento foi ressuspenso em PBS e a densidade óptica determinada em 620 nm para calcular o número de UFC (unidades formadoras de colônias) por mililitro. Dispersa um certo volume que contém 4 x 107 UFC em cada prato. O volume medido foi misturado e homogeneizado em 15 mL de agarose fundida a mais ou menos 45 °C. Esta suspensão bacteriana foi servida em placas de petri e deixada para solidificar à temperatura ambiente, após o que foram feitos orifícios de 2 mm de diâmetro com um punção estéril.
As amostras de teste foram preparadas dissolvendo 1 mg do composto puro em 500 μL de DMSO, que são colocados 8 μL da amostra em duplicado e incubados a 37 °C durante 30 min. Após este tempo foi adicionado o meio nutriente, que contém ágar-ágar fundido e TSB, incubado durante 18 h a 37 ºC e depois o diâmetro das zonas de inibição foi medido pela actividade do composto. Os controles positivos utilizados foram diferentes antibióticos, Ampicilina (50 mg/mL), Kanamicina (10 mg/mL) e Tetraciclina (4,12 mg/mL) em uma diluição de 1:100 em PBS e foi usado como controle negativo DMSO e PBS, cada controle 8 μL ser servido por cada poço. Os diâmetros das zonas de inibição foram medidos em milímetros e os resultados foram relatados como unidades de atividade de acordo com a razão que estipula que 1 Unidade de Ação (UA) é igual a 0,1 mm da zona de inibição.
MATERIAL SUPLEMENTAR
ACONHECIMENTOS
Os autores gostariam de agradecer à Universidade Nacional da Colômbia pelo seu apoio financeiro para este projeto. Além disso, o Laboratório de Ressonância Magnética Nuclear e o laboratório de espectrometria de massa são reconhecidos por seu apoio no registro dos espectros NMR e HR-ESI-MS, respectivamente. Além disso, os autores agradecem à Universidade Javeriana pelas rotações ópticas, ao FIDIC (Foundation Institute of Inmunology of Colombia) pela gravação dos espectros do CD e especialmente ao Prof. J. M. Lozano pelos ensaios de atividade antibacteriana.
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Recebido em 26/6/09; aceito em 6/11/09; publicado na web em 10/3/10
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